不同代次人胎盘间充质干细胞的生物活性比较研究

章毅，许惠利，王锋，王哲，李春丽，陈亮

不同代次人胎盘间充质干细胞的生物活性比较研究

章毅，许惠利，王锋，王哲，李春丽，陈亮

目的 旨在观察不同代次人胎盘间充质干细胞（PMSCs）体外培养的生物学特性和体外诱导分化潜能，为间充质干细胞临床应用安全性及有效性提供实验依据。

方法 无菌条件下获取人足月胎儿胎盘组织，通过 II 型胶原酶消化法分离 PMSCs，在常规培养条件下培养至第9 代，倒置相差显微镜观察 P0、P3、P6、P9 代次的间充质干细胞细胞形态；MTT 活细胞计数法检测细胞生长增殖能力；流式细胞术分析细胞周期及表面标志物的阳性表达率。同时进行成脂、成骨、成软骨诱导分化，诱导 14 d 后分别进行油红 O 染色、茜素红 S 染色、Masson 染色鉴定，观察并比较不同代次 PMSCs 的多向诱导分化能力。

结果 PMSCs 具有很强的贴壁能力，主要呈纺锤梭形，不同代次的 PMSCs 有不同的体外增殖能力，以P0、P3 代较强；均高表达 CD73、CD90、CD105，低表达 CD14、CD34、CD45 和 CD20。细胞周期中 G0/G1 期细胞所占比例 P0为 90.95%、P3 为 88.97%、P6 为 85.93%、P9 为 67.89%，诱导分化实验显示，P6、P9 代细胞多向诱导分化能力逐渐降低。

结论 提示在选择胎盘间充质干细胞作为种子细胞时，应注意选择适宜的扩增代数，以便既能保证足够的细胞数目又能保留细胞最佳的分化能力。

胎盘； 间质干细胞； 细胞周期； 多向诱导分化

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2016, 11(5):400-406

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，在适宜的培养条件下可被诱导分化成各种组织细胞，包括骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等［1］。最新研究表明，MSCs 易于外源基因导入表达［2］，而且具有调节免疫系统的功能［3］，因此不仅可作为组织工程的种子细胞，也为基因治疗提供了一个可靠的工具，同时在诱导移植耐受和治疗自身免疫性疾病中具有广泛的应用前景。目前报道的 MSCs 主要来源于骨髓，但骨髓中的含量很低，仅占骨髓中单个核细胞的 1/106～ 1/105［4］，且有时因病毒感染或因衰老使骨髓中细胞数量显著降低或骨髓增生分化功能降低，使骨髓来源的 MSCs受到了限制。故寻找一种能替代骨髓 MSCs，并可弥补其缺陷的 MSCs 来源已越来越受到重视［5］。

胎盘是胎儿与母体之间进行物质交换的器官，起源于胚胎发育期胚外中胚层，是由间质、血管及滋养细胞组成，含有大量的间充质成分。最新的研究表明胎盘中含有丰富的干细胞，由于其细胞形态、增殖能力、表面抗原标志、基因表达等与骨髓间充质干细胞高度相似，而且也具有多向分化的潜能。从胎盘中分离培养出这些多能干细胞将为实验研究和临床应用开辟一个崭新而丰富的间充质干细胞来源［6］。

为了使 PMSCs 能更好、更持久地应用于临床修复组织细胞和器官，在移植前评估此细胞的生物活性显得尤为重要，目前国内外研究表明，各代PMSCs 增殖能力及生物活性是否相同仍无定论［7］。关于 PMSCs 不同代次生物活性的系统研究更是少之又少，本实验通过对不同代次 PMSCs 的增殖能力、细胞周期及多向诱导分化潜能进行观察分析，为种子细胞移植的选取提供更多实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料和主要试剂

