益生菌促进阿卡波糖降低糖尿病小鼠餐后血糖的研究

钟丹，殷瑜，戈梅，钱秀萍

益生菌促进阿卡波糖降低糖尿病小鼠餐后血糖的研究

钟丹，殷瑜，戈梅，钱秀萍

目的 研究四联益生菌对阿卡波糖降低糖尿病小鼠餐后血糖作用的影响。

方法 高脂饲料喂养 4 周的小鼠腹腔注射链脲佐菌素（STZ）造模，随机血糖大于 16.7 mmol/L 即视为糖尿病造模成功。造模成功的小鼠灌胃四联益生菌（嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌及地衣芽孢杆菌）各 109cfu/d，3 周后，考察益生菌是否具有促进阿卡波糖降低糖尿病小鼠餐后血糖的作用。并通过检测小鼠血清胆固醇、甘油三酯、胰岛素及胰高血糖素样肽-1（GLP-1）水平，研究益生菌对小鼠糖尿病的改善作用。

结果 单独给以低剂量阿卡波糖 30 mg/kg 或四联益生菌均无明显降低餐后血糖的作用，但两者联合给药组小鼠餐后1 ～ 2 h 血糖值明显低于的糖尿病组及单独给以阿卡波糖或益生菌组。四联益生菌组小鼠血清 TG 水平明显低于糖尿病组，而 GLP-1 水平则明显高于糖尿病组，两组间血清胆固醇及胰岛素无显著性差异。

结论 四联益生菌具有促进阿卡波糖降低糖尿病小鼠餐后血糖的作用，这种促进作用可能跟益生菌改善甘油三酯及GLP-1 的水平有关。

糖尿病； 阿卡波糖； 小鼠，肥胖； 益生菌； 胰高血糖素样肽 1

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2016, 11(5):441-445

糖尿病是一类以长期高血糖为特征的代谢性疾病，由基因、环境、生活习惯等多种因素引起，严重威胁人类的健康［1］。目前治疗的药物主要有胰岛素增敏药、促胰岛素分泌药物及 α-葡萄糖苷酶抑制剂等［2］。其中，α-葡萄糖苷酶抑制剂是临床常用于 II 型糖尿病治疗的药物，它通过竞争性抑制小肠上皮绒毛膜刷状缘的葡萄糖苷酶活性，抑制淀粉、蔗糖、麦芽糖的分解，使葡萄糖的生成和吸收减缓，从而降低餐后血糖峰值。目前已用于临床的该类药物有阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等，但临床使用中会产生药物耐受，且有腹泻、胃肠道不适等不良反应，因此，需要寻找具有协同降糖作用的药物或减轻副作用的方法。

越来越多的研究表明，肠道菌群的失衡与糖尿病的发生有着密切的关系［3］，益生菌已被证明是治疗胰岛素抵抗的有效辅助方法。临床实验显示长双歧杆菌［4］、嗜酸乳杆菌［5-6］及鼠李糖乳杆菌［7-8］等益生菌在改善肠道微生态平衡的同时，具有降低体内促炎性因子，改善胰岛素与胰高血糖素样肽水平，增加葡萄糖耐量与胰岛素敏感性等糖尿病症状改善的作用。

本研究通过动物体内实验，考察四联益生菌与阿卡波糖联合改善糖尿病小鼠餐后血糖的可行性，期望降低阿卡波糖的给药剂量，缓解其副作用，为治疗糖尿病提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性 C57/BL 小鼠，3 周，CL级，购于上海斯莱克实验动物有限公司。自由摄食、进水，12 h 灯光昼夜循环，室温 25 ℃，相对湿度55% ± 5%，实验过程环境稳定，小鼠适应环境 4 d后随机分组。实验动物所有喂养程序由上海交通大学实验动物中心管理，经上海交通大学动物伦理和使用委员会（IACUC）审批。

1.1.2 菌株 嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus，HCCB20535），鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus，HCCB20555），长双歧杆菌（Bifidobacterium longum，HCCB20558），地衣芽胞杆菌（Bacillus icheniformis，HCCB20544）。

1.1.3 药品、试剂与饲料 链脲佐菌素（STZ）购自上海谱振生物科技公司；高脂高糖饲料（HFD）（10% 猪油、10% 蔗糖、2.0% 胆固醇、0.5% 猪胆酸盐、77.5% 常规饲料）购自上海普路腾生物科技有限公司；小鼠胰高血糖素样肽-1（GLP-1）ELISA检测试剂盒和小鼠胰岛素 ELISA 检测试剂盒均购自上海铭睿生物；SYBR®PrimeScript™ Real Time-PCR Kit购自 Tiangen 公司。

