SGK1调节Th17细胞分化在高血压中的作用

李海龙，吕雅丽，鱼丽娟，吴守振

SGK1调节Th17细胞分化在高血压中的作用

李海龙，吕雅丽，鱼丽娟，吴守振

目的 探讨 SGK1 在高血压外周血 CD4+T 淋巴细胞中的表达，揭示 SGK1 通过调节 Th17 细胞的功能在高血压中的作用。

方法 收集高血压患者病例，依据临床诊断分成 I 级、II 级和 III 级。FCM 检测 Th17 细胞在高血压患者外周血中的比例，ELISA 检测 IL-17A 在血清中的表达水平。从高血压患者外周血单个核细胞中分选 CD4+T 淋巴细胞，real-time PCR 检测 SGK1 的表达，同时检测 RORC 的表达水平。构建高血压大鼠模型，HE 染色观察肾组织炎症变化，免疫组织化学检测肾组织中 SGK1 的水平。

结果 与健康对照相比，高血压患者外周血 Th17 细胞的比例和血清中 IL-17A 的水平明显升高，且随高血压分级越高，Th17 细胞比例和 IL-17A 血清水平越高。SGK1 的表达在高血压患者 CD4+T 淋巴细胞中显著升高。更为重要的是，SGK1 的表达与 RORC 和 IL-17A 具有正相关性。在高盐诱导的高血压大鼠模型中，血清 IL-17A 的水平明显高于正常对照组。与对照组比较，高血压组的肾组织出现了明显的炎症变化和浸润的淋巴细胞，SGK1 在肾组织中的表达明显升高。

结论 高血压中 Th17 细胞的比例明显升高，SGK1 通过调节 Th17 细胞的功能促进了高血压的进展。

血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶 1； Th17细胞； 高血压； IL-17A

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2016, 11(5):426-431

在全球，高血压的发病率和死亡率逐年升高，流行病学表明，全球近 10 亿人患有高血压，每年约有 750 万患者死于高血压［1］。在我国，高血压患者已超过 2 亿［2］。因此，高血压已成为心血管最重要的危险因素之一。临床上，高血压分为原发性高血压和继发性高血压。其中，原发性高血压占 95%以上［3-4］。高血压发病机制复杂，是遗传和环境因素相互作用的结果，盐是重要的环境因素之一［5］。研究表明，盐敏感人群的高血压发病率和病死率均高于盐抵抗性人群［6-8］。

血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶 1（serum and glucocorticoid-inducible kinase 1，SGK1）是醛固酮和胰岛素依赖的集合管上皮钠通道（ENaC）活性和其在细胞质膜密度的正调节因子［9］。由于SGK1 对 ENaC 激活的影响，SGK1 能够提高肾小管细胞对盐的重吸收［10-11］。因此，提高 SGK1 的活性将会导致高血压［12］。近来的研究表明，SGK1能够诱导 Th17 细胞的分化，促进炎症的发展［13-14］。本研究，我们探讨 SGK1 调节 Th17 细胞分化在高血压中的作用，进一步揭示 SGK1 通过调节 T淋巴细胞功能促进炎症诱导高血压的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 2014 年 6 月 - 2015 年 9 月在西安市第九医院确诊和治疗的原发性高血压患者 76例，其中，男性 43 例，女性 33 例；年龄43 ～ 71岁，平均（57.63 ± 9.24）岁。依据高血压分级标准分为：高血压 I 级 33 例，高血压 II 级27 例和高血压 III 级 16 例。另选取 60 例健康人群作为对照研究，其中，男性 35 例，女性25 例；年龄 42 ～ 70 岁，平均（55.37 ± 8.43）岁。高血压组和健康对照组性别、年龄等资料比较差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。纳入标准：所有高血压研究对象均符合原发性高血压诊断标准。排除标准：合并严重心、肝、肾功能不全者，各种免疫性疾病者及不愿参与研究者。本研究经医院伦理委员会批准，所有研究对象都签订了知情同意书。

