化妆品安全性评价替代试验的研究进展及思考

罗飞亚，王钢力，邢书霞，苏哲，王佑春

化妆品安全性评价替代试验的研究进展及思考

罗飞亚，王钢力，邢书霞，苏哲，王佑春

化妆品的安全性评价是保障化妆品质量安全的重要环节。在我国，化妆品作为一种健康相关产品，实行上市前产品的许可备案管理制度［1-2］。我国的化妆品安全性评价体系包括：经典的毒理学试验、体外遗传毒性试验和人体安全性试验。像眼刺激性、皮肤刺激性、皮肤致敏性等化妆品安全性评价中关键的毒理学终点，以整体动物试验为主［3］。

1959 年，英国科学家首先提出动物福利和动物保护的“3R”（reduction、refinement、replacement）原则，即在科学研究中不断减少、优化、替代动物试验［4］。随着科技的不断进步，细胞、分子等生物学手段被引入到现代毒理学研究中，新的体外研究方法如计算机模拟毒性当量、体外重建的组织器官、人的永生化细胞系等检测方法在逐步替代传统的动物实验［5-6］。近年来，非动物检测方法的呼声越来越高，尤其是在化妆品安全性评价中。从科学的角度来看，动物皮肤及角膜无论在生物学构造还是生理功能方面都与人的皮肤和角膜存在差异，以动物试验模拟人实际使用化妆品的情况存在种属间的偏差；某些局部毒性的经典毒理学试验如眼刺激、皮肤刺激性（腐蚀性）的家兔试验，检测方法的评分标准较为主观，不如体外的人工角膜、人工皮肤模型的结果精准客观［7-9］。从法规要求来看，随着欧盟化妆品动物试验禁令的实施，使用非动物试验进行化妆品安全评估成为了越来越多的国家和地区努力实现的目标。

1 不同国家、地区的体外替代方法起源及管理现状

2003 年 1 月，欧盟规定：自 2009 年 3 月 11 日起禁止使用动物进行化妆品急性毒性、眼刺激和过敏试验，自2013 年 3 月 11 日起全面禁止在动物身上进行化妆品和原料的安全性测试，不允许成员国从外国进口和销售违反上述禁令的化妆品，并列入 WTO 双边协议。这一动物实验禁令的提出，加快了全世界在化妆品领域对替代方法研究的步伐。

美国自 20 世纪开始的国家毒理计划（national toxicology program，NTP）也一直致力于毒理检测方法的改进和研究。其“21 世纪毒性试验：远景与策略”报告中指出传统的毒理学正经历着巨大的挑战和改革，未来的毒性检测策略将以研究毒性机制和靶向测试为核心，方法逐渐由当前的体内试验转变为体外试验，重点发展以现代生物学为基础、涵盖广泛量效关系的、高效的体外测试方法［10］。

2009 年，美国、加拿大、日本和欧盟签署了替代方法国际合作协议（International Cooperation on Alternative Test Methods，ICATM），2011 年韩国也加入了该协议。此后几年内，欧盟、美国、日本、韩国、巴西等国家和地区都纷纷成立了相应的体外科学研究中心，如美国机构间替代方法评价协调委员会（ICCVAM）、欧盟欧洲替代动物方法核心实验室（EURL-ECVAM）以及日本替代试验验证中心（JaCVAM）等。经过替代方法验证中心认可的试验方法，可以申请纳入世贸经合组织（OECD）、人用药物注册技术要求国际协调会（ICH）、国际化妆品监管合作组织（ICCR，主要参与成员包括美国、欧盟、日本和加拿大的相关职能机构）或其他国家、地区的法规标准，在世界范围内被广泛认可。迄今为止，世界上已经明令禁止或正在讨论禁止化妆品动物试验的国家和地区有：欧盟、英国、挪威、巴西、土耳其、韩国、印度、新西兰、以色列、瑞士、美国、俄罗斯、澳大利亚、加拿大、阿根廷、越南和中国台湾等。有些国家虽未立法禁止动物试验，但是设立了专门的替代方法研究中心，比如日本。有些国家虽未设立专门的替代方法研究中心，但其政府部门有专门的科研经费和基金用于替代试验相关的研究，或者通过跨国合作的方式与美国、欧盟的替代试验研究中心合作，进行替代方法的验证和研究，或者通过网络平台分享和交流替代方法，比如加拿大、德国、澳大利亚和新西兰。

