加味柴芍六君方对大鼠胃癌前病变的影响及机制研究

蒋敏玲　江　伟　杨　键　范剑薇

桂林医学院附属医院中医科(桂林541515)



加味柴芍六君方对大鼠胃癌前病变的影响及机制研究

蒋敏玲江伟杨键范剑薇

桂林医学院附属医院中医科(桂林541515)

目的：探讨加味柴芍六君方对胃癌前病变大鼠胃窦黏膜组织的生长及Sky、突变型p53与Survivin蛋白表达的影响。方法：将120只大鼠平均分为6组，采用综合造模法获得胃癌前病变大鼠模型，用药物干预16周后，观察胃窦黏膜组织的生长情况，并用免疫组化法观察胃窦黏膜组织细胞中Sky、突变型p53与Survivin蛋白的表达情况。 结果:药物干预组胃窦黏膜组织腺体萎缩、肠上皮化生及不典型增生的发生率明显较模型对照组低(P< 0.05)；药物干预组胃窦黏膜细胞中Sky的水平显著高于模型对照组(P< 0.05)；药物干预组胃窦黏膜细胞中突变型p53与Survivin蛋白水平明显低于模型对照组(P< 0.05)。 结论:加味柴芍六君方可以从病征和病因两方面抑制或逆转大鼠胃癌前病变的发生发展，具有标本兼治的效果。

胃癌占消化道肿瘤首位，我国属高发区，每年新发现约40万胃癌患者，占世界总发病人数的42%[1]，严重威胁着人民的健康。胃癌的发生是一个多因素、多步骤的渐进性过程，往往要经历多年的胃癌前病变(PLGC)阶段[2]。由于胃癌病因的多样性和复杂性，针对病因的一级预防很难阻止胃癌的发生，而针对PLGC的二级预防则被认为是减少胃癌发生的根本措施。但PLGC的病因、发病机制复杂，涉及到多种发病因素和多条信号通路的紊乱，通过使用化学药物往往无法同时针对多种发病因素和信号通路起作用，达到预防胃癌的作用。而中药往往能针对胃癌前病变的多种病理变化起作用[3]，不仅能改善症状，而且对PLGC会部分逆转，显示出独特的优势。本研究室参考《医宗金鉴》自拟加味柴芍六君方，在临床胃癌前病变中疗效较佳。本研究拟采用综合造模法，应用免疫组化法，考察该药方对PLGC模型大鼠胃窦黏膜组织的生长及Sky、突变型p53与Survivin蛋白表达的影响，揭示其抑制或逆转PLGC发生发展的作用机制，为其临床治疗提供理论依据。

1 材料与仪器1.1 动物 健康雄性Wistar大鼠120只(体重200±20 g)，桂林医学院动物实验中心提供。实验动物许可证：SCXK(桂)2010-0001。

1.2 药物 加味柴芍六君方(党参、白术、茯苓、甘草、陈皮、法夏、柴胡、白芍、丹参、莪术、蒲公英、白花蛇舌草、半枝莲)，药物由桂林医学院附属医院中药房提供，为单味药分装颗粒剂；N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，批号：87070201，购于美国sigma aldrich公司；脱氧胆酸钠，批号：D6750，购于美国sigma aldrich公司；盐酸雷尼替丁胶囊，批号：20140401，广东逸舒制药有限公司；胃复春片，批号：A20140524，杭州胡庆余堂药业有限公司。

1.3试剂 免疫组化Syk多克隆抗体试剂盒，批号：SAB1302523；抗Survivin多克隆抗体试剂盒，批号：SAB4105536；p53免疫组化S-P试剂盒：SAB3404726。均购于美国sigma aldrich公司。

1.4仪器 冷冻切片机，徕卡显微系统(上海)贸易有限公司；隔水式电热恒温培养箱，上海岛析实业有限公司；电热保温箱，上海上器集团试验有限公司；医用冰箱，欧雪制冷设备有限公司；不锈钢压力锅，美的电器有限公司；1000瓦电炉，江苏恒力炉业有限公司；光学显微镜，美国bruker公司；图像分析软件，美国bruker公司。

2方法2.1药物制备将MNNG用去离子水溶解，配制成浓度为1 g/L的储备液，于4℃下的冰箱中避光保存，临用时用双蒸水配成100 μg/ml的浓度；盐酸雷尼替丁胶囊(0.15g/粒)加工成0.03%的雷尼替丁颗粒饲料以供造模；脱氧胆酸钠用双蒸水新鲜配制成200 mmol/L母液避光冷藏保存，用时稀释成20mmol/L(0.85%)；用80℃的热水溶解中药颗粒剂，配制成浓度为2.26g/ml的混悬液，于冰箱中保存，作为高浓度中药备用；将胃复春片研成细粉，用蒸馏水溶解，配制成浓度为52.5 mg/ml的混悬液，于冰箱中保存备用。