1.1.2 实验材料 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）分离液购自天根生物公司；CD4+T 细胞分选试剂，荧光抗体（IL-17-PE-Cy5、TNF-α-FITC）以及 IL-17A 和IL-6 ELISA 试剂盒均购自美国 e-Bioscience 公司；实时定量 PCR 相关试剂购自 Takara 公司；SGK1 和 β-actin 引物由上海吉玛公司提供，SGK1引物，上游为 5' CTGTAAAACTTTGACTGCATAG AACA 3'；下游为 5' AGGGCAGTTTTGGAAAGG TT 3'；RORC 引物，上游为 5' GTCCCGAGATGCT GTCAAGT 3'；下游为 5' TGAGGGTATCTGCTCCT TGG 3'；β-actin 内参引物，上游为 5' AGAGGGAA ATCGTGCGTGAC 3'；下游为 5' CAATAGTGATGA CCTGGCCGT 3'。FACS 流式细胞仪为美国 Biorad公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 PBMC 分离 沿管壁缓慢向 10 ml 混匀的白膜中加入 10 ml 淋巴细胞分离液；2000 r/min离心 10 min，收集中间乳白色云雾状细胞层，制备人 PBMC。

1.2.2 CD4+T 细胞分选 以 PBS 洗 PBMC 2 次，每次 2000 r/min 离心 8 min；细胞计数，每107个细胞加入 40 μl 磁珠洗液，重悬细胞；加入10 μl 生物素标记的 CD4+T 抗体，避光孵育 20 min；加入 2 ml 洗液，重悬，2000 r/min 离心 5 min，弃上清；将 LS 柱固定于磁珠分选架上，以 3 ml洗液平衡柱子 2 次；离心并细胞计数，制备 CD4+T细胞。

1.2.3 检测 Thl7 细胞 调整 CD4+T 细胞数至1 × 106/ml，加入 50 ng/ml 佛波醇肉豆蔻酸酯（phorbol myristate acetate，PMA）和 750 ng/ml 离子霉素；于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养 4 ～ 6 h；收集细胞，2000 r/min 离心 5 min；以抗人IL-17-PE-Cy5 单克隆抗体，孵育 15 min；固定、破膜，流式细胞仪检测 Th17 细胞的比例。实验中以同型 IgG 染色细胞作为阴性对照。

1.2.4 实时定量 PCR 检测 SGK1 和 RORC 的mRNA 提取 CD4+T 细胞总 RNA，取 2 μg 总RNA 进行反转录制备 cDNA；实时定量 PCR，反应体系为：44 μl 混合液、1 μl Tag 聚合酶，反应终体积为 50 μl。扩增条件为：94 ℃ 预变性 55 s，然后 92 ℃ 40 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，共 40 个循环。以 β-actin 进行量化。设置 3 个复孔，实验重复 3 次。结果以 2-△Ct表示。

1.2.5 ELISA 实验 以 ELISA 试剂盒说明书进行操作，检测血清中 IL-17A 水平。ELISA 板中每孔加入血清 100 μl 或 PBS 对照；37 ℃ 孵育 2 h；洗板 3 次，每次 2 min；加入 100 μl 工作液，置于 37 ℃，孵育 1 h；洗板 5 次，每次 2 min；加入 90 μl TMB 底物工作液，避光孵育 20 min；加入 50 μl 终止液；在 450 nm 波长处检测每孔的光密度值。

1.2.6 高血压大鼠模型 SD 大鼠，4 周龄，12 只，随机分成两组（正常组和高盐组）。高盐组用含 8.0% NaCl 的饲料喂养，正常组用含 0.4% NaCl 的饲料喂养。以无创测压装置每隔一天检测SD 大鼠血压变化，当收缩压 ＞ 120 mmHg 时则造模成功。

