大连市零售猪肉中沙门氏菌的耐药性检测与分析

杜雄伟，张珂琪，李　焱，唐文彦，耿亚娟，王娅君，王佳硕

（1.大连民族大学，辽宁大连　116600；2. 四平市职业技术教育中心，吉林四平　136000）

大连市零售猪肉中沙门氏菌的耐药性检测与分析

杜雄伟1，张珂琪2，李焱1，唐文彦1，耿亚娟1，王娅君1，王佳硕1

（1.大连民族大学，辽宁大连116600；2. 四平市职业技术教育中心，吉林四平136000）

［目的］为了解辽宁省大连市生鲜猪肉中沙门氏菌的污染与耐药情况。［方法］采集该市生鲜猪肉78份，用选择性培养基分离沙门氏菌并划线纯化，通过invA序列对菌株进行鉴定，利用纸片琼脂扩散法（K-B法）检测其对12种抗生素的耐药性。［结果］共得到15株沙门氏菌，检出率为19.23%。分离的沙门氏菌对12种抗生素的耐药率在0～73.3%之间。其中，对硫酸庆大霉素的耐药率最高，为73.3%；对其他抗菌药物的耐药率依次是盐酸诺氟沙星（60%）、氟苯尼考和盐酸环丙沙星（均为53.3%）、阿莫西林（13.3%）、头孢噻吩、头孢噻肟、氨苄西林（均为6.7%），头孢曲松、头孢他啶、氨曲南、亚胺培南（均为0）。共产生10种耐药谱。［结论］大连市开发区的超市和农贸市场沙门氏菌污染率较高，并且沙门氏菌对多种抗生素表现出多重耐药谱，应给予重视。

零售猪肉；沙门氏菌；耐药性

在畜禽养殖过程中，抗生素不仅用于控制和治疗疾病，还常用来提高动物抗病力、促进动物生长等［1］。但是由于有些养殖户滥用抗菌药物，导致细菌耐药现象日益严重、耐药谱越来越广。通过耐药性试验，调查沙门氏菌的耐药谱，为临床医学治疗中抗生素的合理使用提供基础数据，对食品安全具有重要意义。孙晓林等［2］对兰州市肉与肉制品微生物污染状况进行研究，结果表明肉样沙门氏菌检出率为 14%；杨保伟等［3］检测陕西部分地区食品中沙门氏菌污染情况，结果表明沙门氏菌在猪肉中检出率为19.4%；洪文展等［4］发现深圳市售肉品沙门氏菌污染率为26.2%。本研究通过对辽宁省大连市猪源性沙门氏菌进行分离鉴定，对12种抗生素进行药敏性分析，旨在了解该地区沙门氏菌污染和耐药情况，为确保食品安全奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株。采集辽宁省大连市开发区各大超市和农贸市场的新鲜猪肉样品78份。从这些样品中共分离到15株沙门氏菌。耐药性检测质控菌株为E.coilATCC25922。

1.1.2培养基及试剂。SS琼脂培养基、水解酪蛋白（mueller-hinton，MH）液、固培养基购于北京奥特星生物有限公司；琼脂糖、Taq DNA 聚合酶、dNTP 及分子质量标准DL2000购于大连宝生物公司。

1.1.3药敏纸片。β-内酰胺类：头孢曲松（CRO，30 µg/片），头孢噻吩（KF，30 µg/片），头孢噻肟（CTX，30 µg/片），头孢他啶（CAE，30 µg/片），氨苄西林（AMP，10 µg/片），氨曲南（ATM，35 µg/片），亚胺培南（IPM，10 µg/片），阿莫西林（AMO，10 µg/片）。氯霉素类：氟苯尼考（FLO，30 µg/片）。氨基糖苷类：硫酸庆大霉素（GEN，10 µg/片）。喹诺酮类：盐酸诺氟沙星（NIA，5 µg/片），盐酸环丙沙星（CH，5 µg/片）。以上12种药敏纸片，购于杭州滨河微生物试剂有限公司。

1.2方法

1.2.1采样。每个采集点采集少量新鲜猪肉，无菌封好后放置于保鲜袋内带回实验室，在无菌条件下，用经酒精灯消毒的镊子和手术刀按编号取少量样本，剪碎后移入装有营养肉汤的试管内，置于摇床中37 ℃培养18～24 h。

1.2.2选择性培养与增菌。经过液体培养后的样品前增菌液经过平板划线接种于SS琼脂培养基，置于（36±1） ℃下倒置培养18～24 h［5］。根据菌落形态，挑取沙门氏菌可疑菌落。将实验待检测菌株与阳性菌株划线接种于SS斜面培养基，37 ℃恒温培养24 h；再从培养基上用灭菌的接种环挑取一环菌落在营养琼脂平板上进行划线，37 ℃恒温条件培养24 h，以分离单菌落。

