模拟体外消化对蓝靛果提取物花色苷组成及抗氧化能力的影响

王月华，李　斌，孟宪军，*，安小琦，马　岩，张　琦，李　丽，李冬男

（1.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866；2.沈阳师范大学实验教学中心，辽宁 沈阳 110034）

模拟体外消化对蓝靛果提取物花色苷组成及抗氧化能力的影响

王月华1，李斌1，孟宪军1，*，安小琦1，马岩2，张琦1，李丽1，李冬男1

（1.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866；2.沈阳师范大学实验教学中心，辽宁 沈阳 110034）

研究体外消化前后蓝靛果提取物的总酚和花色苷含量、花色苷组成以及抗氧化能力的变化。实验分别采用福林-酚法和pH示差法测定总酚和花色苷含量，利用高效液相色谱-电喷雾二级质谱联用技术结合分子质量，离子碎片，出峰顺序及参考文献分析花色苷组成；采用总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）和氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）法测定体外消化前后提取物的抗氧化能力。结果表明：模拟体外消化后样品总酚含量增加了48.2%，花色苷含量降低了67.6%，单体花色苷由11 种降为8 种，此外，ORAC值和T-AOC值分别下降了80.0%和55.6%。综上，与未经消化提取物相比较，模拟体外消化处理的蓝靛果提取物的多酚含量增加，花色苷含量和种类均减少，抗氧化能力下降。

蓝靛果；总酚含量；花色苷组成；氧自由基吸收能力；总抗氧化能

蓝靛果忍冬（Lonicera caerulea Turcz.），又名蓝靛果，山茄子果，为忍冬科，忍冬属。它起源于欧洲，现主要分布在中国、俄罗斯和日本，具有“第三代水果”之称［1］。蓝靛果果实为蓝黑色，呈椭圆且长形，口味较涩，是一种营养价值颇高的浆果。果实中除含有VB、VC等维生素和铁、锌等矿物之外，还含有丰富的多酚类生物活性物质（特别是花色苷）［2］，曾在俄罗斯和中国被用作民间药材［3］。花色苷是由花青素和单糖或多糖（葡萄糖、鼠李糖、二糖和三糖等）以糖苷键连接而成（图1）［4-5］，多数在C3位，少数在C5或C7位。大量研究表明，花色苷具有广泛的保健功效，例如抗肥胖、抗炎、降低胆固醇等［6-8］。基于蓝靛果果实中含有丰富的花色苷，近几年越来越多关于蓝靛果的研究集中在其提取物的功能性研究，如抗炎、抗辐射等［9-11］。

然而，机体摄入的生物活性物质在胃肠道消化过程中会发生降解或转化。因此，摄入的活性物质并不能完全被机体利用。研究表明，生物活性物质对机体功效的主要影响因素为生物有效性即消化稳定性［12］。可见，采用模拟体外消化的方法研究物质的生物活性更接近于物质被生物体利用的情况。体外消化模拟技术具有简单、快捷、成本低和重演性好等优点，该技术的建立对准确评定物质的生物活性具有重要意义。目前，有关蓝靛果提取物抗氧化性的研究已有报道［13-15］，而关于蓝靛果花色苷体外消化稳定性的研究甚少。

本实验采用体外模拟人体胃肠消化方法，研究蓝靛果提取物在不同消化阶段总酚、花色苷含量，花色苷组成及抗氧化能力的变化。以期为科学评价蓝靛果果实的营养价值和抗氧化活性提供进一步的理论支持。

图1　花青素的结构式［4-5］Fig.1　Structure of anthocyanidin［4-5］

1　材料与方法

1.1材料与试剂

‘蓓蕾’蓝靛果冻果于2015年6月采自黑龙江省海林市。

胃蛋白酶（1:3 000）、胰蛋白酶、无水乙醇（分析纯）、盐酸（分析纯）、乙腈（色谱纯）、甲酸（色谱纯）、氯化钾、无水乙酸钠、福林-酚试剂、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）试剂盒、氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）试剂盒、矢车菊-3-葡萄糖苷标准品，以上试剂均购自北京鼎国生物试剂有限公司。

