内生枯草芽孢杆菌CN181发酵条件优化

康兴娇，贾招闪，申红妙，焦文哲，冉隆贤，2*，甄志先*

1.河北农业大学林学院，河北保定071001

2.河北省林木种质资源与森林保护重点实验室，河北保定071000

内生枯草芽孢杆菌CN181发酵条件优化

康兴娇1，贾招闪1，申红妙1，焦文哲1，冉隆贤1，2*，甄志先1*

1.河北农业大学林学院，河北保定071001

2.河北省林木种质资源与森林保护重点实验室，河北保定071000

为了提高枯草芽孢杆菌CN181菌株在发酵液中的数量，本试验通过采用单因子试验和正交试验对枯草芽孢杆菌CN181的发酵培养基和发酵条件进行优化和筛选。通过单因子试验得出，玉米粉为最适碳源，豆粕为最适氮源，K+和Na+为最适金属离子；正交试验法得到了发酵液中各组分的最佳含量，分别是：玉米粉15.0 g·L-1、豆粕10.0 g·L-1、K2HPO42.0 g·L-1和NaCl 2.0 g·L-1；在确定了发酵培养基的含量后，对CN181菌株的最适培养条件进行了优化，其最佳条件为：发酵培养基的初始pH值8.0、250 mL摇瓶装液量30 mL、接种量2%（体积分数）、培养温度30℃、转速180 r·min-1、培养时间24 h。

枯草芽孢杆菌；内生细菌；发酵条件

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CN181是河北农业大学林学院林木病理实验室从小麦感病品种5389的实生组培苗中分离得到的一株内生细菌［1］，它不仅对小麦叶锈病和桉树青枯病有很好的防治效果［1，2］，经研究发现，该菌株对葡萄霜霉病也有防治效果［3］，具有很好的生防开发潜力。目前生产上对葡萄霜霉病的防治多以化学药剂为主，但化学药剂所产生的副作用是不可逆的［4］。自1921年Hartele［5］利用真菌防治猝倒病开启了以菌治菌的历史以来，植物病害生防微生物已涉及真菌、放线菌、细菌和病毒（噬菌体）等种群［5］。随着科学技术的不断进步与发展，芽孢杆菌类因其所具有的生长快、营养简单、极易分离培养等优点［6-9］，已被越来越多的植病研究者用于防治植物病害［7-11］。

发酵是生防菌进行推广应用的前提［9，12］。影响枯草芽孢杆菌发酵液中细菌数量的因素除了遗传特性外，主要有培养基的成分和发酵条件［8，12，13］。玉米粉、葡萄糖、豆饼粉、鱼粉及其它一些微量元素是生产上培养枯草芽孢杆菌的主要原料。调整培养基中各组分的配比，可以改善枯草芽孢杆菌的生长条件，提高发酵液中的含菌量。因此，本试验通过摇瓶发酵试验对该菌株的发酵培养基及发酵条件进行了优化筛选，得出其最适发酵培养基及发酵条件，为该菌株的工业生产奠定基础。

1　材料与方法

1.1供试菌株

枯草芽孢杆菌（B.subtilis）CN181，由河北农业大学林学院林木病理实验室保存提供。

1.2培养基

液体种子培养基：牛肉汁蛋白胨培养基（NA）［14］。

优化发酵培养基原料：碳源是蔗糖、玉米粉、可溶性淀粉和麦麸；氮源是黄豆粉、豆粕、鱼粉和硝酸钾；金属离子是MgSO4·7H2O、K2HPO4、Ca（NO3）2和NaCl。

1.3培养基组分的筛选与优化

种子培养液：用牙签挑取于NA固体培养基上培养48 h的CN181菌株的单菌落，接种于NA液体培养基中，于200 r·min-1、28℃条件下培养8～10 h，即为种子培养液。

最佳碳源的筛选［15］：碳源含量为15.0 g·L-1，将上述提到的4种碳源替换液体种子培养基中的葡萄糖，对照培养基为液体种子培养基。调节培养基的pH值为7.0，摇瓶的装液量为60 mL/250 mL，0.1 MPa、121℃灭菌30 min。接种量为0.6 mL（2%）的CN181菌株的种子培养液，于200 r·min-1、28℃条件下培养28 h。