1.2.3PCR方法。将纯化的单菌落接种于装有灭菌营养肉汤的1 mL EP管中，37 ℃恒温培养18～24 h，12 000 r/min离心培养好的菌液3 min收集菌体，用移液枪吸取200 µL无菌水于EP管内，清洗两次，再加入200 µL的无菌水。在水浴锅内煮10 min，然后在冰块里冷却5 min，最后在10 000 r/min条件下离心5 min。取上清液于1 mL EP管中。扩增基因为invA基因，扩增片段长度为284 bp。PCR扩增体系25 µL， ExTaq酶（5 U/µL）0.25 µL，10×PCR Buffer 2.5 µL，上、下游引物各0.5 µL，dNTPMixture（各2.5 mM）2 µL，模板DNA溶液2.5 µL，ddH2O加至25 µL。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR反应完成后，进行电泳实验。

1.2.4药敏试验。采用纸片琼脂扩散法（K-B法），从平板上挑取单个菌落接种于3 mL MHB［7］，35 ℃培养6～8 h，用生理盐水（0.89% NaCl）校正浓度至0.5麦氏比浊，用无菌拭子蘸取菌液，涂布MHA平板，平板在室温下干燥5 min，用无菌镊子将含药纸片紧贴琼脂表面，35 ℃培养16～18 h，量取抑菌圈直径。大肠埃希氏菌ATCC25922作为质控菌株，参照M100-S20标准［8］判断敏感（S）、中介（I）和耐药（R），根据药敏实验结果，分析病原菌的耐药谱。

2　结果与分析

2.1鲜猪肉样品沙门氏菌的分离鉴定结果

由表1可知，所采集的鲜猪肉样品共分离出15株沙门氏菌，可见大连市开发区的超市和农贸市场沙门氏菌污染率较高，为19.23%。

表1　不同来源样品中中沙门氏菌的分离情况

2.2 猪源沙门氏菌的耐药性

由表2可知，15株沙门氏菌对各种抗生素的耐药率为0～73.3%。其中对GEN的耐药率最高，为73.3%；对其他抗菌药物的耐药率大小依次是NIA（60%）＞PLO、CH（同为53.3%）＞AMO（13.3%）＞KF、CTX、AMP（同为6.7%）；对KF、CTX、AMP的耐药率均为6.7%，敏感性达到70%以上；对CRO、CAE、ATM、IPM的耐药性均为0，敏感性达到90%以上。这些药物对沙门氏菌都有极强的抗菌作用。从抗生素大类来看，耐药率依次是：氨基糖苷类（73.3%）＞喹诺酮类（53.3%～60%）＞氯霉素类（53.3%）＞β-内酰胺类（0～13.3%）。

表2　猪源沙门氏菌耐药率

2.3猪源沙门氏菌多重耐药谱

分离得到的15株沙门氏菌的耐药性情况如表3所示，15株沙门氏菌产生了10种耐药谱，15株沙门氏菌中14株具有耐药性，其中11株至少耐受2种抗生素，8株至少耐受3种抗生素。个别菌株可耐受4种以上抗生素。

表3　沙门氏菌的耐药谱

3　讨论

采集鲜猪肉样品共78份，获得沙门氏菌15株，检出率为19.23%。研究结果表明，大连地区鲜猪肉污染较为严重，沙门氏菌检出率较高，应对市场流通的鲜肉产品引起足够的重视，加强猪肉屠宰、运输、加工、贮存及销售等环节的管理，防止病原菌污染。

猪源沙门氏菌表现出一定的耐药性，对各种抗生素的耐药率在0～73.3%，其中对GEN、NIA、PLO、CH、AMO耐药率最高，依次是73.3%、60%、53.3%、53.3%、13.3%。本项研究分离的15株沙门氏菌共产生10种耐药谱，3耐以上菌株占53.3%。狄文婷等［9］对12株猪源沙门氏菌进行了药敏试验，结果有11株（83.3%）至少可以耐受1种抗菌药物，其中9株（75%）至少耐受4种抗生素。马孟根等［10］对30 株猪源致病性沙门氏菌进行了药敏实验，结果有28 株菌（93.3%）至少对1种药物有耐药性。李郁［11］对合肥市屠宰生猪沙门氏菌耐药性检测，发现74.3%的沙门氏菌对至少1种抗生素产生耐药性，64.7%的菌株为多重耐药。以上结果表明，多重耐药猪肉源沙门氏菌的出现已经成为普遍现象［12-13］，应引起足够重视，注意在肉类食品流通环节中的消毒卫生，以降低此类菌感染人的风险，保证人类的健康。四大类抗生素中，沙门氏菌对β-内酰胺类具有很高的敏感性，说明这些药物对沙门氏菌都有极强的抗菌作用，可作为临床治疗中抗生素的选择依据。

［1］ 万建美，吕林，李素芬，等. 抗生素对肉鸡生长屠宰性能和肉品质的影响［J］. 中国畜牧杂志，2010，46（1）：48-52.

