银杏叶提取物对局灶性脑缺血大鼠血管内皮因子表达的影响

朱美娥，龚道恺

(华中科技大学同济医学院附属荆州医院，湖北 荆州 434000)



银杏叶提取物对局灶性脑缺血大鼠血管内皮因子表达的影响

朱美娥，龚道恺

(华中科技大学同济医学院附属荆州医院，湖北 荆州 434000)

目的探讨银杏叶提取物对大鼠局灶性脑缺血后神经行为及血管内皮因子(VEGF)表达的影响。方法采用线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型，将24只造模成功的SD大鼠随机分为模型组及银杏叶提取物低、中、高剂量组，每组6只，另选取正常大鼠6只作为假手术组。银杏叶提取物低、中、高剂量组分别给予银杏叶提取物注射液0.9，1.8，2.7 mL/100 g灌胃，假手术组及模型组给予1.8 mL/100 g生理盐水灌胃，均1次/d，连续14 d。通过平衡木实验评价大鼠的神经行为学改变，HE染色观察大鼠脑组织形态学变化，采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫组织化学法检测大鼠脑内VEGF mRNA以及蛋白的表达情况。结果灌胃7 d和14 d后，银杏叶提取物低、中、高剂量组的平横木实验测试评分均明显高于模型组(P均<0.05)，且银杏叶提取物中剂量组明显高于低剂量组和高剂量组(P均<0.05)；HE染色显示银杏叶提取物能改变脑组织缺血区的组织形态；模型组VEGF mRNA及蛋白表达量均明显高于假手术组(P均<0.05)，银杏叶提取物低、中、高剂量组VEGF mRNA及蛋白表达量均明显高于模型组(P均<0.05)，且银杏叶提取物中剂量组VEGF mRNA及蛋白表达量均明显高于低剂量组和高剂量组(P均<0.05)。结论银杏叶提取物能够改善局灶性脑缺血大鼠的神经功能，可能与上调大鼠脑组织中VEGF mRNA及蛋白的表达有关；银杏叶提取物对缺血性脑损伤的改善程度与给药剂量有关。

银杏叶提取物；局灶性脑缺血；血管内皮生长因子

脑血管疾病是临床常见病、多发病，其发病率、病死率及致残率有逐年上升的趋势，其中缺血性脑血管病占43%～65%[1]。脑缺血后，导致脑组织缺氧，缺血中心区细胞迅速死亡，半暗区神经细胞处于低氧、低灌注状态，及时恢复该区域血流供应有望改善患者的神经功能。而半暗区血流的恢复有赖于侧支循环的建立，血管再生是决定这些细胞存活的关键因素，与缺血后脑卒中患者的预后关系密切。在血管再生过程中，有众多因子参与调节，其中血管内皮生长因子(vasular endothelial growth factor,VEGF)是血管内皮细胞的特异性多功能因子，能够抑制内皮细胞的凋亡[2]，参与脑缺血后的病理修复过程，是已知作用最强和特异性最高的促血管生长因子[3]。现代药理学研究表明，银杏叶提取物能够清除自由基，拮抗血小板活化因子，而且具有抗脑细胞凋亡、促进脑内神经因子表达等作用，对心脑血管疾病具有明显疗效[4]。本研究以线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型，观察银杏叶提取物对脑缺血大鼠神经行为学、脑组织形态学及脑内 VEGF mRNA和蛋白表达的影响，探讨银杏叶提取物发挥脑保护的作用机制。

1　实验资料

1.1实验动物健康6～7周龄雄性SD大鼠50只，SPF级，体质量(260±20)g，购买自北京中医药大学实验动物中心。

1.2药品、试剂及主要仪器银杏叶提取物注射液(含银杏叶提取物17.5 mg/5 mL，北京悦康药业集团有限公司)；鼠抗人VEGF抗体(北京天根生化科技有限公司)；苏木素(Sigma公司，美国)；注射用青霉素钠(山东鲁抗医药股份有限公司)；10%水合氯醛；4%多聚甲醛；伊红染色液；0.9%氯化钠注射液；TP600 PCR扩增仪(TaKaRa，日本)；自动切片机(LEICARM2145，德国);全自动脱水机(LEICARASP300，德国)；CX41光学显微镜，(OLYMPUS，日本)。