2.3 对信息脱贫的长期性认识不足 现有的研究对信息贫困的长期性认识不足，从给出信息贫困成因的相应对策中，解决区域性的经济贫困，只能说改善了当地信息贫困状况。在解决信息贫困的对策中，政策制定有一定的储备期，政策的落实有相当长的滞后期；信息贫困人群信息意识的培育也有一定周期；信息环境的改善和信息技术的普及也不是一蹴而就的，所以从诸多影响信息贫困的因素来理解，信息富集与信息贫困总是相对的，信息贫困人口总是会客观存在，并会长期存在。

最佳氮源的筛选［15］：氮源含量为15.0 g·L-1，将上述提到的4种氮源替换液体种子培养基中的蛋白胨、酵母浸膏和牛肉浸膏，对照培养基为液体种子培养基。其他条件同上。

金属离子的筛选［15］：以筛选后的碳源、氮源为基础培养基，在该基础培养基中添加2.0 g·L-1的MgSO4·7H2O、K2HPO4、Ca（NO3）2和NaCl，对照为不加金属离子的培养基。其他条件同上。

培养基各组分配比的优化：通过上述试验得到的碳源-玉米粉、氮源-豆粕及无机盐-K2HPO4和NaCl进行4因素5水平的正交试验，采用L25（56）正交设计确定各组分的最佳配比。选择的因素及水平见表1。

表1　培养基成分的正交试验因素与水平Table 1 The factors and levels of the orthogonal test for components of culture medium

1.4最佳培养条件的优化

1.4.1培养基初始pH值、接种量和装液量的优化培养基初始pH值：用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH调节优化培养基pH值为6.5、7.0、7.5和8.0，其他条件同1.3。

装液量：摇瓶的装液量为30 mL/250 mL、60 mL/250 mL、90 mL/250 mL和120 mL/250 mL，其他条件同1.3。

接种量：将接种量按1%、2%、5%和10%的体积分数接种在配好的培养基中，其他条件同1.3。

根据上述3个因素进行3因素4水平的正交试验，采用L16（45）正交设计确定各发酵条件的水平。

1.4.3发酵转速的优化在上述培养条件优化的基础上，进行摇瓶发酵转速的优化，将该菌株分别放在150 r·min-1、180 r·min-1、210 r·min-1和240 r·min-1条件下培养，其他条件同1.3。

1.4.4最适发酵时间的优化在上述条件优化之后，以优化的最佳配比与培养条件为发酵参数，绘制该菌的生长曲线。自接菌开始，在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、16 h、24 h、28 h和32 h时分别取样测定摇瓶发酵液的光密度（OD600值）［16］，同时用平板菌落计数法［17］测定发酵液中的细菌数量，试验重复3次。

1.5数据处理

采用SPSS 17.0对单因素试验结果进行单因素方差分析（one-way ANOVA）和LSD多重比较，正交试验结果采用正交试验的直观分析法。

2　结果与分析

2.1培养基组分对枯草芽孢杆菌CN181菌株生长的影响

2.1.1不同碳源对枯草芽孢杆菌CN181菌株生长的影响由图1可见，从发酵液中CN181菌株的数量来看，当玉米粉作为碳源时，发酵液中的细菌数量最多，可达11.803×109CFU·mL-1；当可溶性淀粉作为碳源时，发酵液中的细菌数量较多，可达10.685×109CFU·mL-1；而以其他原料作为碳源时，细菌数量从大到小依次为蔗糖＞对照＞麦麸。综合分析，玉米粉作为碳源时，发酵液中的细菌数量最多，而且生产成本低廉，因此，选择玉米粉作为枯草芽孢杆菌CN181菌株发酵培养基的最佳碳源。2.1.2不同氮源对枯草芽孢杆菌CN181菌株生长的影响由图2可见，从发酵液中CN181菌株的数量来看，当豆粕作为氮源时，发酵液中的细菌数量最多，可达6.854×109CFU·mL-1；当NA培养基中的牛肉浸膏、蛋白胨和酵母浸膏同时作为氮源时，发酵液中的细菌数量较多，可达5.846×109CFU·mL-1；而以其他原料作为氮源时，发酵液中的细菌数量从大到小依次为鱼粉＞黄豆粉＞硝酸钾。综合分析，比较豆粕及NA培养基中的氮源对发酵液中CN181菌株的数量影响，二者不存在显著差异，但以豆粕为氮源的发酵液中的细菌数量较多，而且豆粕的生产成本低廉，因此选择豆粕作为枯草芽孢杆菌CN181菌株发酵培养基的最佳氮源。