1.1.4 仪器 安稳免调码血糖仪为三诺生物传感股份有限公司产品；HZQ-QX 全温振荡器为哈尔滨东联电子技术开发有限公司产品；Catalyst Dx®动物专用干式生化分析仪为美国 IDEXX Laboratories公司产品；Onestep Q-PCR 仪为美国 Thermo Fisher Scientific 公司产品；酶标仪为美国 Biotek 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠糖尿病造模 雄性 C57/BL 小鼠高脂高糖饲料喂养 4 周后，腹腔注射 STZ 150 mg/kg（pH 4.2 柠檬酸缓冲液溶解），随机血糖值 ＞16.7 mmol/L 即视为糖尿病造模成功。

1.2.2 动物分组及喂养方式 3 周大的雄性C57/BL 小鼠适应环境 4 d 后分为正常组（普通饲料喂养，不注射 STZ）与糖尿病造模组（高脂高糖饲料喂养 4 周，腹腔注射 STZ）；造模成功的小鼠分为益生菌组及生理盐水组，益生菌组小鼠连续灌胃益生菌，生理盐水组每日灌胃生理盐水；3 周后将生理盐水组 12 只小鼠随机分为两组，分别记为模型对照组 D 及阿卡波糖对照组 A，将益生菌组12 只小鼠随机分为两组，分别记为益生菌组 P 及阿卡波糖 + 益生菌组 AP，具体方案见图 1。

益生菌促进阿卡波糖降糖作用实验前，所有小鼠禁食 16 h，自由给水，实验时以 2 g/kg 剂量给各组小鼠灌胃淀粉溶液，同时灌胃药物，用血糖仪检测空腹血糖（FBG）和餐后 1 h、2 h 血糖（PBG）值。各组灌胃药物设置如下：正常组（N 组）：生理盐水溶液；糖尿病组（D 组）：生理盐水溶液；阿卡波糖组（A 组）：阿卡波糖 30 mg/kg；益生菌组（P 组）：益生菌液 4 × 109cfu/只；阿卡波糖 + 益生菌组（AP 组）：阿卡波糖 30 mg/kg，益生菌液4 × 109cfu/只。

1.2.3 血液中相关指标检测 益生菌促进作用考察结束后，次日使用离心管收集各组小鼠血液，3000 r/min 离心 15 min，将血清和血细胞迅速小心分离，制备血清样本。用干式血液生化分析仪测定血清中胆固醇、甘油三酯浓度。取血清样本进行相应 ELISA 检测试剂盒检测，按试剂盒说明书操作测定胰岛素、GLP-1 水平。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 益生菌对阿卡波糖降低糖尿病小鼠餐后血糖的促进作用

如表 1 所示，D、A、P 及 AP 组餐后 1 h 和2 h 血糖均明显高于 N 组，即糖尿病小鼠对餐后血糖代谢能力较差；A 组及 P 组餐后血糖与 D 组间无明显差异；AP 组餐后 1 h 及 2 h 血糖均明显低于 D 组，差异显著。即四联益生菌具有促进阿卡波糖降低餐后血糖的作用。

2.2 灌胃益生菌对糖尿病小鼠血清胆固醇、甘油三酯水平的影响

如图 2A 所示，糖尿病小鼠（D、A、P、AP）血清胆固醇含量均明显高于正常小鼠；连续给益生菌（P、AP）小鼠血清胆固醇含量略低于未给益生菌的糖尿病小鼠（D、A），但无显著性差异。

图 2B 中可见，D、A 组的糖尿病小鼠血清甘油三酯含量明显高于正常小鼠；而持续灌胃益生菌（P、AP）后，血清甘油三酯含量相较糖尿病小鼠（D、A）明显降低，P ＜ 0.05。

图1 动物实验分组及喂养方式Figure 1 Grouping and feeding mode of animal experiment

表 1 益生菌对阿卡波糖降低餐后血糖的促进作用（mmol/L）Table 1 Effect of probiotics on reducing postprandial blood glucose of acarbose （mmol/L）

图2 益生菌对糖尿病小鼠血清胆固醇（A）及甘油三酯（B）的影响Figure 2 Effect of probiotics on the level of plasma cholesterol （A） and triglyceride （B） in diabetic mice

图3 益生菌对小鼠血清胰岛素水平（A）、GLP-1（B）水平的影响Figure 3 Effect of probiotics on the level of insulin （A） and GLP-1 （B） in diabetic mice

糖尿病通常伴有血脂（胆固醇、甘油三酯为主）代谢异常，高血脂是引起动脉粥样硬化发生的重要因素，因此胆固醇、甘油三酯水平的降低有助于缓解糖尿病心血管并发症发生的危险。