从化妆品禁令的模式来看，有像欧盟禁令这样一刀切式的全面禁止化妆品及原料领域中所有动物试验的模式，也有根据科学的发展，只在有其他优选方案的情况下禁止动物试验的模式。还有很多国家虽无法规要求禁止动物试验，但在化妆品安全评价中可自由选择是否采用替代方法。

2 体外替代方法的研究进展及使用策略

需要指出的是，所谓的“替代方法”，是对英文“alternative methods”的直接翻译，但其意义应该是指“最优选的方法”，而不仅仅是追求“替代”原有的动物试验。研究“化妆品动物体外替代试验”，是为了寻找更精确、一致性更高、更灵敏、更经济的优选方法，并且这些“优选方法”首先需要符合动物“3R”的减少、优化、替代原则。

欧盟的联合研究中心（JRC）和美国的国家毒理计划（NTP）均一直致力于替代试验的开发、验证和推广工作。替代试验的研发思路由最开始的以离体器官、屠宰场废料、鸡胚等取代整体动物的方法，发展至体外细胞系试验、重建人体组织（眼角膜、皮肤模型）为研究对象的方法，再发展至以微生理为基础的“human-on-chips”或者称为“lab-on-chips”的芯片技术，以及以计算机技术为基础的定量构效关系（QSAR）。

化妆品安全性评价中，经过验证的评价局部毒性替代方法较多，包括皮肤刺激（腐蚀）性、眼刺激（腐蚀）性、皮肤光毒性、皮肤致敏性等，可以实现通过单一方法或几种替代方法组合的策略评价化妆品及其配方、原料的安全性，且在评价过程中完全不使用整体动物试验。但是在全身毒性试验方面（遗传毒性、致癌性、胚胎毒性等），至今还没有可以完全取消动物试验的策略，尤其是亚急性和长期毒性的评估中，仍然依赖整体动物试验来提供可靠的数据。根据替代方法的研究和使用经验，科学界逐步形成了根据特定的毒理学终点，“自上而下”或“自下而上”地有序选择一系列试验形成“组合策略”，达到有效筛选毒性的目的。例如评价一个受试物的眼刺激性，可以从评价腐蚀性的试验开始，一直测到评价刺激性的试验结束，或反过来检测。组合策略可以高效快速地筛选出结果，也可以弥补单一试验的局限性问题。近一两年的 OECD 化学品检验指南中，每一个试验更新版的名称由原来仅有方法名称调整为增加试验目的及适用条件的形式［11］，更加方便进行选择。

3 体外替代方法的验证和使用情况

美国 ICCVAM、欧盟 ECVAM、日本 JaCVAM 和OECD 化学品检验指南的官方网站上收录了一系列的体外方法，我们对其中适用于化妆品的安全评价的试验验证进展进行了总结，其具体内容见表 1。

3.1 眼刺激（腐蚀）性试验

眼部毒性的试验方法研究的很多，可用的替代方法也很多。OECD 认可的试验就有 5 个：牛眼角膜渗透性通透性试验（BCOP）［12］、离体鸡眼试验（ICE）［13］、细胞培养型的荧光素渗漏试验（FL）［14］、体外短时间暴露试验［15］、重组人角膜组织试验［16］，还有一个正在验证中的细胞传感器微生理仪试验（CM）。除 OECD 和美国已经验证的方法外，欧盟 ECVAM 验证过的方法还有鸡胚尿囊膜-绒毛膜试验（HET-CAM）、红细胞溶血法（RBC）、中性红释放法和离体兔眼法。目前，国际上最常用的方法是 BCOP，但由于东方人的饮食习惯和宗教信仰等原因获取牛角膜有一定难度，加上科学研究发现，猪眼角膜在生理及反应结果方面与人角膜更为接近，因此也开始有利用猪眼角膜进行渗透性通透性试验的研究［17-19］。