1.2仪器与设备

HZQ-F全温振荡培养箱 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；V5800型紫外-可见分光光度计 上海光析仪器有限公司；酸度计、电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；SB25-12DTN超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份公司；JYL-C012九阳榨汁机 九阳股份有限责任公司；旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；层析实验冷柜、BT-100B数显恒流泵 上海沪西分析仪器厂有限公司；LGO.2型真空冷冻干燥机 沈阳信阳速冻设备制造有限公司；1100高效液相色谱仪（配DAD检测器）、1100质谱仪 美国Agilent公司；酶标仪美国Bio-Tek公司。

1.3方法

1.3.1蓝靛果提取物的制备

‘蓓蕾’蓝靛果采收当天立即运回沈阳农业大学食品学院实验室，置于-20 ℃冰箱中贮藏，备用。自然解冻后进行花色苷提取。花色苷提取、纯化根据前期实验的方法进行［16］。即将蓝靛果冻果置于黑暗条件下自然解冻。准确称取300 g解冻后的蓝靛果，打浆。用0.1%盐酸酸化的甲醇溶液为提取溶剂，料液比为1∶10（V/V），40 ℃ 下超声波辅助提取90 min后真空抽滤。滤出的残渣用以上程序重复提取2 次。将得到的滤液合并，并用旋转蒸发仪在40 ℃温度下进行浓缩至无甲醇残留。将得到的浓缩液再次抽滤，收集。用400 mL装有D101大孔树脂的玻璃柱在层析柜中对收集的滤液进行分离纯化。当上样量为1/2柱体积时停止上样，静止吸附6 h，用2 倍柱体积的蒸馏水除去杂质，甲醇作为洗脱剂，收集洗脱液。将收集到的液体再次旋转蒸发（40 ℃）除去甲醇，得到的浓缩液置于培养皿中冷冻干燥成粉末，封装于2 mL的离心管中，置于-20 ℃条件下贮藏备用。

1.3.2体外消化过程模拟

模拟体外消化过程参考Chiang等［17］的方法并稍作改动。模拟消化过程（4 h）分为2 个阶段。第一阶段，胃消化。称取200 mg蓝靛果提取物用50 mL 0.9% NaCl溶液溶解，加入0.5 mL 1 mol/L HCl溶液（此时混合液pH值为2），随后加入160 mg胃蛋白酶（1:3 000），将混合液放置恒温振荡培养箱中37 ℃避光振荡培养2 h（厌氧条件）。第二阶段，肠消化。向消化后混合液中逐滴加入11 mL 0.5 mol/L NaHCO3至pH 7.5，随后加入18 mL混合物（V（2 mg/mL的胰蛋白酶液）∶V（12 mg/mL的胆酸盐）=12:6），37 ℃避光振荡培养2 h（厌氧条件）。分别在消化60、120、180、240 min时取样，并将样品快速酸化至pH 2（使酶失活，利于花色苷稳定），在12 000×g、4℃条件下离心20 min，取上清液，置于4 ℃条件下贮藏备用。

1.3.3总酚含量测定

消化前后样品总酚含量测定根据☒avikin等［18］的方法并稍作修改。准确量取1 mL福林-酚试剂于试管中，加入200 μL适当稀释的样品溶液，室温避光反应4 min后，加入800 μL Na2CO3溶液（75 g/L），室温避光平衡2 h。于765 nm波长处测定反应混合液的吸光度（蒸馏水调零）。以没食子酸为标准品绘制标准曲线，得到回归方程为：y=0.081 05+5.011 43x（R2=0.999 6），没食子酸在0.005～0.05 mg/mL范围内具有良好的线性关系，根据标准曲线计算总酚含量，结果以毫克没食子酸（gallic acid，GAE）当量每升样品溶液表示（mg GAE/L）。实验重复3 次，取平均值。