1.2.7 HE 染色 常规脱蜡、水化、漂洗、染色、脱水、封片，光镜下观察肾组织炎症的改变。

1.2.8 免疫组织化学 常规方法梯度酒精脱水；以柠檬酸抗原修复液修复抗原；PBS 洗 5 min，共3 次；双氧水灭活过氧化物酶；加试剂 A（10% 山羊血清）于组织切片上，孵育 1 h；加 SGK1 一抗（1：100 稀释），每张切片 50 μl，4 ℃ 孵育过夜；PBS 洗 5 min，共 3 次；加 HRP 标记的二抗，孵育 1 h；PBS 洗 5 min，共 3 次； DAB 显色，显微镜观察。

1.3 统计学处理

采用 SPSS18.0 统计软件处理数据。采用Student's t 检验，数据以表示。SGK1 与 IL-17A 的相关性采用 Pearson 相关分析，以 P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高血压患者中 Th17 和 IL-17A 的表达分析

收集并分析 76 例高血压患者外周血中 Th17细胞的比例，结果表明，与正常健康者比较，高血压患者中 Th17 细胞比例明显升高，具有明显的统计学差异（P ＜ 0.05），而且高血压分级越高，Th17细胞占外周血 CD4+T 细胞的比例越大（图 1A）。进一步，我们分析了高血压患者中血清 IL-17A 的水平。结果显示，高血压患者中血清 IL-17A 水平明显高于健康对照，具有显著性差异（图 1B），而且高血压分级越高，血清 IL-17A 的水平就越高。

2.2 高血压患者中 RORC 和 SGK1 的表达

RORC 是 Th17 细胞中的转录因子，SGK1 是调节 Th17 细胞分化的重要调节分子。因此，为进一步研究 SGK1 能否调节高血压中 Th17 细胞分化，我们分析了高血压患者中 CD4+T 细胞中RORC 和 SGK1 的表达。实时定量 PCR 结果显示，RORC（图 2A）和 SGK1（图 2B）在高血压患者 CD4+T 细胞中高表达，明显高于健康对照，具有统计学差异。更为重要的是，随着高血压分级程度升高，RORC 和 SGK1 在 CD4+T 淋巴细胞中表达也明显升高。

图1 Th17 细胞及其细胞因子在高血压患者中的表达（A：Th17 细胞流式细胞术检测结果；B：IL-17A 的血清水平）Figure 1 The results of Th17 cells and relative cytokines in patients with hypertension （A： The results of Th17 cells in patients with hypertension； B： The levels of serum IL-17A in patients with hypertension）

图2 RORC（A）和 SGK1（B）在高血压患者外周血 CD4+T 细胞中的表达Figure 2 The expression of RORC （A） and SGK1 （B） in CD4+T cells from patients with hypertension

2.3 SGK1 与 Th17 细胞相关因子相关性分析

为进一步分析 SGK1 调节 Th17 细胞分化在高血压中的作用，我们对高血压中 SGK1与 Th17细胞相关因子进行了相关性分析。结果表明，SGK1与 Th17 细胞的转录因子 RORC 具有明显的相关性（r2= 0.6213，P ＜ 0.05，图 3A），而且 SGK1 与血清 IL-17A 也具有明显的相关性（r2= 0.5656，P ＜ 0.05，图 3B）。

2.4 SGK1 在盐敏感高血压大鼠中的表达

为进一步研究 SGK1 调节 Th17 细胞在高血压中的作用，我们构建了盐敏感高血压动物模型。如图 4A 所示，我们成功诱导了盐敏感的高血压大鼠，自第 10 天，实验组大鼠高血压大于 120 mmHg，与对照组具有明显的统计学差异（P ＜ 0.05），并且血压持续升高。我们分析了外周血 CD4+T 淋巴细胞中 SGK1 的表达和血清 IL-17A 的表达，结果表明，与正常对照组比较，高血压组 SGK1 的表达和 IL-17A 水平明显升高（图 4B，4C）。进一步，HE 染色显示高血压大鼠肾组织中呈现明显的炎症（图 4D）。免疫组织化学结果表明，高血压组肾组织中 SGK1 的表达明显高于正常对照组（图 4E）。