眼刺激（腐蚀）性试验中，单一的替代方法是无法完全涵盖整体动物试验所适合的所有刺激性等级范围以及所有种类的物质和产品的，也无法覆盖动物试验的损伤及炎症的标准范围。由于每一个替代方法均有其局限性，因此通常采用组合策略，来实现完全覆盖动物试验所显示的刺激性范围［6］。

眼刺激（腐蚀）性的替代方法研究思路从最初的离体眼球类的试验（离体兔眼、离体鸡眼）发展到利用屠宰场废料的 BCOP 试验，从模拟眼睛毛细血管网络的鸡胚尿囊膜-绒毛膜试验，发展到体外细胞系试验（荧光素渗漏试验、短时暴露试验、细胞传感微生理试验）再到体外重组人体角膜试验，其发展历程充分体现了减少、优化、替代的“3R”原则。

3.2 皮肤刺激（腐蚀）性试验

目前，OECD 认可的皮肤刺激（腐蚀）性的替代试验只有 3 类：大鼠经皮电阻试验（TER）［20］、体外皮肤刺激性和腐蚀性的重组人表皮模型试验（RHE）［21-22］和体外皮肤腐蚀性膜屏障试验［23］。其中人工皮肤模型类的试验因其使用的试验材料为体外培养的人永生化细胞系，模拟表皮和真皮的生理结构进行培养，所以结果与人体结果的相关度较高，很多化妆品企业选择皮肤模型进行产品的研发和质量控制，为了可以筛选到刺激性更小的产品，如婴儿无泪沐浴产品等。但 OECD 的标准中认可的皮肤模型仅有 4 种（Episkin、EpiDerm、SkinEthic 和 epiCS）［21-22］，均为国外生产的，如在我国使用，培养和运输成本将提高。由于皮肤模型属于生物活性材料，运输和使用的日期将直接影响检测结果的准确性。体外皮肤腐蚀性膜屏障试验主要用于评价可透皮吸收的化妆品原料的腐蚀性。大鼠经皮电阻试验方法（TER）可以满足评价皮肤腐蚀性的需要，但因为其试验材料是实验大鼠的背部皮肤，因此该方法只能算对传统动物试验的优化，不能满足化妆品动物试验禁令的法规要求。

3.3 皮肤致敏性试验

皮肤致敏性的替代试验主要有 OECD 于 2010 年发布的一系列小鼠局部淋巴结细胞试验（LLNA、LLNA：DA、LLNA：BrdU-ELISA）［24-25］，以及 2015 年新增加的两个体外方法——致敏性化学测试方法（KeratinoSens）［26］和体外直接反应肽试验（DPRA）［27］。在 2015 年以前，小鼠局部淋巴结试验（LLNA）是最为普遍使用的致敏性试验，但其试验材料为试验小鼠的淋巴结细胞，因此该系列方法被认为是对传统动物试验的优化。在科学家的不断努力下，已有很多过敏反应毒性机制的研究，2015 年新增的化学法和直接反应肽试验就是基于过敏反应机制的方法，经过多年验证后发布的体外试验方法。此外，LLNA：BrdU-Flow Cytometry的方法是对 LLNA：BrdU-ELISA 方法中发光物质 BrdU检测手段的改进。人细胞系 h-CLAT 法、IL8 Luciferase法和 Myeloid U937 法，也都是基于过敏机制设计的体外方法。

3.4 皮肤光毒性

国际上普遍认可的皮肤光毒性体外试验，仅 3T3 细胞中性红摄取试验一种（3T3 NRU）［28］。日本动物替代试验研究中心还发布了 2 个试验方法：活性氧试验（ROS）和酵母红细胞试验（Yeast-RBC），但目前没有其他国家和地区验证或发布这两种方法。

表 1 化妆品相关替代方法的验证进展

3.5 皮肤吸收试验

我国的化妆品安全技术规范中并没有这类试验，但皮肤吸收率是化妆品风险评估中评价暴露量的重要参数之一，对化妆品原料或配方的安全性评价都有重要意义。无论是体外还是体内的试验都是通过检测放射性同位素的渗透量来评估被测物质的吸收量，体外试验采取离体的人或动物的皮肤来进行［29］。