1.3.4花色苷含量测定

消化前后样品花色苷含量测定参照Denev等［19］的方法，并稍作改动。分别量取1 mL样品与9 mL氯化钾缓冲液（pH 1.0）和9 mL乙酸钠缓冲液（pH 4.5）混合后，置于室温避光平衡20 min。分别在λmax和700 nm波长处测定反应混合物的吸光度值。总花色苷含量表示为毫克矢车菊-3-葡萄糖苷（CYD-3-G）当量每升样品溶液（mg CYD-3-G/L）。实验重复操作3 次，取平均值。花色苷含量按式（1）计算。

式中：ΔA = （Aλmax-A700nm）pH1.0-（Aλmax-A700nm）pH4.5；DF为稀释倍数；Mw为矢车菊-3-葡萄糖苷的相对分子质量（449.2）；ε为矢车菊-3-葡萄糖苷的消光系数（26 900）；L为光程（通常为1 cm）。

1.3.5ORAC值测定

准确量取50 μL用75 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）适当稀释的样品和50 μL 7.7 mmol/L荧光素，于96 孔微孔板中混合，随后加入150 mL 221.3 mmol/L 2，2’-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（2，2’-azobis （2-amidinopropane）dihydrochloride，AAPH）启动反应，此为实验组。对照组（Trolox+荧光素+AAPH）和空白组（荧光素+ AAPH）分别用Trolox标准品和缓冲液代替样品。用酶标仪分别在激发波长490 nm和发射波长530 nm条件下测定反应液荧光强度，每分钟测定一次，连续测定80 min。根据样品的荧光衰退曲线的保护面积和标准品的荧光衰退曲线的保护面积之比计算样品的ORAC值。以ORAC值为纵坐标，Trolox浓度（10～100 μmol/L）为横坐标建立标准曲线，根据标准曲线计算待测样品ORAC值，结果表示为μmol Trolox当量（TE）每克提取物（μmol TE/g 提取物）。

1.3.6T-AOC值测定

消化前后样品T-AOC值测定按照试剂盒说明书采用比色法进行。在37 ℃时，每分钟每毫克待测样品使反应体系光密度（OD）值每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位（U）。T-AOC按式（2）计算。

1.3.7高效液相色谱-电喷雾二级质谱（high performance liquid chromatography- electrospray ionization- mass spectrum/ mass spectrum ，HPLC-ESI-MS/MS）联用分析

样品准备：未消化样品：准确称取15 mg蓝靛果提取物，用5 mL甲醇溶解，经0.45 μm膜过滤，备用；消化后样品：将收集的消化后上清液进行固相萃取。首先，先后用5 mL去离子水和5 mL甲醇激活C18柱（500 mg，3 mL），再将5 mL上清液缓慢压过柱子，用2 倍柱体积的去离子水去除干扰物质后，用5 mL甲醇洗脱目标物质，收集洗脱液，经0.45 μm膜过滤，备用。

HPLC条件：色谱柱：Dikma Platisil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；温度：25 ℃；进样量：20 μL；流速：0.7 mL/min；检测波长520 nm；流动相：A：乙腈，B：0.1%甲酸水溶液；梯度洗脱程序：0～45 min：0%～45% A，100%～55% B；45～50 min：45%～0% A，55%～100% B。

质谱条件：正离子模式，全自动二级质谱扫描，扫描范围：50～1 000 m/z；干燥气压力：2.76×105Pa；流量：12 L/min；温度：350 ℃，毛细管电压：3 500 V。

1.4数据统计分析

2　结果与分析

2.1模拟体外消化对总酚和花色苷含量的影响

表1　体外胃肠消化对蓝靛果提取物总酚和花色苷含量的影响Table1　Effect off in viittrroo gastrointestinal digestion on the contents of total polyphenols and anthocyanins inL. caeruulleeaa berry extracts