图3 高血压中 SGK1 与 RORC 和血清 IL-17A 相关性分析（A：SGK1 与 RORC 呈正相关；B：SGK1 与 IL-17A 呈正相关）Figure 3 The correlation analysis of SGK1 with RORC and serum IL-17A in hypertension （A： The positive correlation between SGK1 and RORC in hypertension； B： The positive correlation between SGK1 and IL-17A in hypertension）

图4 SGK1 调节 Th17 细胞在高血压大鼠模型中的影响［A：大鼠模型中血压检测；B：大鼠模型中 SGK1 表达结果；C：大鼠模型中血清 IL-17A 检测结果；D：HE 染色检测炎症变化（× 100）；E：免疫组织化学法检测肾组织中 SGK1 表达（× 200）， P ＜ 0.05］Figure 4 The effect of SGK-induced Th17 cells in hypertension model ［A： Blood pressure in hypertension model； B： The expression of SGK1 in hypertension model； C： The levels of serum IL-17A in hypertension model； D： The results of HE staining （× 100）； E： The analysis of SGK1 in kidney from hypertension model by IHC （× 200）， P ＜ 0.05］

3 讨论

高血压是一种进行性的“心血管综合征”，表现为动脉血压持续升高［15］，并伴有多种靶器官损害以及心、肾、脑和视网膜等器官功能性或器质性改变。随着我国老龄化社会进程的加快、人们生活方式和饮食习惯的改变，在我国，高血压患者不断增加，给社会和家庭带来巨大的经济负担。高血压作为当前社会的主要卫生问题之一，备受人们关注。但是，高血压发病机制复杂，受遗传和环境等方面的多因素影响。尽管人们对高血压的发病机制进行了大量深入的研究，但是这些研究大都集中在肾素血管紧张素-醛固酮系统、血管系统和中枢神经系统［16］。近年来的研究表明，高血压伴有局部和系统性的炎症反应，与免疫炎症相关的淋巴细胞及其细胞因子参与了高血压的发生与发展［17-18］。研究表明，抑制高血压 T 淋巴细胞参与的炎症反应，就能够减轻血压升高及其导致的靶器官损害［19］。

Th17 细胞是 T 淋巴细胞亚群的重要组成，是促进炎症主要的 T 细胞亚群。Th17 细胞在转化生长因子（transforming growth factor，TGF）β、IL-6和 IL-1 的介导下成熟，主要表达 IL-17A、IL-17F和 IL-21 等细胞因子［20］。Th17 细胞参与了许多自身免疫性疾病和炎症反应性疾病的发病，如类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化症、哮喘、炎症性肠病和牙周疾病等［21］。近来的研究表明 Thl7 细胞在冠状动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合征等心血管疾病中也发挥着重要作用。我们检测了 Th17 细胞及其相关的细胞因子 IL-17A 在高血压患者外周血中的比例和水平。结果表明，Th17 细胞和IL-17A 在高血压中明显升高。更为重要的是，随着高血压临床等级的升高，Th17 细胞和 IL-17A的水平也明显升高。这些结果提示，Th17 细胞及其细胞因子 IL-17A 在高血压中具有重要的功能，与高血压进展密切相关。RORC 是 Th17 细胞重要的转录因子，为进一步研究 Th17 细胞在高血压中的作用，我们检测了 CD4+T 细胞中 RORC 的表达，结果表明，RORC 在高血压中高表达，进一步证实了 Th17 细胞在高血压中的作用。

SGK1 为 SGK 家族的主要成员之一，受多种外部因素刺激调节［22］。研究表明，SGK1 能够诱导致病性的、分泌 IL-17 的 Th17 细胞的产生，在炎症性疾病发展中起着重要的作用［14］。本研究，我们检测了 SGK1 在高血压患者外周血 CD4+T 细胞中的表达。研究结果表明，SGK1 在高血压患者外周血 CD4+T 细胞中呈现高表达，且随着高血压临床分级的升高，SGK1 表达也升高，提示 SGK1 是高血压进展重要的调节分子。为进一步研究 SGK1是否调节 Th17 细胞促进高血压进展。我们对SGK1 与 Th17 细胞相关因子进行了相关性分析。结果表明，高血压患者中，SGK1 分别与 RORC 和IL-17A 呈正相关。在体内，我们以高盐诱导了高血压大鼠模型，结果表明高血压组 SGK1 的表达和 IL-17A 水平明显升高，肾组织呈现明显的炎症。SGK1 在高血压组肾组织中的表达明显升高。这些结果表明，SGK1 通过调节 Th17 细胞促进炎症发生，进而促进了高血压的发展。

