非转流条件下猪原位肝移植模型的建立及评价

杨洋，淮明生，韩俊峰，高伟（.天津医科大学一中心临床学院，天津 3009；.天津市第一中心医院器官移植中心，天津 3009）

猪肝脏移植的开展对于实验研究及临床肝移植的发展十分重要。由于肝脏大小及解剖结构与人类相似，猪肝脏移植模型的建立为我们提供了一个理想的练习新外科技术的平台[1-2]。传统的体外静脉转流技术虽减轻了机体无肝期的血流动力学失衡，但也带来一些缺点，如血管受损、血栓形成、操作繁琐等[3-4]。因此，需要建立一种高度标准化、易于复制、方便操作且具有较好重复性和稳定性的大型动物原位肝移植模型。在改进手术技巧和缩短无肝期的基础上，我们于2015年2月至2015年6月在无静脉转流条件下建立猪原位肝移植模型，为进一步研究积累了宝贵经验。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组：健康巴马小型猪（由解放军军事医学科学院实验动物中心提供），雌雄不限，6～8月龄，体量为15～20 kg，采用随机数字表法分为供体和受体，于无静脉转流条件下对巴马小型猪27只行原位肝移植术。术前禁食24小时，禁水12小时。

1.2 术前准备及麻醉：供体采用基础麻醉方法，经臀大肌注射10 mg/kg氯胺酮、0.4 mg/kg地西泮及0.03 mg/kg阿托品，以戊巴比妥钠30 mg/kg维持。受体在基础麻醉的基础上，通过耳缘静脉建立静脉通路，给予1 mg/kg氯化琥珀胆碱注射液行麻醉诱导，然后行气管插管经麻醉机给予间歇正压通气，快速吸入体积分数为3%～4%的七氟烷3～5分钟后，降低七氟烷的吸入体积分数至2%～3%维持麻醉。调控吸氧体积分数为30%～50%，流量为1 L/min，维持潮气量（VT）为10 ml/kg，呼吸频率为16～18次/分，吸呼比为1∶2。间断静脉注射0.1 mg/kg维库溴铵维持肌松。

1.3 供体手术及供肝修整：麻醉满意后，将供猪仰卧位固定于恒温手术台，常规消毒铺巾后取腹部大十字切口进腹，于髂血管分叉处向上游离腹主动脉约2 cm处并带入7号丝线。游离左右三角韧带。解剖肝门，游离肝动脉、门静脉及胆总管。游离肝固有动脉及肝总动脉至腹主动脉，切断并结扎胃右动脉、胃十二指肠动脉及脾动静脉，注意有无变异的肝动脉，切断并结扎肝十二指肠韧带和肝胃韧带的残余组织。游离门静脉主干及肠系膜上静脉近端并带入7号丝线。游离胆总管，于近十二指肠处切断。解剖肝下下腔静脉至肾静脉水平，切断肝后韧带，于膈下游离腹主动脉并带入7号丝线。游离完成后输注3 mg/kg肝素抗凝血，输注肝素2～3分钟后将灌注管路分别置入腹主动脉和肠系膜上静脉，快速灌注4℃的乳酸林格液3 000 ml，同时阻断膈下腹主动脉并剪开膈肌，距膈肌孔上方的2 cm处离断肝上下腔静脉，于肾静脉水平剪断肝下下腔静脉，肝周用碎冰屑降温，边灌注边调整肝脏位置并进行肝脏按摩，使肝脏各叶均得到充分灌注。乳酸林格液灌注完毕后，继续灌注4℃的UW器官保存液1 500 ml，灌注完毕后，切下肝脏置于4℃的UW器官保存液中进行修整。修整时注意保留适当的血管长度以备吻合，切除胆囊并冲洗胆道，剪除多余膈肌组织。修整完毕后将供肝保存于4℃的UW器官保存液中。

1.4 受体手术：受体取上腹反“L”形切口入腹以免损伤尿道。游离肝周韧带及血管，离断肝动脉，以静脉阻断钳分别阻断门静脉、肝上及肝下下腔静脉，紧贴肝脏离断门静脉、肝上及肝下下腔静脉，移出受体肝脏，妥善修整各血管断端后将供肝置入受体腹腔，以5-0 Prolene线快速吻合供受体的肝上下腔静脉，吻合同时经门静脉灌注4℃乳酸林格液以排出供肝内残余的UW器官保存液以及避免供肝温度过高。然后以6-0 Prolene线吻合门静脉，注意门静脉打结固定时应预留0.5～1.0 cm“生长因子”，以防止血管开放后出现狭窄。吻合完毕后门静脉结束无肝期，经肝下下腔静脉放血100 ml后夹闭肝下下腔静脉并开放肝上下腔静脉，以5-0 Prolene线吻合肝下下腔静脉并开放。确切止血后分别以8-0 Prolene线及6-0 PDS吻合肝动脉及胆总管。再次确认无出血后，放置腹腔引流管并关腹。

1.5 术中监护与处理：受体猪麻醉后持续心电监护，经右侧颈部切口游离颈内静脉和颈内动脉。经颈内静脉行三通管插管，以监测术中中心静脉压（CVP）以及作为术中和术后给药和补液的通路，经颈内动脉插管并监测平均动脉压（MAP）和心率。无肝期前加快补液速度，使CVP提高至8～10 cmH2O（1 cmH2O＝0.098 kPa）正常上限水平。无肝期开始前5分钟静脉持续给予多巴胺5～15 μg /（kg·min），进入无肝期后继续应用多巴胺，配合适当补液以维持MAP在50～60 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）左右，待新肝期血压稳定后逐步减量停用。结束无肝期时使用甲泼尼龙10 mg/kg减轻新肝缺血/再灌注损伤，静脉滴注5%碳酸氢钠5 ml/kg和10%葡萄糖酸钙溶液10 ml，以纠正新肝期代谢性酸中毒和高钾对心肌的毒性作用。开放门静脉后经肝下下腔静脉放出血液100 ml，无肝期时门静脉内积聚了大量高钾物质及酸性代谢产物。