图1　不同碳源对菌株CN181发酵的影响Fig.1 Effects of different carbon sources on the fermentation of CN181 strain

图2　不同氮源对菌株CN181发酵的影响Fig.2 Effects of different nitrogen sources on the fermentation of CN181 strain

图3　不同金属离子对菌株CN181发酵的影响Fig.3 Effects of different metal ions on the fermentation of CN181 strain

2.1.3不同金属离子对枯草芽孢杆菌CN181菌株生长的影响由图3可见，从发酵液中CN181菌株的数量来看，K+和Na+都能促进菌株繁殖，菌株在含这两种金属离子的培养基中的数量显著高于含其他金属离子培养基中的数量；Ca2+对CN181菌株的繁殖影响不明显；Mg2+、Mn2+和Fe2+则对CN181菌株的繁殖有强烈的抑制作用。由于K+、Na+的生产成本相当，且K2HPO4有提高培养基pH值的作用，因此，选择K2HPO4、NaCl作为枯草芽孢杆菌CN181菌株发酵培养基的复合无机盐。

2.2正交试验法优化培养基各组分的配比

发酵培养基中4种成分配比正交试验直观分析结果见表2。

表2　培养基各组分配比优化的正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test for every proportion of medium

由表2可知，在正交试验中，各因素极差的大小反映了发酵培养基中4种成分对CN181菌株繁殖的影响，极差越大，影响越显著。玉米粉、豆粕、K2HPO4和NaCl各水平的极差分别为3.194、3.662、0.841和1.740，因此，这4种成分对CN181菌株发酵的影响因素依次为：豆粕＞玉米粉＞NaCl＞K2HPO4。当发酵培养基中玉米粉的含量为15.0 g·L-1时，细菌数量最多（6.606×109CFU·mL-1），随着玉米粉含量的降低或升高，发酵液中的细菌数量均会降低；当发酵培养基中豆粕的含量为10.0 g·L-1时，细菌数量最多（7.209×109CFU·mL-1），随着豆粕含量的增加，细菌数量则降低；当发酵培养基中K2HPO4的含量为2.0 g·L-1时，细菌数量最多（6.023×109CFU·mL-1），发酵培养基中K2HPO4的含量低于2.0 g·L-1时，细菌数量就会降低，高于2.0 g·L-1时，也会降低；当发酵培养基中NaCl的含量为2.0 g·L-1时，细菌数量达最大值6.331×109CFU·mL-1，且变化趋势同K2HPO4。结果表明，该菌株最适生长的培养基组分配比为：玉米粉15.0 g·L-1、豆粕10.0 g·L-1、K2HPO42.0 g·L-1及NaCl 2.0 g·L-1。

2.3正交试验法对枯草芽孢杆菌CN181发酵条件的优化

影响枯草芽孢杆菌CN181发酵的3个条件的正交试验直观分析结果见表3。

表3　培养条件优化的正交试验结果Table 3 Results of orthogonal test for optimal culture conditions

由表3可知，在正交试验中，各优化条件极差的大小反映了这3个条件对CN181菌株繁殖影响的主次，极差越大，影响越显著。初始pH值、装液量和接种量各水平的极差分别为3.619、6.789和2.181，因此，这3个条件对CN181菌株发酵影响的主次因素依次为：装液量＞初始pH值＞接种量。在所测pH值范围内，当发酵培养基的初始pH值是8.0时，细菌数量最多，为8.778×109CFU·mL-1，初始pH值降低，则细菌数量减少；当250 mL三角瓶中发酵培养基的量为30 mL时，细菌数量达最大值11.658×109CFU·mL-1，随着装液量的增加，细菌数量的繁殖就会减少；当在发酵培养基中的接种量为2%时，细菌数量最多，为8.211×109CFU·mL-1，高于2%的接种量，发酵液中的细菌数量反而不会增加，接种量减小，同样也不利于该菌株的繁殖。由此表明，最适该菌株繁殖的发酵条件是：初始pH值8.0、装液量30 mL/250 mL三角瓶和接种量2%。