3.6 急性经口毒性试验

OECD 认可的方法有：固定剂量程序法（FDP）、上下程序法（UDP）、急性毒性分类法（ATC）以及 Balb/c 3T3 细胞法和 NHK 细胞法［30-32］。前 3 个方法虽仍需要使用实验动物，但大大减少了实验动物的使用量，而后 2 个试验是基于细胞毒性的体外试验方法。OECD 早在 2002 年就已删除了传统的以死亡为毒理学终点检测 LD50的方法。在化妆品安全性评价中，急性经口毒性试验的结果主要作为化妆品原料毒性分级、标签标识以及确定亚慢性毒性试验和其他毒理学试验剂量的依据［3］。

3.7 遗传毒性试验

遗传毒性试验一般是用于评价化妆品原料及染发（不含涂染型暂时性产品，如可冲洗掉的染料）、育发、美乳、健美类化妆品产品的遗传毒性的试验［3］。遗传毒性的替代试验有 Ames 试验（微生物试验）、体外微核试验（OECD TG487、490）［33-34］、彗星试验（Comet Assay）。

4 我国体外替代方法的研究现状及思考

4.1 相关标准和法规

虽然我国对于替代方法的研究起步较晚，但已有一些相关的国家标准出台。2009 年底，国家质量监督检验检疫总局参考 OECD 的《化学品测试方法指南》第四部分［11］，陆续发布了 12 个针对化学品和化妆品动物替代试验及检验相关规范的国家标准、行业标准（中华人民共和国出入境检验检疫行业标准）［35-46］。2012 年 2 月，国家食品药品监督管理总局对化妆品用化学原料体外 3T3 中性红摄取光毒性试验方法面向社会公开征求意见［47］。

2013 年 12 月，国家食品药品监督管理总局发布了《关于调整化妆品注册备案管理有关事宜的通告》（2013 年第10 号通告）［48］，明确国产非特殊用途化妆品“风险评估结果能够充分确认产品安全性的，可免予产品的相关毒理学试验”。2015 年，国家食品药品监督管理总局起草了《化妆品安全风险评估指南》（征求意见稿），其中指出化妆品安全风险评估能有效地反映出化妆品的潜在风险，一定程度上可以替代终产品毒理学试验［49］。

4.2 我国替代方法研究遇到的问题及挑战

在化妆品安全性评价方面，国际上已认可的化妆品替代试验方法很多，但替代试验用于评价化妆品终产品的数据并不多。在我国，相对动物试验，替代试验存在原材料未规模化生产，试验材料成本高，必需的配套仪器未国产化，很难获得等缺点。因此，替代试验在我国推广实施存在一定的困难。

如前所述的化妆品眼刺激替代试验评价方法中，欧美国家普遍认可 BCOP，对我国很多地区甚至化妆品产地集中的广东省、江浙沪地区来说，获取大量新鲜的牛角膜有一定困难。又比如化妆品皮肤刺激（腐蚀）性评价的方法，国际上公认的人工三维皮肤模型可以节约试验成本，但皮肤模型属于生物材料，保质期短，若使用 OECD 认可的模型，运输周期长、运输成本高，会造成测试结果的偏差，因此我国要想发展体外模型类的替代试验，需要有自主研发的产品。

OECD 认可的替代方法很多针对的是“化学品”或“混合物”，可用于评价化妆品原料和配方的安全性。而目前我国采取的许可管理制度，主要是对化妆品终产品进行安全性评价，原料和终产品的安全性评价结果和方法存在差异。因此，对国际上已认可的动物替代方法，是否适合中国的需求，需要进一步的评估确认和验证，不能只是简单的方法转移。

4.3 我国替代方法的前景和思考

替代试验是毒理学评价技术的进步，替代试验方法的研究是国际化妆品监管趋势所向。我国作为全球第二大经济体，在技术上应该有话语权，因此，我国应积极推动化妆品替代毒理学方法研究与验证体系的建设，建立一套适应我国国情的化妆品动物体外试验检测标准，完善化妆品质量监管的技术支撑体系，以保障化妆品质量安全，促进化妆品行业发展。