胎盘采自足月健康新生儿，在符合国家相关法律和伦理委员会同意下，经产妇或家属签署知情同意书后获得。成脂、成软骨、成骨诱导套装购自美国 Gibco 公司；MTT 试剂盒购自碧云天公司；PI、RNase A 购自美国 Sigma 公司；MSC PhenotypingKit（CD105-PE、CD90-FITC、CD73-APC、CD14-/CD20-/CD34-/CD45-PerCP）购自德国Miltenyi Biotec 公司；油红 O 染液、Masson 染液、茜素红 S 染液购自南京建成公司；CO2恒温培养箱、酶标仪购自美国 Thermo 公司；显微设备购自美国 Olympus 公司；流式细胞仪购自美国 BD Bioscience 公司。

1.2 方法

1.2.1 PMSCs 的分离培养 无菌条件下剪取胎盘绒毛膜组织，剪成约 5 mm3的碎块，加入 II 型胶原酶恒温消化 1.5 h，室温条件下以 2000 r/min离心 10 min，加入含 10% FBS 的培养液重悬细胞，置于 37 ℃、体积分数为 5% CO2恒温培养箱内，根据黏附性差异使 PMSCs 与其他组织细胞分离，经过表面标志物鉴定，从而确定为 PMSCs。在倒置相差显微镜下观察细胞形态和生长情况，待细胞融合度达到 80% ～ 90% 时，胰酶消化传代，每 2 ～ 3 天传代 1 次。

1.2.2 不同代次细胞形态观察、生长曲线和细胞周期检测

1.2.2.1 细胞形态观察 取 P0、P3、P6、P9 代PMSCs，当贴壁细胞均生长到汇合度为 80% 左右时，对细胞形态进行观察并拍照。

1.2.2.2 绘制细胞生长曲线（MTT 法） 收集P0、P3、P6、P9 代 PMSCs，细胞计数后以每孔1 × l04个细胞接种于 7 块 96 孔板，每孔加完全培养基至总体积 200 μl，在 37 ℃，5% CO2浓度恒温孵箱中培养，24 h 后每天取一块板检测，向检测板的每个孔中加 MTT 溶液 20 μl，在 37 ℃，5% CO2浓度恒温箱孵育 4 h 后，每孔加入 150 μl DMSO，振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在全自动酶标仪上测定各孔吸光度（A）。以时间为横坐标，A 值为纵坐标，波长为 570 nm，绘制细胞生长曲线。

1.2.2.3 PMSCs 细胞周期检测 取 P0、P3、P6、 P9 代指数期的 PMSCs，加入 1 ml 预冷 70 % 乙醇，混匀后 4 ℃ 过夜，每管样品中加入 5 μl RNA酶，37 ℃ 孵育 30 min，每管加入 10 μl PI 染液，室温避光孵育 30 min 后，流式细胞仪检测。每代次 PMSCs 有 3 个重复样本。采用 ModFit LT 软件获取并分析结果。

1.2.3 PMSCs 表面标志物检测 取 P0、P3、P6、P9 代 PMSCs，用 1 ml PBS 调整细胞总数为 5 × 106个，分别加入标记抗体 CD90-FITC、CD105-PE、CD73-APC、CD14-/CD20-/CD34-/CD45-PerCP，以鼠抗人的 IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC、IgG1-PerCP、IgG2a-PerCP 作为同型对照，室温避光孵育 30 min，利用流式细胞仪检测，FlowJo 7.6.1软件获取并分析结果。

1.2.4 PMSCs 多向分化潜能及染色鉴定 取P0、P3、P6、P9 代 PMSCs，以 5 × 103/ml 密度接种于 6 孔板中，置于 37 ℃、体积分数为 5% 的CO2恒温培养箱中培养 24 h，待细胞融合度达到60% ～ 70% 时，分别更换为成脂、成软骨及成骨诱导分化培养基，并设 DMEM 完全培养基培养为对照孔，每 3 ～ 4 天换液 1 次。每代 PMSCs 重复3 个样本，每个样本 3 个复孔。诱导 14 d 后，成脂诱导、成软骨诱导、成骨诱导分别用油红 O 染液、Masson 染液、茜素红 S 染液染色并进行鉴定，倒置相差显微镜下观察并拍照。