综上，通过本研究，我们发现高血压中 SGK1表达升高，并且与 Th17 细胞相关因子（RORC 和IL-17A）具有相关性，提示 SGK1 通过调节 Th17细胞分化促进了高血压炎症过程。

［1］ World Health Organization. Global status report on noncommunicable diseases 2010. World Health Organization， 2011.

［2］ Mou JJ， Liu ZQ. Focus on the salt and salt sensitivity to raise the level of prevention and control of hypertension in China. Chin J Hypertens，2010， 18（3）：201-202. （in Chinese）牟建军， 刘治全. 关注盐和盐敏感性提高我国高血压防治水平. 中华高血压杂志， 2010， 18（3）：201-202.

［3］ Adamo KB， Tesson F. Gene-environment interaction and the metabolic syndrome//Rutter M. Genetic effects on environmental vulnerability to disease： Novartis Foundation Symposium 293. Chichester， UK： John Wiley & Sons， 2008：103.

［4］ Franks PW. Identifying genes for primary hypertension：methodological limitations and gene-environment interactions. J Hum Hypertens， 2008， 23（4）：227-237.

［5］ Cui HH， Yang JY， Li L. Advances in rat models of salt-sensitive hypertension. Chin J Comp Med， 2008， 18（7）：68-71. （in Chinese）崔慧慧， 杨建一， 李莉. 盐敏感性高血压大鼠模型的研究进展. 中国比较医学杂志， 2008， 18（7）：68-71.

［6］ He FJ， MacGregor GA. Reducing population salt intake worldwide：from evidence to implementation. Prog Cardiovasc Dis， 2010， 52（5）：363-382.

［7］ Strazzullo P， D'Elia L， Kandala NB， et al. Salt intake， stroke， and cardiovascular disease： meta-analysis of prospective studies. BMJ，2009， 339：b4567.

［8］ Weinberger MH， Fineberg NS， Fineberg SE， et al. Salt sensitivity，pulse pressure， and death in normal and hypertensive humans. Hypertension， 2001， 37（2）：429-432.

［9］ Sanada H， Jones JE， Jose PA. Genetics of salt-sensitive hypertension. Curr Hypertens Rep， 2011， 13（1）：55-66.

［10］ Lang F， Huang DY， Vallon V. SGK， renal function and hypertension. J Nephrol， 2010， 23 Suppl 16：S124-S129.

［11］ Lang F， Görlach A， Vallon V. Targeting SGK1 in diabetes. Expert Opin Ther Targets， 2009， 13（11）：1303-1311.

［12］ Lang F， Stournaras C. Serum and glucocorticoid inducible kinase，metabolic syndrome， inflammation， and tumor growth. Hormones（Athens）， 2013， 12（2）：160-171.

［13］ Wu C， Yosef N， Thalhamer T， et al. Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1. Nature， 2013，496（7446）：513-517.

［14］ Kleinewietfeld M， Manzel A， Titze J， et al. Sodium chloride drives autoimmune disease by the induction of pathogenic TH17 cells. Nature， 2013， 496（7446）：518-522.

［15］ Chinese guidelines for the management of hypertension. 2010 Chinese guidelines for the management of hypertension. Chin J Hypertens，2011， 19（8）：701-743. （in Chinese）中国高血压防治指南修订委员会. 中国高血压防治指南2010. 中华高血压杂志， 2011， 19（8）：701-743.