［2］ 孙晓林，许敬东，马军武，等. 兰州市肉与肉制品微生物污染状况的研究［J］. 中国兽医杂志，2008（3）：22-24.

［3］ 杨保伟. 食源性沙门氏菌特性及耐药机制研究［D］. 杨凌：西北农林科技大学，2010.

［4］ 洪文展. 市售肉品沙门氏菌污染状况及防控措施［J］. 肉类卫生，2005（4）：25-26.

［5］ 刘华伟，马立农，郭蔼光，等.畜禽及环境中沙门氏菌的PCR快速检测与控制［J］.家畜生态学报，2005，26（2）：59-62.

［6］ Ranh K，De Grandis S A，Clarke R C，et al. Amplifi cationof an invA gene sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as specific method of detection of Salmonella［J］. Mol Cell Probes，1992，6（4）：271-279.

［7］ 周庭银，倪语星. 临床微生物检验标准化操作［M］. 2版.上海：上海科技出版社，2010：251-252.

［8］ Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing：Twentieth Informational Supplement［M］. Wayne：Clinical and Laboratory Standards Institute，2010：40-48.

［9］ 狄文婷，杜雄伟，吴静，等.猪源沙门氏菌的分离与耐药性分析［J］.江苏农业科学， 2014，42（10）：278-280.

［10］ 马孟根，王红宁，余勇，等. 猪源致病性沙门氏菌耐药基因的分析［J］. 畜牧兽医学报，2006，37（1）：65-70.

［11］ 李郁，焦新安，魏建忠. 屠宰生猪沙门氏菌分离株的血清型和药物感受性分析［J］. 中国人兽共患病学报，2008，24（1）：67-70.

［12］ 谭炳乾. 耐氟喹诺酮类药物猪源致病性沙门氏菌gyrA基因PCRRFLP及序列分析［D］. 雅安：四川农业大学，2002.

［13］ 周晓红，孙明华，徐佩华，等. 生肉制品中沙门菌污染状况及耐药性分析［J］. 中国卫生检验杂志，2010，20（12）：3425-3427.

（责任编辑：杜宪）

Antimicrobial Susceptibility Testing of Salmonella in Retail Pork in Dalian City

Du Xiongwei1，Zhang Keqi2，Li Yan1，Tang Wenyan1，Geng Yajuan1，Wang Yajun1，Wang Jiashuo1
（1. Dalian Nationalities University，Dalian，Liaoning 116600；2. Siping Vocational Education Center，Siping，Jilin 136000）

［Objective］To investigate and understand the contamination situation of Salmonella existed in fresh retail pork in Dalian city，as well as the drug resistance status. ［Methods］78 fresh pork samples in supermarkets were collected，then Salmonellas were isolated and purified by selective medium. After being identified by invA sequence analysis，the drug resistance of these Salmonella isolates to 12 kinds of antibiotics was detected by the disc agar diffusion method（K-B）. ［Results］The results showed that 15 Salmonella isolates were obtained with the detection rate of 19.23%. The resistance rate to antibiotics was in a range from 0 to 73.3%. 73.3% of the isolates were resistant to Gentamycin sulfate，and the resistance rate of other antibiotics decreased in the following order：norfl oxacin hydrochloride（60%）＞Florfenicol、Ciprofl oxacin Monohydrochloride（53.3%）＞Amoxicillin（13.3%）＞Cephalothin、 Cefotaxime、Ampicillin（6.7%）＞Ceftriaxone，Ceftazidime，Aztreonam，Imipenem（0），altogether 10 drug-resistance profiles were found. ［Conclusion］The Salmonella contamination was severe in the supermarkets and farmer's markets in the development zone of Dalian city，which also showed multi-resistant pattern. The results indicated suffi cient attention should be paid attention to the control of Salmonella.

retail pork；Salmonella；drug resistance

S852.61

B

1005-944X（2016）10-0023-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.10.006

大连金州新区科技计划项目（KJCX-ZTPY-2014-0013）；大连市科技计划项目（2014B11NC094）；中央高校自主基金项目（DC2015010020401）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD38B05）