1.6 术后管理及观察指标：术后持续24小时监测心率、动脉血压及CVP，静脉输液8～100 ml/（kg·d），静脉滴注头孢呋辛钠1.5 g/d进行抗感染治疗3天，术后48小时开始进食。

主要观察指标：① 供肝冷缺血时间、无肝期时间和手术时间；② 术中CVP、平均动脉压、pH值、剩余碱及血清钾变化；③ 动物术后1天、3天及7天的存活率，解剖死亡动物以明确其死亡原因。

1.7 统计学分析：实验数据采用SPSS19.0版统计软件包处理，计量资料均采用均数±标准差（±s）表示，不同时间点间差异采用重复测量数据的方差分析，P＜0.05时差异具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 手术情况及术后存活率：27只非转流条件下猪原位肝移植手术中，供肝平均冷缺血时间为（125.3±20.4）分钟，平均无肝期为（20.6±2.3） 分钟，平均手术时间为（178.7±26.3）分钟。

术中平均失血量为（236.4±18.82）ml，输血量均为400 ml。无术中死亡，术后1天死亡1只，死亡原因为急性肺水肿；术后4天死亡1只，死亡原因为肺栓塞；术后6天死亡1只，死亡原因为腹腔感染；其余24只受体猪存活时间均超过1周。术后3天和7天的存活率分别96.3%（26/27）和 88.9%（24/27）。

2.2 术中血流动力学、动脉血气及生化指标变化（表1）：术中受体猪的血液动力学参数变化明显，与无肝期前相比，无肝期时实验动物的心率明显加快，血清K+显著升高（P＜0.05），MAP、CVP、pH值及剩余碱则明显下降 （P＜0.05）。手术结束时，MAP及CVP恢复，经药物调整后血清K+水平下降，酸碱度逐渐恢复。

表1 肝移植术中血流动力学、血气及生化指标变化（±s）

表1 肝移植术中血流动力学、血气及生化指标变化（±s）

注：与无肝期比较，aP＜0.05

剩余碱（mmol/L）无肝期前 92.00±9.64 94.53±7.87 5.83±0.58 7.40±0.02 4.13±0.37 0.64±2.02无肝期 148.00±7.74a 52.34±5.73a 1.52±0.33a 7.31±0.03a 4.82±0.52a -8.34±3.70a新肝期 140.00±8.29a 78.03±9.51a 3.74±0.42a 7.26±0.05a 5.45±0.55a -4.33±2.67a手术结束 123.00±6.71a 88.35±9.18 5.56±0.65 7.38±0.04 4.77±0.41a -1.15±2.05时段 心率（次/分）MAP（mmHg） （cmH2O） pH值 血清K+（mmol/L）CVP

3 讨 论

在肝移植实验研究中，理想的动物模型应接近临床实际情况，能模拟临床肝移植的全部过程，同时应易于操作，方便复制，具有良好的重复性和稳定性。猪肝胆系统的解剖生理与人类非常相似，是研究人类肝移植的理想实验动物。以往报道的猪原位肝移植手术过程复杂，创伤大、出血多、手术时间长、术后恢复慢，术中及术后早期并发症及病死率高，长期生存者较少[5-6]。因长时间麻醉、手术及体外静脉转流等因素对实验结果影响较大，各实验对象之间的可比性和重复性差。且所用猪体积较大，操作不便，动物生长迅速，肝脏体积、出入肝血管及胆管口径变化较快，不适于大样本含量的系列实验研究。鉴于此，本实验选用标准化程度高，基因纯合度和相似系数高的巴马小型猪为实验动物，减少了动物间的个体差异。研究表明在这一生长发育阶段肝脏的质量、体积、出入肝的血管胆管口径比较恒定，这些均有利于进行肝移植动物实验[7]。同时对既往猪原位肝移植手术过程进行了一系列改进，在非体外静脉转流条件下行原位肝移植。简化了手术步骤，有效避免了长时间麻醉、手术及体外静脉转流等因素对受体全身生理的干扰。本研究中无肝期时间和手术时间显著缩短，术中失血量和输血量显著减少，而手术成功率和动物存活率则显著提高。

非转流下原位肝移植手术的关键是维持无肝期血流动力学的稳定[8]。本模型在非体外静脉转流条件下建立，无肝期平均动脉压和CVP急剧下降，应依靠血管活性药物，配合适量输液将动脉血压维持在低水平稳定状态，避免过多的液体负荷，肝血流恢复后，血流动力学即逐渐得到纠正。内环境的稳定和代谢紊乱的纠正对于非转流下原位肝移植的成功同样关键。无肝期肝功能缺失，新肝期初始阶段肝功能尚未恢复，导致酸性代谢产物降解能力大大下降，加之移植肝在灌注后大量酸性代谢产物进入血液循环，因此，肝脏移植期间易发生较明显的血生化改变和代谢性酸中毒。应尽量缩短无肝期手术时间，电解质紊乱及代谢性酸中毒的预防和及时纠正，是手术中监测和治疗的重要内容。门静脉开放后从肝下下腔静脉放血100 ml，同时输入碳酸氢钠纠正酸中毒，静推葡萄糖酸钙对抗高钾，对纠正电解质及酸碱平衡紊乱十分必要。

本实验结果表明，通过技术改进，控制无肝期时间，并根据无肝期前后血液动力学波动的特点加强围手术期的处理，使无肝期的血压维持在满意的水平，是取得较高存活率和稳定性猪原位肝脏移植模型的关键。