2.4摇床发酵温度和转速的优化

2.4.1培养温度的优化不同培养温度对枯草芽孢杆菌CN181菌株繁殖的影响结果见图4。由图4可知，在所测温度范围内，当培养温度为30℃时发酵液中的细菌数量最多，为13.093×109CFU·mL-1，培养温度高于30℃或低于30℃，发酵液中细菌数量均会减少。通过数据分析得出，发酵液中该菌株的数量在30℃和其余3个温度培养时在0.01水平上均具有极显著差异。因此，CN181菌株发酵的最适温度为30℃。

2.4.2摇床转速的优化不同摇床转速对枯草芽孢杆菌CN181菌株繁殖的影响结果见图5。由图5可知，在所测摇床转速范围内，当摇床转速为180 r·min-1、210 r·min-1和240 r·min-1时，发酵液中的细菌数量均较多，分别为13.338×109CFU·mL-1、14.408×109CFU·mL-1和12.684×109CFU·mL-1，仅150 r·min-1的转速培养时，发酵液中菌株的细菌数量较少。通过数据分析得出，摇床转速为180 r·min-1、210 r·min-1和240 r·min-1时，发酵液中细菌数量在0.01水平上不存在极显著差异，而与150 r·min-1的转速培养时在0.01水平上均存在极显著差异。因此，从菌量生长及节约能源的角度综合考虑，CN181菌株发酵的最适摇床转速为180 r·min-1。

图4　不同温度对菌株CN181发酵的影响Fig.4 Effects of different temperatures on the fermentation of CN181 strain

图5　不同转速对菌株CN181发酵的影响Fig.5 Effects of different rotation speed on the fermentation of CN181 strain

2.5最适发酵时间的优化

通过对枯草芽孢杆菌CN181菌株培养时间的测定，绘制了该菌株在玉米粉豆粕培养基和NA培养基中的生长曲线，结果见图6。通过图6可知，CN181菌株在摇瓶发酵时，初期NA培养基中细菌数量大于玉米粉豆粕培养基中的细菌数量，在16 h时，两种培养基中的细菌数量接近一致，16 h后，玉米粉豆粕培养基中的细菌数量继续增加，直至24 h时生长至最大值8.858×109CFU·mL-1，随后开始下降，进入衰亡期；而NA培养基中的细菌数量在16 h时已达最大值5.995×109CFU·mL-1，之后开始下降，进入衰亡期。综合发酵时间和发酵液中CN181菌株的繁殖数量来看，玉米粉豆粕培养基更适合枯草芽孢杆菌CN181菌株的生长，且最佳培养时间为24 h。

图6　菌株CN181在两种培养基中的生长曲线Fig.6 The growth curve of CN181 strain in two media

3　结论与讨论

培养基的组成和培养条件对枯草芽孢杆菌CN181菌株的生长繁殖有重要影响，为了提高CN181菌株的产菌量，通过单因素试验和正交试验相结合的方法，初步得到了摇瓶条件下枯草芽孢杆菌CN181菌株发酵的最佳培养基配方为：玉米粉15.0 g·L-1、豆粕10.0 g·L-1、NaCl 2.0 g·L-1、K2HPO42.0 g·L-1；最适发酵条件为：初始pH值8.0、250 mL摇瓶装液量30 mL、接种量2%、培养温度30℃、培养转速180 r·min-1、培养时间24 h。

