磁环法快速重建肝上下腔静脉大鼠肝移植模型

史源，杨涛，张全胜，张威，刘蕾，邓永林，郑虹，潘澄，沈中阳（天津市器官移植重点实验室，天津市第一中心医院器官移植中心，天津 300192）

目前大鼠原位肝脏移植模型（OLT）已经被广泛用于器官保存、移植病理、移植生理以及移植免疫方面的研究。该技术最早诞生于1973年，Lee等[1]学者首先采用手工缝合技术建立大鼠肝移植模型，但是，由于该方法需要一定的外科基础而且无肝期较长，因此，难以得到推广。1979年，Kamada和Calne[2]采用“双袖套法”快速重建门静脉以及肝下下腔静脉，由此将无肝期缩短到15～20分钟，术后存活率提高到70%以上，这种方法得到了广泛认可，成为经典技术[3]。但是，这种技术仍然需要缝合肝上下腔静脉（SHVC），需要一定的外科基础，掌握袖套技术也需要一定的时间。1980年，Miyata等[4]提出“三袖套法”，即在Kamada技术的基础上再用Cuff鞘重建SHVC[4]，然而，这种方法影响SHVC的通畅，容易造成扭曲以及错位，因此难以得到推广。Tschimoto等[5-6]采用内膜化的Cuff鞘进行SHVC的重建，但是这种技术操作复杂，成功率低，而且难以单人操作。随着临床肝移植的迅速发展，相关基础研究亦随之广泛展开，如何缩短无肝期，降低手术难度，提高大鼠肝移植模型术后存活率亦成为研究热点[7-8]。

磁性压榨技术利用磁体在相邻脏器或血管间产生持续、渐进性的压迫，从而造成受压榨区域逐渐缺血坏死，周围组织逐渐愈合，已经被广泛应用于胆道狭窄疏通、冠脉搭桥、微创消化道重建等领域。笔者对此技术研究10余年，在前期磁环法犬肝移植模型的基础上[9]，成功采用钛涂层微型磁环进行了大鼠SHVC快速重建。

1 材料与方法

1.1 磁环设计加工：磁环制作材料为钕铁硼，该材料广泛用于口腔矫形、消化道磁压榨重建等领域[10-12]，具有磁力强、组织相容性好等优点，本研究设计的肝上磁环为椭圆形，如图1所示，重量为0.15 g，采用线切割技术加工，氧化钛喷涂技术覆盖钛涂层。采用碘伏浸泡消毒。

1.2 实验动物及分组：选用120只雄性成年Wistar大鼠，体重为230～280 g，供、受体各半，随机分为两组：磁环组（n＝30），采用磁环法重建SHVC，双袖套法重建门静脉及肝下下腔静脉；缝合组：（n＝30），SHVC采用手工缝合，双袖套法重建门静脉及肝下下腔静脉。

图1 大鼠肝上磁环设计图

1.3 手术过程：所有动物术前禁食24小时，禁水8小时。采用七氟烷吸入麻醉。供体手术方式参照Kamada双袖套法[2]，正中切口入腹，硬膜外麻醉导管插入胆道，肝素化5分钟，门静脉插管后进行单纯门静脉灌注，采用低温器官保存液20 cm高度进行灌注，保留供体膈肌环。供肝修整过程中，利用SHVC周围膈肌环进行牵引，利用膈肌环弹性外翻套环，缝线收紧固定，如图2a～c所示。门静脉及肝下下腔静脉重建参照Kamada双袖套法[2]进行肝动脉结扎。

受体采用正中切口，游离肝周韧带。结扎右肾上腺静脉和肝动脉，游离胆总管并断扎，阻断门静脉及肝下下腔静脉，用含生理盐水的5 ml注射器驱血，在膈肌环以上水平阻断SHVC。门静脉及肝下下腔静脉残端预置标记、牵引线。移除受体肝脏，原位放入供肝。磁环组套入受体磁环，将SHVC外翻，用精密蚊式钳进行固定，用盐水冲洗同时依靠磁力、三维空间自动重合特性将供体和受体磁环对合，如图2d～f所示。缝合组采用7-0 prolene线连续缝合SHVC。两组均采用Kamada双袖套法重建门静脉、肝下下腔静脉。血流开放后，胆道用硬外麻醉导管插管，另一端插入受体胆道，结扎固定，肝动脉结扎。用温生理盐水冲洗腹腔，逐层关腹。