2.2模型制备 参考文献[4]，采用改进后的综合造模法造PLGC模型。具体如下：造模组大鼠进食含0.03%雷尼替丁的颗粒饲料。自第二周起每日自由饮用100 μg/ml的MNNG(饮水瓶用油漆涂黑避光)，上午用55℃15%盐水按10 ml/kg灌胃，下午用20 mmol/L(0.85%)脱氧胆酸钠溶液按10 ml/kg灌胃并采取禁食一天、进食两天的方法使大鼠处于饥饱相间的状态，禁食当天下午按10 ml/kg以40%酒精灌胃，灌胃前后1h禁水。每周用钳子夹住大鼠的尾部一次，使之保持激怒、争斗状态，持续30min。同时正常组大鼠以生理盐水按10 ml/ (Kg·d)灌胃，与其他组灌胃时间同步。采用上述方法连续造模24周。

2.3分组及实验干预将大鼠随机分为6组，分别为：空白对照组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、胃复春对照组与模型对照组，平均每组20只。除空白对照组正常进食进水外，其他5组以上述模型制备方法进行造模。造模成功后，对各组大鼠给予相应的实验干预。按模型大鼠与正常成年人的体表面积之比确定给药剂量，中药低剂量组每天用2 ml稀释4倍后的高浓度中药混悬液灌胃，实际剂量为3.77 g/(Kg·d)；中药中剂量组每天用2 ml稀释2倍后的高浓度中药混悬液灌胃，实际剂量为7.53 g/(Kg·d)；中药高剂量组每天用2 ml高浓度中药混悬液灌胃，实际剂量为15.06 g/(Kg·d)；胃复春对照组用2 ml胃复春混悬液灌胃，实际剂量为0.35 g/( Kg·d)；模型对照组和空白对照组每天用2 ml 0.9%氯化钠溶液灌胃。连续实验干预16周后，所有大鼠禁食不禁水1d，断头处死。

2.4指标检查及方法2.4.1胃窦黏膜病理组织学观察:迅速解剖处死后的各组大鼠，取胃，沿胃大弯切开，用生理盐水清洗干净，取约0.5cm×0.5 cm大小的胃窦组织，用10%甲醛溶液固定。用石蜡包埋并连续切片，采用HE染色法进行染色，在光学显微镜下观察是否有肠上皮化生、腺体萎缩及不典型增生的情况。

2.4.2Syk蛋白、突变型p53蛋白的检测 :采用免疫组化S-P法检测：病理切片按照试剂盒说明进行染色后，观察Syk与突变型p53蛋白的表达情况，并使用显微图像分析系统进行图像分析。结果判定标准：于光学显微镜下观察，存在胞膜、胞浆或胞核为棕黄色颗粒者即为阳性。

2.4.3 Survivin蛋白的检测:采用免疫组化S-P染色方法检测：用抗Survivin多克隆抗体试剂盒按照说明书进行S-P免疫组织化学染色后，在光学显微镜下进行检测： 根据阳性细胞的比例与染色的强度分别记0-3分，具体为：阳性细胞<10%记0分，10%-45%记1分，46%-70%记2分，>70%记3分；染色强度以多数细胞的染色反应为准，不着色记0分，浅黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分。将两项指标的记分相加，分为4级：0-1分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，3～4分为阳性(++)，5～6分为强阳性(+++)。

2.5统计学方法实验数据均采用SPSS21.0软件处理，计数资料用百分比的形式表示，进行χ2检验；计量资料用形式表示，进行双侧t检验。P< 0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1各组大鼠胃窦黏膜组织生长情况比较经过24周造模与16周实验干预后，模型对照组20例胃窦黏膜组织全部出现腺体萎缩、肠上皮化生及不典型增生的情况，而空白对照组20例胃窦黏膜组织全部生长正常，表明造膜成功。而中药组随着剂量的递增，腺体萎缩、肠上皮化生及不典型增生的发生率明显降低(各组间χ2检验，均有P< 0.05)，且呈现一定的剂量相关性。中药高剂量组胃窦黏膜组织异常生长的发生率与胃复春对照组相当，数据无统计学差异(P> 0.05)，见表1 。

表1　各组大鼠胃黏膜组织生长异常

3.2各组大鼠胃窦黏膜组织中Syk蛋白表达情况比较实验干预16周后，模型对照组Syk蛋白阳率仅为30.0%，显著低于空白对照组的100.0%；中药组随着剂量升高，Syk蛋白阳率明显升高(各组间χ2检验，均有P< 0.05)，呈现剂量相关性；中药高剂量组Syk蛋白阳率略高于胃复春对照组，数据无统计学差异(P> 0.05)，见表2。