2 结果

2.1 不同代次 PMSCs 传代后形态学、生长曲线和细胞周期的比较

2.1.1 不同代次 PMSCs 形态观察结果 倒置相差显微镜下观察，原代培养的 PMSCs 接种 48 h后，大部分细胞贴壁，形态为典型成纤维细胞样，3 ～ 5 d 可发现贴壁细胞增殖形成细胞岛，6 ～ 9 d后所有细胞岛汇合成单细胞层铺满全皿，中间散在些透亮圆形杂细胞。P0 和 P3 代均为长梭形，细胞排列紧密，成旋涡状或放射状生长（图 1A、B）。而 P6 和 P9 代成短梭形或多边形，细胞体积变大，成旋涡状或网状排列（图 1C、D）。

图1 不同代次胎盘间充质干细胞生长形态（A：P0 代；B：P3 代；C：P6 代；D：P9 代）（10 × 10）Figure 1 The growth and morphology of human PMSCs （A： P0； B： P3； C： P6； D： P9） （10 × 10）

2.1.2 不同代次 PMSCs 生长曲线测定结果 用MTT 方法绘制的不同代次 PMSCs 体外培养细胞生长曲线如图 2 所示，各代细胞与 P0 代比较增殖能力出现明显差异，P0、P3 代细胞在培养 2 ～3 d 细胞数即达到倍增；P6 在培养 2 ～ 4 d 达到指数增长期，6 ～ 7 d 进入平台期；P9 代细胞生长增殖速度缓慢。

图2 MTT 法绘制不同代次胎盘间充质干细胞的生长曲线Figure 2 The growth curves of PMSCs at different passages

图3 不同代次胎盘间充质干细胞的细胞周期［A：P0 代；B：P3 代；C：P6 代；D：P9 代；P0、P3 增殖能力最强；随着传代次数的增加，G0/G1 期细胞逐渐降低，而（S + G2/M）期细胞逐渐增多］Figure 3 Cell cycles of PMSCs at different passages ［A： P0； B： P3； C： P6； D： P9； The cells of P0 and P3 have the highest proliferation ability. The percentage of G0/G1 become lower and lower， relatively， the percentage of （S + G2/M） become higher and higher with subculture］

2.1.3 不同代次 PMSCs 细胞周期测定结果 流式细胞术检测比较不同代次 PMSCs 体外细胞周期水平，结果显示大部分细胞均处于 G0/G1 期，G0/G1 期细胞 P0（90.95%）、P3（88.97%）、P6（85.93%）、P9（67.89%）；S 期与 G2/M 期分别是 P0（9.05%）、P3（11.02%）、P6（14.07%）、P9（32.11%）（图 3）。从中可以看出，随着传代次数的增加，G0/G1 静止期逐渐减少，而（S + G2/M）期细胞逐渐增多。

2.2 不同代次 PMSCs 表面标记物的比较

应用流式细胞术检测结果发现，不同代次PMSCs 表面标记物 CD14/CD20/CD34/CD45 含量在 0.5% 以下，均为低表达；同时强阳性表达间充质干细胞相关抗原 CD73、CD90、CD105，表达率 ＞ 98%（图 4）。不同代次间充质干细胞表面抗原表达率无明显差异。

2.3 不同代次的 PMSCs 多向诱导分化

PMSCs 成脂诱导 14 d，油红 O 染色结果显示 P0、P3、P6 代细胞胞浆周围均含有大小不等的脂滴，脂滴被染成红色（图 5 B1 ～ D1）。随着诱导天数的增加，P0、P3 代细胞形态未发生改变，仍为梭形，诱导成脂肪细胞的数目增多，P0 代细胞胞质聚拢饱满，脂滴充满整个胞浆，P3 代胞质稍有扩散，脂滴增多且变大；而 P6、P9 代细胞形态由梭形变为圆形或多角形，诱导成脂肪细胞数目明显减少，P6 代细胞胞质扩散，脂滴数目减少，P9 脂滴数目更少且小。