术后大鼠单笼饲养置于室温环境麻醉恢复，其后自由进水，术后3天内每天给予青霉素肌注，不用免疫抑制剂。

1.4 统计分析：采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。所有定量资料数据用均数±标准差 （±s）表示，各组样本均数比较采用t检验，生存率采用Kaplan-Meier生存曲线分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

图2 磁环法简要过程

2 结 果

磁环组：SHVC的重建时间（0.91±0.24）分钟，无肝期及手术时间分别为（5.63±0.65）分钟以及（36.02±8.02）分钟；缝线组：SHVC重建时间为（10.4±2.11）分钟，无肝期及手术时间分别为（17.76±2.51）分钟以及（49.38±12.06）分钟。磁环组和缝线组大鼠相比，SHVC的重建时间、无肝期及手术时间均具有统计学差异（P＜0.05），如表1所示。

表1 各组肝上下腔静脉重建时间、无肝期及手术时间

磁环组肝上磁环对合的成功率为100%，未出现渗血、气栓或者扭曲等并发症。彩色多普勒提示肝静脉为标准三相波，血管造影结果提示所有吻合口均通畅（图3）。HE染色及扫描电镜均提示磁环组肝上吻合口愈合良好（图4）。磁环组30只受体大鼠中有29只存活超过7天，28只存活超过30天；缝线组30只受体大鼠中25只存活超过7天，22只存活超过30天（图5，P＜0.05）。

图3 磁环组术后2周，彩色多普勒观察肝上吻合口（a）；磁环组术后2周，血管造影观察肝上吻合口（b）

图4 术后2周磁环组肝上吻合口

图5 磁环组和缝线组术后存活率比较

3 讨 论

大鼠OLT是一种非常精细的显微外科操作。它是一个多步骤、多环节、相互连续且相互联系的手术过程，其中供、受体任何一个步骤操作失误均会导致手术失败，影响大鼠术后的存活，甚至直接导致大鼠死亡。其中最大的难点便是手术过程中存在无肝期。Kamada等[2]提出无肝期的最长时间不能超过25分钟，否则大鼠很难存活。本经验也表明，无肝期的长短直接关系到手术的成败，熟练的显微外科吻合技术和套管技术是缩短无肝期的有力保障。尤其是高质量迅速完成肝上腔静脉的吻合，是手术成功的最主要瓶颈[13-14]。

磁性压榨吻合技术有3个方面优势：① 相同形状磁体三维空间自动重合，即肝上对合时可以自动完全重合；② 非穿透性，可以避免缝线、钛钉等异物带来的炎症反应，保证血管内膜的完整性，减少异物刺激，促进愈合；③ 渐进性，即随着磁环间组织坏死，磁环间距减少，磁力加大，安全性较好。尤其对于大鼠SHVC而言，菲薄的血管壁组织容易导致吻合口缝线穿透处漏血，或者起皱导致漏针，这些均是造成开放后动物出血死亡的最常见原因。结果证实，采用磁环法进行SHVC重建时，磁环对合成功率为100%，未出现渗血、气栓或者扭曲等并发症。彩色多普勒提示肝静脉为标准三相波，血管造影提示所有吻合口均通畅。HE染色及扫描电镜均提示磁环组肝上吻合口愈合良好。这些结果均显示出磁环技术的优势。

磁环技术明显缩短了大鼠肝移植模型的无肝期，降低了手术难度，术后存活率亦随之提高。微型磁环快速重建技术，为大鼠肝移植术中肝上下腔静脉重建提供一种新型、简单稳定的方式，明显缩短无肝期时间，提高手术成功率，降低手术难度。在2年的研究过程中，天津市第一中心医院器官移植中心将此技术推广到其他移植中心，效果亦满意，学习曲线2～3个月左右，最长存活时间近1年半，并在此基础上成功建立了急性排斥反应模型、小鼠肝移植模型、脑死亡大鼠肝移植模型等。