表2　各组大鼠胃窦黏膜组织中Syk蛋白阳

3.3 各组大鼠胃窦黏膜组织中突变型p53蛋白表达情况比较 实验干预16周后，模型对照组突变型p53蛋白阳性率为70.0%，而空白对照组不表达突变型p53蛋白；中药组随着剂量升高，突变型p53蛋白阳性率明显降低(各组间χ2检验，均有P< 0.05)，呈现剂量相关性；中药高剂量组突变型p53蛋白阳性率与胃复春对照组相当，数据差异无统计学意义(P> 0.05)(见表3)。

3.4各组大鼠胃窦黏膜组织中Survivin蛋白表达情况比较 干预16周后，模型对照组胃窦黏膜组织Survivin蛋白的表达为强阳性，而空白对照组为阴性；中药组随着剂量升高，Survivin蛋白的表达由阳性减少到弱阳性(各组间双侧t检验，均有P< 0.05)，呈现剂量相关性；中药高剂量组Survivin蛋白的表达与胃复春对照组相当，均为弱阳性，数据差异无统计学意义(P>0.05)，见表4 。

表3　各组大鼠胃窦黏膜组织中突变型

表4　各组大鼠胃窦黏膜组织中Survivin

4讨论在中医范畴，PLGC并无相应的名称，但根据其临床表现，多以“痞满”为主、亦可见于“嘈杂”、“胃痛”、“胃胀”等范畴。大多数学者认为，胃癌前病变发病的基础是脾胃虚弱。其病机特点是本虚标实，虚实夹杂，本虚以脾胃气虚为主，标实则有气滞、湿阻、血瘀、热毒等。治疗上应以健脾益气、理气消胀、活血化瘀、养阴增液、清热解毒、化痰软坚等为主[5]，其中尤其应以健脾为主，许多胃病的治疗都以健脾为先[6-7]。加味柴芍六君方(党参、白术、茯苓、甘草、陈皮、法夏、柴胡、白芍、丹参、莪术、蒲公英、白花蛇舌草、半枝莲等)中，以四君子汤坐镇中州，益气健脾，固护脾土；柴胡、白芍重在疏肝柔肝行气；陈皮、半夏理气化湿和胃；莪术、丹参活血通络，使脾胃脉络通畅、瘀滞消除；白花蛇舌草、半枝莲、蒲公英清热祛毒，促进黏膜病变的修复。该方标本兼治，虚实共调，正中病机，临床显示疗效良好。

分子药理学的研究表明，PLGC的病变过程中涉及到多种抑癌基因和癌基因的变化。其中，比较重要的有脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，Syk)，Syk为抑癌基因 ，其缺失会导致免疫细胞发育、成熟障碍，从而使肿瘤易于发生[8]。另外，突变型p53也被认为是PLGC的病变过程中的一个标志性的癌基因[9]， 它可以反映慢性萎缩性胃炎的肠上皮化生及异型增生的程度。此外，Survivin也常被用来当作用PLGC的病变过程生物标志分子[10]，属于凋亡抑制蛋白，是迄今发现最强的凋亡抑制因子，能够抑制肿瘤细胞的凋亡。

本研究的结果表明，在病征方面，加味柴芍六君方可以预防或逆转大鼠胃窦黏膜肠上皮化生、腺体萎缩及不典型增生等病理过程。在实验研究中，中药组大鼠胃窦黏膜异常生长的发生率明显低于模型对照组，而且呈现剂量相关性，高剂量组的效果与胃复春相当。在病因方面，加味柴芍六君方也能针多种相关基因起作用。一方面，该方可以增加大鼠胃窦黏膜中Syk蛋白的表达，上调鼠胃窦黏膜细胞中Syk蛋白的水平。在实验中，中药组大鼠胃窦黏膜细胞中的Syk水平明显高于模型对照组，同样是剂量相关的，高剂量组效果与胃复春相当。另一方面，加味柴芍六君方还可以抑制大鼠胃窦黏膜细胞中突变型p53和Survivin的表达，中药组大鼠胃窦黏膜细胞中突变型p53和Survivin水平明显低于模型对照组，也具有剂量相关性，高剂量时与胃复春效果相当。本研究表明，加味柴芍六君方可以从病征和病因两方面抑制或逆转PLGC的发生发展，具有标本兼治的效果，为其临床使用提供了一定的理论依据。

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(收稿2016-03-15；修回2016-04-19)

*广西自治区桂林市科学研究与技术开发计划项目 (20140120-1-12)

胃肿瘤/中医药疗法 @加味柴芍六君方 动物，实验大鼠

R735.2

Adoi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.10.080