1.3实验方法

1.3.1模型的建立随机取44只大鼠，参考Longa等[5]和朱继等[6]报道的线栓法建立局灶脑缺血大鼠模型：大鼠称质量后，按10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉；颈部正中切口，在颈总动脉深面穿一细线，钝性分离颈内、外动脉；提起该侧颈总动脉(CCA)，用眼科剪于CCA近分叉处剪一约0.2 mm的V型切口，将一直径约0.2 mm的尼龙线穿入颈内动脉(ICA)；然后将切口的远心端及动脉内的丝线牢固结扎，造成大脑中动脉栓塞模型。以上过程均在恒定室温(24～25 ℃)情况下进行，以利于评价脑缺血程度。剩余6只大鼠作为假手术组，除插线1 cm外，其余步骤同造模组。

1.3.2实验动物分组及给药将造模成功的24只大鼠随机分为模型组和银杏叶提取物低、中、高剂量组各6只。手术造模成功后24 h，银杏叶提取物低、中、高剂量组分别给予银杏叶提取物注射液0.9，1.8，2.7 mL/100 g灌胃，假手术组及模型组给予1.8 mL/100 g生理盐水灌胃，均1次/d，连续14 d,末次灌胃24 h后取标本。

1.3.3神经行为学评分分别在术后24 h及灌胃7 d、14 d，参考Feeney等[7]大鼠平衡木实验(Beam walking test,BWT)评价大鼠精细运动功能情况。根据大鼠是否能够顺利爬过横木及瘫痪侧肢体起作用的情况评定，BWT评分为1～7分。

1.3.4脑组织病理学观察灌胃14 d后，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 mL/100 g)，断头处死，冰盘上迅速完整剥取脑组织，浸入4%多聚甲醛固定液中，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，4μm厚冠状连续切片进行HE染色，光镜下观察脑组织形态学改变。

1.3.5VEGF mRNA表达检测采用RT-PCR法检测。引物合成：引物设计参考Gene-bank数据库， VEGF基因：上游5’-GTAACCTAGGCCTGTGAACCGTGG-3’，下游5’-GCATCCTTGCATGCGCTTGCATGG-3’,DNA扩增全长为341 bp；内参引物序列β-actin：上游5’- CAGGATGCAGAAGGAGATTA-3’，下游5’-ATCCACATCTGCTG GAAG-3’，DNA扩增全长为265 bp。采用Trizol一步法提取脑组织总RNA。取10 μL PCR反应产物，在2.0%琼脂糖凝胶上电泳(50 V，45 min)，置于紫外透射仪下照相。应用Image J软件对RT-PCR电泳结果进行灰度分析，按照以下公式计算VEGF mRNA的相对表达量：产物含量=目的基因的光密度值/β-actin的光密度值×100%。

1.3.6VEGF蛋白表达检测对组织切片进行常规脱蜡和抗原修复，按试剂盒说明书进行免疫组化染色，采用ABC法。以PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性片作阳性对照，VEGF主要在细胞质表达。采用Image Pro Plus医学图像分析系统进行图像分析，测出阳性反应细胞的积分光密度(IOD)。

2　结　　果

2.1各组大鼠神经行为学评分灌胃7 d和14 d后，模型组BWT评分均明显低于假手术组(P均<0.05)，银杏叶提取物低、中、高剂量组大鼠BWT评分均显著高于灌胃前及模型组(P均<0.05)，且银杏叶提取物中剂量组高于低剂量和高剂量组(P均<0.05)。见表1。