［16］ Muñoz-Durango N， Fuentes CA， Castillo AE， et al. Role of the renin-angiotensin-aldosterone system beyond blood pressure regulation： molecular and cellular mechanisms involved in end-organ damage during arterial hypertension. Int J Mol Sci， 2016， 17（7）：797.

［17］ Solak Y， Afsar B， Vaziri ND， et al. Hypertension as an autoimmune and inflammatory disease. Hypertens Res， 2016， 39（8）：567-573.

［18］ Caillon A， Schiffrin EL. Role of inflammation and immunity in hypertension： recent epidemiological， laboratory， and clinical evidence. Curr Hypertens Rep， 2016， 18（3）：21.

［19］ Wenzel U， Turner JE， Krebs C， et al. Immune mechanisms in arterial hypertension. J Am Soc Nephrol， 2016， 27（3）：677-686.

［20］ Burkett PR， Meyer zu Horste G， Kuchroo VK. Pouring fuel on the fire：Th17 cells， the environment， and autoimmunity. J Clin Invest， 2015，125（6）：2211-2219.

［21］ Isailovic N， Daigo K， Mantovani A， et al. Interleukin-17 and innate immunity in infections and chronic inflammation. J Autoimmun， 2015，60：1-11.

［22］ Kumar P， Natarajan K， Shanmugam N. High glucose driven expression of pro-inflammatory cytokine and chemokine genes in lymphocytes： molecular mechanisms of IL-17 family gene expression. Cell Signal， 2014， 26（3）：528-539.

Objective To study the expression of SGK1 in CD4+T from peripheral blood mononuclear cells （PBMC） of hypertension patients，and to explore the function of SGK1 in hypertension by regulating Th17 cells differentiation.

Methods The patients with hypertension were recruited and divided into hypertension I， hypertension II and hypertension III according to clinical diagnosis of hypertension. The percentage of Th17 cells were analyzed by FCM. ELISA was using to analyze the level of IL-17A in patients' serum with hypertension. The CD4+T cells were prepared from PBMC of hypertension patients by using magnetic beads. The expression of SGK1 and RORC were detected by real-time PCR. The hypertension animal models were constructed by high salt diet. The inflammation form kidney was observed by HE staining， and SGK1 expression in kidney was detected by IHC.

Results Compared with the healthy control， the percentage of Th17 cells and the level of IL-17A in serum were increased significantly in patients with hypertension. Importantly， the levels were higher along with the development of hypertension. SGK1 expression was up-regulated remarkably in CD4+T cells from patients with hypertension. What's more， SGK1 expression has positive correlation with RORC and IL-17A. In the hypertension animal models， compare with control， the levels of serum IL-17A was increased， the inflammation were observed in hypertension animal models and the expression of SGK1 in kidney was increased significantly.

Conclusion The percentage of Th17 cells were increased in patients with hypertension， and SGK1 promoted the progress of hypertension by regulating the differentiated of Th17 cells.

Author Affiliations： Department of Geratology， Ninth People's Hospital， 710054 Shaanxi， China （LI Hai-long， LÜ Ya-li）；Department of Laboratory （YU Li-juan）， Institute of Pediatric Diseases of Shannxi， Shannxi Engineering Research Center for Translational Medicine of Diagnosis & Therapy of Pediatric Diseases （WU Shou-zhen）， Xi'an Children's Hospital， 71003 Shaanxi，China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2016, 11(5):426-431

The function of SGK1 in hypertension by regulating Th17 differentiation

LI Hai-long， LÜ Ya-li， YU Li-juan， WU Shou-zhen

Serum and glucocorticoid-inducible kinase 1； Th17 cells； Hypertension； IL-17A

WU Shou-zhen， Email： wushouzhen@qq.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.05.007

710054 西安市第九医院老年病科（李海龙、吕雅丽）；710003西安市儿童医院检验科（鱼丽娟），儿科疾病研究所陕西省儿科疾病诊治转化医学工程研究中心（吴守振）

吴守振，Email：wushouzhen@qq.com

2016-08-17