由表1可知，未消化样品的总酚含量最高，为729.6 mg GAE/L。胃消化初期，总酚含量缓慢增加，胃消化2 h后，总酚含量达到828.9 mg GAE/L；在肠消化阶段，总酚含量增加较快，肠消化2 h后，总酚含量达到1 081.3 mg GAE/L，显著高于未消化样品的总酚含量（P＜0.05）。结果表明，随着体外消化的进行，总酚含量增加了48.2%，这与Toydemir等［20］在体外消化对酸樱桃总酚含量影响的研究结果一致。

未消化样品的花色苷含量为400.1 mg CYD-3-G/L。胃消化初期，花色苷含量逐渐降低，胃消化1、2 h后样品的花色苷含量无显著差异（P＞0.05）。肠消化阶段，花色苷含量显著下降（P＜0.05）。肠消化2 h后样品的花色苷含量是未消化样品花色苷含量的32.4%。实验结果表明，花色苷在胃消化条件下比肠消化条件下稳定；随着体外消化的进行，样品花色苷含量呈下降趋势，这与Huang Haizhi［21］和Tagliazucchi［22］等的研究结果相似。此外，肠消化条件下花色苷含量显著降低的原因可能是花色苷在中性条件下不稳定，较容易降解为查尔酮或其他小分子酚类化合物［23］。

2.2模拟体外消化对ORAC值和T-AOC值的影响

图2　体外胃肠消化对蓝靛果提取物ORAC值（A）和T-AOC值（B）的影响Fig.2 Effect of in vitro gastrointestinal digestion on ORAC （A） and T-AOC （B） values of L. caerulea berry extracts

ORAC和T-AOC测定是评价植物组织抗氧化能力的常用方法。实验通过测定ORAC值和T-AOC值分析体外消化前后样品的抗氧化能力变化情况。由图2A可知，与未消化样品相比，胃消化1 h样品的ORAC值呈轻微增加趋势（P＞0.05），随着消化进行，ORAC值显著下降（P＜0.05）。肠消化2 h后，ORAC值下降为13.06 μmol TE/g，是未消化样品时的20%。结果表明，体外消化过程可显著降低蓝靛果花色苷提取物的ORAC值，这与Huang Haizhi等［21］的研究结果相一致。由图2B可知，体外消化过程中T-AOC值呈先上升后下降趋势。随着胃消化的进行，T-AOC值逐渐升高，胃消化2 h后，T-AOC值达到最高，为158.7 U/mg。进入肠消化阶段，T-AOC值显著下降（P＜0.05），体外消化结束后，T-AOC值为未消化样品的44.4%。结果表明，体外消化可显著降低蓝靛果提取物的总抗氧化能力。此外，体外消化期间，蓝靛果提取物抗氧化能力降低可能与花色苷降解有关。

2.3模拟体外消化对花色苷组成的影响

图3　体外模拟胃肠消化前后蓝靛果花色苷HPLC结果Fig.3　HPLC chromatograms of L. caerulea berry extracts before and after in vitro gastrointestinal digestion

实验采用HPLC-EIS-MS/MS技术结合标准品、分子质量和出峰顺序，以及参考文献［5，24］的研究结果分析蓝靛果提取物消化前后花色苷组成。由图3可知，消化前后样品中矢车菊-3-葡萄糖苷含量均最高，分别占总花色苷含量的90.8%（未消化样品）、90.4%（胃消化样品）、90.7%（肠消化样品）。此外，质谱分析发现，矢车菊-3-芸香糖苷与矢车菊-3-葡萄糖苷出峰时间较近，因此，矢车菊-3-芸香糖苷应与矢车菊-3-葡萄糖苷共同洗脱或者只能在质谱条件下检测到。这与Lohachoompol等［25］的研究结果相似。

表2　体外模拟胃肠消化前后蓝靛果提取物花色苷组成Table2　Anthocyanin composition ofL. caerulea berry extracts before and afftteerr in vittrroo gastrointestinal digestion