2.2各组大鼠脑组织形态学表现假手术组脑组织神经细胞核呈蓝紫色，细胞膜及核膜清晰，核仁明显，无水肿表现，见图1。而模型组脑组织明显水肿，而且神经元变性坏死明显，神经元呈现肿胀或皱缩状态，核仁基本消失，胞浆呈强烈嗜伊红性，胞浆与核膜边界不清，可见较多炎性细胞浸润，见图2。银杏叶提取物低、中、高剂量组脑组织神经细胞水肿程度及胞浆浓缩较模型组均明显减轻，其中以银杏叶提取物中剂量组减轻最为明显，见图3～5。

表1　各组大鼠神经行为学评分比较±s，分)

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与灌胃前比较，P<0.05；③与模型组比较，P<0.05；④与银杏叶提取物中剂量组比较，P<0.05。

图1　假手术组大鼠脑组织形态学表现(×200)

图2　模型组大鼠脑组织形态学表现(×200)

图3　银杏叶提取物低剂量组大鼠脑组织形态学表现(×200)

2.3各组大鼠VEGF mRNA半定量假手术组VEGF相对表达量为2.854 9±0.154 9，模型组为4.537 2±0.684 2，银杏叶提取物低剂量组为11.427 0±0.224 2，银杏叶提取物中剂量组为18.9857±0.1983，银杏叶提取物高剂量组为12.2013±0.243 6。模型组VEGF mRNA表达量明显高于假手术组(P<0.05)，银杏叶提取物低、中、高剂量组VEGF mRNA表达量均明显高于模型组(P均<0.05)，且银杏叶提取物中剂量组VEGF mRNA表达量均明显高于低剂量组和高剂量组(P均<0.05)。

图4　银杏叶提取物中剂量组大鼠脑组织形态学表现(×200)

图5　银杏叶提取物高剂量组大鼠脑组织形态学表现(×200)

2.4各组大鼠VEGF蛋白表达情况假手术组VEGF蛋白表达IOD值为208.65±39.58，模型组为408.47±34.21，银杏叶提取物低剂量组为685.13±94.22，银杏叶提取物中剂量组为917.78±85.24，银杏叶提取物高剂量组为746.48±83.49。模型组VEGF蛋白表达量明显高于假手术组(P<0.05)，银杏叶提取物低、中、高剂量组VEGF蛋白表达量均明显高于模型组(P均<0.05)，且银杏叶提取物中剂量组VEGF蛋白表达量均明显高于低剂量组和高剂量组(P均<0.05)。

3　讨　　论

脑中风是目前危害人类健康的重要疾病之一，联合国世界卫生组织曾调查57个国家死亡人群，结果显示死于脑血管病者竟高达11.3%。在我国，脑血管病、心脏病及癌症是造成患者死亡的三大疾病，而脑血管病居三大死因之首[8]。我国每年有急性脑血管病例约150万，缺血性脑中风是最主要的原因[9]。

缺血性脑中风之所以发生是因为血管阻塞后造成局部脑血流量减少，从而对神经组织造成损伤。脑缺血后半暗区的神经细胞处于低氧状态，神经细胞凋亡，而及时恢复半暗区的血流供应，抑制脑部神经细胞凋亡可改善患者的神经功能[10]。VEGF是由2个相同亚基组成的一种多功能促血管内皮细胞生长因子，具有促进内皮细胞增殖，诱导血管生成，抗血栓，抗内皮细胞损伤和凋亡以及神经保护等作用，在胚胎发育、缺血性心脑血管疾病的发病和防治中具有重要意义。在缺氧缺血条件下，机体组织VEGF表达上调，其作用机制可能为：缺氧诱导因子(HIF-1)诱导启动VEGF的转录，氧气和生长因子可以调节HIF-1，从而激活正常的缺氧感受基因，使得VEGF表达增加；缺氧能显著延长VEGF mRNA在体内的半衰期，从而间接提高VEGF的生理活性[11]。随着人们对局灶性脑缺血病研究的深入，VEGF在缺血性脑中风中的作用逐渐成为人们研究的热点。