2.3 灌胃益生菌对糖尿病小鼠血清胰岛素、胰高血糖素样肽-1 含量的影响

糖尿病尤其是 II 型糖尿病多为胰岛素相对不足，即机体产生胰岛素抵抗。而 GLP-1 可刺激胰岛 β 细胞增殖和胰岛素分泌，且具有抑制 β 细胞凋亡，提高肌肉、肝脏细胞对胰岛素敏感性的作用［9］。因此，检测益生菌对糖尿病小鼠上述指标的影响将有助于阐释益生菌促进阿卡波糖降餐后血糖的作用机制。

由图 3A可见，D、A、P 及 AP 组小鼠血清胰岛素水平均显著高于正常小鼠（N），P ＜ 0.05。灌胃益生菌 3 周的糖尿病小鼠（P、AP）胰岛素水平相较未给菌的糖尿病小鼠（D、A）并无显著差异。

由图 3B 可见，D、A 组小鼠血清 GLP-1 水平明显低于 N 组，P ＜ 0.01；长期灌胃益生菌的 P、AP 组 GLP-1 水平同样低于 N 组，但明显高于未给菌的 D、A 组，P ＜ 0.05。表明长期食用益生菌具有提高糖尿病小鼠 GLP-1 水平的作用。

3 讨论

糖尿病已成为全球性的健康问题，阿卡波糖作为临床常用的糖尿病口服治疗药物，能够有效降低餐后血糖，且不易导致低血糖，但容易产生耐药及肠功能紊乱等副作用，本研究从改善肠道微生态出发，探讨益生菌促进阿卡波糖降血糖作用的可行性。结果显示，单独给予益生菌并未降低餐后血糖，当与低剂量（30 mg/kg）的阿卡波糖联用后，其降低餐后血糖的效果显著优于单用该剂量的阿卡波糖。益生菌的添加不仅具有降低阿卡波糖用量的作用，而且益生菌本身还具有胃肠功能改善的活性。

本研究中，灌胃益生菌 3 周后改善了糖尿病小鼠血清甘油三酯水平，并显著提高了血液中GLP-1 水平。研究表明，GLP-1 是一种重要的肠促胰岛素，可刺激进食后的胰岛素分泌，发挥葡萄糖依赖性降糖作用［10］，并且可以增加胰岛素敏感性［11］，对 II 型糖尿病的发生发展有重要的影响。因此，本研究中益生菌对糖尿病的改善作用可能与调节甘油三酯及 GLP-1 水平有关。同时，据报道，某些乳酸菌本身也具有 α-葡萄糖苷酶抑制活性［12］，本文中益生菌促进阿卡波糖的降糖机制是否还跟α-葡萄糖苷酶抑制剂活性的叠加或协同有关，仍有待进一步研究。

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Objective To evaluate the effect of four-combination probiotics on reducing postprandial blood glucose of acarbose in diabetic mice.

Methods The mice were fed with diet enriched with high glucose and high fat， and after 4 weeks streptozotocin （STZ） was injected intraperitoneally. The criteria for the successful modelling was random blood sugar （RBS） aboved the cutoff value （16.7 mmol/L）. The probiotics group mice were given orally four-combination probiotics （Lactobacillus acidophilus， L. rhamnosus, Bifidobacterium longum, Bacillus icheniformis）， after 3 weeks their promotion on hypoglycemic activities to acarbose in diabetic mice were assayed. At the end of the experimental period， triglyceride， total cholesterol， insulin and GLP-1 in the plasma were determined.

Results Neither four-combination probiotics nor 30 mg/kg acarbose alone showed obvious hypoglycemic activity in mice. But when 30 mg/kg acarbose combined with probiotics was administrated， postprandial blood glucose of probiotics group mice was reduced more than that of the control group with no drug. Plasma triglyceride was significantly lower in probiotics group than that in diabetic group， while the GLP-1 levels of probiotic group was significantly higher than that of diabetic group. The levels of cholesterol and insulin were not significantly different between the two groups.

Conclusion Hypoglycemic function of acarbose is significantly promoted by probiotics， probably because of the improvement of plasma GLP-1 and triglyceride levels.

Author Affiliation： School of Pharmacy， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200240， China （ZHONG Dan， YIN Yu， QIAN Xiu-ping）； Shanghai Laiyi Center for Biopharmaceutical R&D， Shanghai 201203， China （YIN Yu， GE Mei）

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2016, 11(5):441-445

Study on the reduction of postprandial blood glucose with acarbose promoted by four-combination probiotics in diabetic mice

ZHONG Dan， YIN Yu， GE Mei， QIAN Xiu-ping

Diabetes mellitus； Acarbose； Mice， obese； Probiotics； Glucagon-like peptide 1

QIAN Xiu-ping， Email： qianxp@sjtu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.05.010

200240 上海交通大学药学院（钟丹、殷瑜、钱秀萍）；201203上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司（殷瑜、戈梅）

钱秀萍，Email：qianxp@sjtu.edu.cn

2015-10-12