由表2可知，未消化、胃消化和肠消化样品中分别检测出11、10、8 种花色苷；在胃消化2 h后的样品中未检测到矢车菊-己糖苷二聚体（MS=897；MS/MS=735、573、287）；在肠消化2 h后样品中，矢车菊-己糖苷二聚体（MS=897；MS/MS=735、573、287）、矢车菊-3-已糖苷-儿茶素（m/z 737）和矢车菊-3-乙酰己糖苷（m/z 491）未被检测到。实验结果表明，体外消化期间花色苷种类逐渐减少。此外，胃肠消化过程中，未检测到的花色苷可能降解为其他酚类物质，例如黄酮（杨梅酮，m/z 317）、酚酸（酒石酸，m/z 149）和一些酰基化衍生物（阿魏酸，m/z 193）［26-27］。

3　结 论

实验结果表明，模拟体外消化可显著增加蓝靛果提取物总酚含量，降低花色苷含量；通过测定模拟体外消化前后样品的ORAC值和T-AOC值发现，体外胃肠消化可显著降低蓝靛果提取物的抗氧化能力；同时，由体外消化前后样品花色苷组成分析可知，与未消化样品相比，体外消化后蓝靛果提取物花色苷种类减少3 种。可见，模拟体外消化后样品的总酚含量增加，花色苷含量及种类减少，抗氧化能力降低，由此可以推测蓝靛果提取物经模拟体外消化处理后，其生物活性（如抗炎能力）会下降，这需要进一步实验验证。

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Effect of in Vitro Simulated Digestion on Anthocyanin Composition and Antioxidant Activity of Lonicera caerulea Berry Extracts

WANG Yuehua1， LI Bin1， MENG Xianjun1，*， AN Xiaoqi1， MA Yan2， ZHANG Qi1， LI Li1， LI Dongnan1
（1. College of Food Science， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China；2. Experimental Teaching Center， Shenyang Normal University， Shenyang 110034， China）

Changes in total polyphenols and anthocyanins contents， anthocyanin composition and antioxidant capacity of Lonicera caerulea berry extracts before and after in vitro digestion were investigated. Folin-Ciocalteu and pH differential methods were used for determining the contents of total polyphenols and anthocyanins， respectively. Anthocyanin composition was analyzed using HPLC-EIS-MS/MS based on molecular mass and fragment ions， peak sequence and related literature data. Antioxidant activities of the extracts before and after in vitro digestion were measured using total antioxidant capacity （T-AOC） and oxygen radical absorbance capacity （ORAC） methods. The results indicated that the content of total polyphenols increased by 48.2% while anthocyanins decreased by 67.6%. The number of anthocyanins decreased from 11 to 8； additionally， the ORAC and T-AOC values of the extracts decreased by 80.0% and 55.6% after in vitro digestion，respectively. Taken together， after in vitro digestion， Lonicera caerulea berry extracts had increased total polyphenols，reduced anthocyanin contents and composition， and lowered antioxidant activity.

Lonicera caerulea； total polyphenol content； anthocyanin composition； oxygen radical absorbance capacity；total antioxidant capacity

10.7506/spkx1002-6630-201619017

TS255.1

A

1002-6630（2016）19-0100-06

王月华， 李斌， 孟宪军， 等. 模拟体外消化对蓝靛果提取物花色苷组成及抗氧化能力的影响［J］. 食品科学， 2016， 37（19）：100-105. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619017. http：//www.spkx.net.cn

WANG Yuehua， LI Bin， MENG Xianjun， et al. Effect of in vitro simulated digestion on anthocyanin composition and antioxidant activity of Lonicera caerulea berry extracts［J］. Food Science， 2016， 37（19）： 100-105. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201619017. http://www.spkx.net.cn

2016-04-26

公益性行业（农业）科研专项（201303073-04）；国家重点研发专项（2016YFD0400200）；沈阳市科学技术局农业科技攻关项目（F16-137-3-00）

王月华（1990—），女，博士研究生，研究方向为农产品加工与贮藏工程。E-mail：wangyuehua20122132@163.com

孟宪军（1960—），男，教授，博士，研究方向为小浆果深加工。E-mail：mengxjsy@126.com