中医认为缺血性脑中风的基本病机为肾精亏虚，瘀血阻窍。银杏叶是中国传统名贵中药材之一，具有两千多年的应用历史。有医书记载银杏叶提取物具有活血化瘀、通络等功效，从上个世纪60年代开始，国内外众多学者开始对银杏叶的化学成分及药理作用进行研究。20世纪80年代研究人员发现银杏叶提取物具有抗缺氧、抗脑水肿和改善脑功能等作用，从而广泛应用于脑缺血等疾病中。现代研究表明，银杏叶提取物中主要化学成分为黄酮苷(24%)和萜类内酯(6%)，具有清除氧自由基、拮抗血小板活化因子、抑制一氧化氮合酶、改善能量代谢障碍、拮抗兴奋性氨基酸毒性等作用，从而对脑缺氧缺血起到保护作用[12-14]。然而，银杏叶提取物对局灶性脑缺血疾病的修复以及VEGF基因表达的影响鲜有报道。

本研究结果显示，银杏叶提取物能明显改善脑缺血大鼠的神经功能，而且中剂量银杏叶提取物对大鼠的神经功能改善情况最为显著；通过对大鼠脑内VEGF mRNA和蛋白的表达检测证明，银杏叶提取物能显著上调VEGF mRNA和蛋白的表达水平，而且中剂量银杏叶提取物效果最好，这与银杏叶提取物对大鼠神经功能改善结果一致；大鼠脑组织HE染色结果证实银杏叶提取物能改善急性脑缺血大鼠神经功能损伤，减轻急性脑缺血时脑组织缺血区的组织形态学改变。以上结果说明银杏叶提取物能够改善局灶性脑缺血大鼠的神经功能，可能与上调大鼠脑组织中VEGF mRNA及蛋白的表达有关；此外银杏叶提取物对缺血性脑损伤的改善程度与给药剂量有关。

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Effects of Ginkgo Biloba extract powder on expression of VEGF in brain tissue after focal cerebral infarction in rats

ZHU Meie,GONG Daokai

(Jingzhou Hospital Affiliated to Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Jingzhou 434000,Hubei,China)

Objective It is to observe the effects of Ginkgo Biloba extract powder on neurobehavior and expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA and protein in brain tissue of rats after focal cerebral infarction.Methods The ischemic models were established with line embolism method.24 successful modeling Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into model group,Ginkgo Biloba extract powder groups (low,middle and high dosage),each group had 6 rats,and 6 normal rats were selected as sham operation group for comparison.Low,middle and high dosage of Ginkgo Biloba extract groups were given Ginkgo Biloba extract injection 0.9,1.8,2.7 mL/100 g respectively by lavage,while sham operation group and model group were given normal saline by lavage once per day.All the treatments lasted for 14 days.Beam walking test was adopted to evaluate the SD rat's neural behavior and HE staining was used to observe the rat brain morphological changes.VEGF mRNA and proteins expression were measured by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemical methods respectively.Results The scores of Ginkgo Biloba extract powder groups(low,middle,high dosage)were respectively higher than that in model group after 7 and 14 days' treatment(P<0.05),and the scores in middle dosage group were higher than that in low or high dosage groups (P<0.05).The result of HE staining showed that Ginkgo Biloba extract powder could change the brain morpholody of rats.The expressions of VEGF mRNA and protein in model group was higher obviously than that in sham operation group (P<0.05),the expressions of VEGF mRNA and protein in Ginkgo Biloba extract powder groups(low,middle,high dosage)were respectively higher than that in model group (P<0.05),and the expression in middle dosage group was higher than that in low or high dosage groups (P<0.05).Conclusion Ginkgo Biloba extract powder could improve neurogenic function and up-regulate the expressions of VEGF in rats with focal cerebral ischemia,which may be a main mechanism of its neuroprotection against cerebral ischemia injury,and the improving effects were related with therapy dosage.

Ginkgo Biloba extract powder; focal cerebral infarction; vascular endothelial growth factor

朱美娥，女，硕士，主治医师，主要从事脑血管病及周围神经病诊治工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.28.009

R-332

A

1008-8849(2016)28-3107-04

2015-12-12