研究结果表明，优化培养基中的碳源玉米粉和氮源豆粕与大多数研究者对枯草芽孢杆菌发酵培养基中碳源、氮源的研究结果一致，但在玉米粉和豆粕的用量上有所不同［12，15，18］，这表明：不同枯草芽孢杆菌对发酵液中C/N的要求不同。CN181菌株更适合在C/N较大的环境中繁殖。研究还发现，CN181菌株生长的最适金属离子为Na+和K+，这与前人的研究存在一定差异，王佳佳等［8］的研究仅选用了Na+；丁翠珍等［19］的研究表明，虽然Na+和K+都是其优化出的最佳金属离子，但其所选用的无机盐是KNO3，这与本研究中的K2HPO4有所不同；赵斌等［9］的研究则选用了KH2PO4和CaCl2等金属离子；刘雪等［20］的研究虽然选用了K2HPO4中的K+做为最适金属离子之一，但其还选用了Fe2+和Mg2+等金属离子作为发酵培养基中的复合金属离子，这表明：不同枯草芽孢杆菌对无机盐的需求有所不同；然而，章四平等［15］、张丽霞等［12，18］和李小俊等［16］的研究发现，CaCO3在枯草芽孢杆菌的发酵中是必不可少的无机盐类，张丽霞等还认为CaCO3对芽孢杆菌芽孢的形成及发酵液pH值的调节有重要作用。然而发酵条件对枯草芽孢杆菌繁殖的影响因不同菌株而异，通过与前人的研究相比发现：不同的菌株对pH值的要求差异较大，但多数菌株喜中性或偏碱的环境［8，9，12，16，19］，少数菌株喜偏酸的环境［15，21］；枯草芽孢杆菌多喜欢通气良好的环境；枯草芽孢杆菌对温度的要求多为28℃～32℃［8，9，12，15，19-21］，转速多为200 r·min-1左右［12，15，19，20］，对这两个条件的要求并无显著差异；而在培养时间的研究中发现，不同菌株对培养时间的要求存在显著差异，本研究的最佳培养时间为24 h，这与李小俊等［16］的研究一致，且在前人研究的最佳培养时间16 h～72 h范围内［8，15，16，19，21］。

本试验只是在摇瓶条件下对枯草芽孢杆菌CN181菌株的基础发酵培养基及发酵条件进行了初步探索，而对于该菌株的产芽孢量及其在发酵过程中所产生的抗菌物质（如抗菌蛋白或酶的活性及产量等），以及在发酵罐中的培养和实际生产中对发酵条件的控制方面尚待进一步探索，这将为该菌株的生防作用及工业化生产奠定基础。

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Optimizationof Fermentation ConditionsforEndophyticBacillus subtilisCN181

KANG Xing-jiao1，JIA Zhao-shan1，SHEN Hong-miao1，JIAO Wen-zhe1，RAN Long-xian1，2*，ZHEN Zhi-xian1*
1.College of Forestry/Hebei Agricultural University，Baoding 071001，China
2.Hebei Key Lab of Forest Germplasm Resources and Protection，Baoding 071000，China

To increase the population density of Bacillus subtilis CN181 in the broth，fermentation media and fermentation conditions of B.subtilis CN181 were screened and optimized by single factor and orthogonal tests in this study.The results from single factor experiment showed that the optimum carbon，nitrogen sources and metal ions were corn flour，soybean dregs，K+and Na+.The best medium was composed of corn flour at 15.0 g·L-1，soybean dregs at 10.0 g·L-1，K2HPO4at 2.0 g·L-1，and NaCl at 2.0 g·L-1based on the orthogonal test.Finally，the culture conditions were optimized as the following：the initial pH of the fermentation medium at 8.0，the liquid medium volume at 30 mL in a 250 mL flask，the inoculation volume at 2%（v/v），the fermentation temperature at 30℃，the rotation speed at 180 r·min-1and the fermentation time for 24 h.

Bacillus subtilis；endophytic bacteria；fermentation conditions

S852.61+6

A

1000-2324（2016）05-0647-07

2016-03-07

2016-06-06

国家公益性行业（农业）科研专项：果树霜霉病防控技术研究与示范（201203035）

康兴娇（1988-），女，河北省石家庄人，在读硕士生，主要从事林木病理学研究.E-mail：956293374@qq.com

Author for correspondence.E-mail：zhenzhixian@hebau.edu.cn；longxianran@163.com