替代方法在开发研究、验证（validation）或转移确认（verification）时，应充分考虑方法的可操作性、在中国的适用性及方法本身的使用条件等因素。很多国际上已验证过的方法，如 OECD 的化学品指南，针对的是“化学品”或“混合物”。中国化妆品中，有一些植物提取物或根据中药配方改良的产品，是否包含在 OECD 方法描述的“混合物”范围内，有待进一步的考证。另外，在选择替代试验进行检测时，也要考虑到化妆品产品的形状和颜色的影响，有些细胞毒性的方法，不适合检测膏霜状物质或难溶的粉状样品，有些利用 MTT 染色或通过吸光度值来计算毒性结果的替代方法，被测化妆品的颜色和形状也可能影响结果。

5 小结

综上所述，虽然成熟的替代方法还有待于进一步研究和验证，但是其发展方向毋庸置疑。对我国来说，替代方法的研究、验证、转移确认、法规认可非常迫切，应尽快建立起一套新的适应国际要求的标准体系。

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［41］ General Administration of Quality Supervision， Inpection and Quarantine of the People's Republic of China. SN/T 2330-2009 Cosmetics embryotoxicity and developmental toxicity of mice embryonic stem cell test. 2009. （in Chinese）中华人民共和国国家质量监督检验检疫局. SN/T 2330-2009 化妆品胚胎和发育毒性的小鼠胚胎干细胞试验. 2009.

［42］ General Administration of Quality Supervision， Inpection and Quarantine of the People's Republic of China. SN/T 3084.1-2012 Occular irritation test of cosmetics for import and export—Neutral red uptake assays in vitro. 2012. （in Chinese）中华人民共和国国家质量监督检验检疫局. SN/T 3084.1-2012 进出口化妆品眼刺激性试验 体外中性红吸收法. 2012.

［43］ General Administration of Quality Supervision， Inpection and Quarantine of the People's Republic of China. SN/T 3824-2014 Cosmetics phototoxicity test—Red blood cell assay （photohaemolysis and haemoglobin oxidation）. 2014. （in Chinese）中华人民共和国国家质量监督检验检疫局. SN/T 3824-2014 化妆品光毒性试验 联合红细胞测定法. 2014.

［44］ General Administration of Quality Supervision， Inpection and Quarantine of the People's Republic of China. SN/T 3882-2014 Chemicals—Skin sensitization—Local Lymph Node Assay：BrdU-ELISA. 2014. （in Chinese）中华人民共和国国家质量监督检验检疫局. SN/T 3882-2014化学品 皮肤致敏试验 局部淋巴结法： BrdU-ELISA. 2014.

［45］ General Administration of Quality Supervision， Inpection and Quarantine of the People's Republic of China. SN/T 3898-2014 Guildance on the validation and acceptance of cosmetics alternative testing methods in vitro. 2014. （in Chinese）中华人民共和国国家质量监督检验检疫局. SN/T 3898-2014 化妆品体外替代试验方法验证规程. 2014.

［46］ General Administration of Quality Supervision， Inpection and Quarantine of the People's Republic of China. SN/T 3899-2014 Guidance on good cell culture practice and sample preparation for cosmetics alternative testing in vitro. 2014. （in Chinese）中华人民共和国国家质量监督检验检疫局. SN/T 3899-2014 化妆品体外替代试验良好细胞培养和样品制备规范. 2014.

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［48］ China Food and Drug Administration. About soliciting “guidance for cosmetics safety assessment” for public opinions. （2015-11-10）. http：// www.sda.gov.cn/WS01/CL1355/134401.html. （in Chinese）国家食品药品监督管理总局. 食品药品监管总局药化注册司公开征求《化妆品安全风险评估指南》意见. （2015-11-10）. http：//www. sda.gov.cn/WS01/CL1355/134401.html.

［49］ China Food and Drug Administration. About notice on the adjustment of the relevant matters concerning the registration and management of cosmetics. （2013-12-16）. http：//www.sda.gov.cn/WS01/CL0087/95194. html. （in Chinese）国家食品药品监督管理总局. 关于调整化妆品注册备案管理有关事宜的通告. （2013-12-16）. http：//www.sda.gov.cn/WS01/CL0087/95194. html.

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.05.016

100050 北京，中国食品药品检定研究院食品化妆品检定所

王钢力，Email：wanggl@nifdc.org.cn

2016-07-19