PMSCs 成骨诱导 14 d，茜素红 S 染色结果显示，P0、P3、P6 代细胞出现大量橘红色沉淀，呈圆形或类圆形或堆积成片状，有明显的“矿化”结节形成且数量上呈递减趋势（图 5B2 ～ D2），P9 代细胞经诱导后形成的“矿化”结节数量明显减少（图 5E2）。

PMSCs 成软骨诱导 14 d，倒置相差显微镜下观察 P0、P3、P6、P9 代细胞贴壁良好，细胞扁平伸展，由长梭形变成多边多角形态，具有软骨细胞样的形态（图 5B3 ～ E3）；经 Masson 染色结果显示 P0、P3、P6 代细胞胶原纤维呈现蓝紫色，P9 代染色呈阳性明显减少。Masson 染色在 P0、P3 代时阳性率最强，P6、P9 代时呈递减趋势。

3 讨论

在组织工程和临床应用干细胞治疗中，干细胞种类的选择是决定治疗效果的重要因素，以往常以骨髓间充质干细胞为治疗的首选［8］。但取髓会给供者带来很大痛苦，且有时因病毒感染或因衰老使骨髓中细胞数量显著降低或是骨髓增生分化功能减低，使骨髓来源的间充质干细胞受到限制。近年来研究发现间充质干细胞分布广泛，在骨髓、胎盘、肌肉、脂肪、骨、软骨等组织中均含有间充质干细胞。人胎盘是人类妊娠期间胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间进行物质交换的器官，由胚胎发育而成，它的来源更加原始，所以它的可塑性和分化能力更强［9-10］；同时胎盘属于医疗废弃物，获取方便，不需要侵入性的操作等特点［11-12］，其中含丰富的间充质干细胞，是极具价值的干细胞来源。

PMSCs 生物活性与骨髓间充质干细胞高度相似，可在体外培养，具有强大的向多种组织分化的特性，在适当的条件下可被诱导分化为韧带细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、胰腺细胞、肝脏细胞等［13］，因此在许多疾病包括骨/软骨缺损或发育不良、韧带损伤、心肌梗死、肝功能衰竭和糖尿病等的治愈提供了新的方法和途径，为医学界攻克这些人类疑难病症提供了希望。

图4 胎盘间充质干细胞表面抗原分子表达（不同代次间充质干细胞均强阳性表达 CD73-APC、CD90-FITC、CD105-PE，表达率 ＞ 98%；低表达 CD14/CD20/CD34/CD45-PerCP，表达率 ＜ 0.5%）Figure 4 Surface antigens of PMSCs （The CD73-APC、CD90-FITC and CD105-PE were highly expressed by all the mesenchymal stem cells of different generations， the positive expression rate ＞ 98%. Relatively， low expressed CD14/CD20/CD34/CD45-PerCP，and the rate ＜ 0.5%）

图5 不同代次人胎盘间充质干细胞 14 d 诱导分化染色（40 × 10）Figure 5 After multipotent differentiation for 14 d， staining of PMSCs at different passages （40 × 10）

为了使 PMSCs 能更好、更持久地应用于临床修复组织细胞和器官，在移植前评估此细胞的生物活性显得尤为重要，本实验研究不同代次 PMSCs的增殖能力、细胞周期及多向诱导分化潜能。随着体外培养代次的不断增加，细胞形态由 P0 代排列紧密的长梭形逐渐变为网状排列的短梭形，细胞体积变大，贴壁不牢，易于消化。通过 MTT 法检测细胞增殖能力，了解 P0、P3、P6、P9 代次细胞生长情况，结果显示 P0 ～ P3 代间充质干细胞的增殖能力明显高于 P6、P9 代，P9 代细胞已没有经典的生长曲线，增殖速度也明显变缓。本实验的形态观察结果、生长曲线试验结果以及细胞周期检测结果高度吻合，PMSCs 在体外培养时，随着细胞代次的增加，细胞会逐渐出现老化现象。并且此结果与人骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞以及其他动物来源的骨髓间充质干细胞的试验结果相似，均是随着传代次数的增加，细胞的增殖能力和分化潜力降低。

关于 PMSCs 表面标志已开展了大量研究工作，却一直没有明确的定论，直至 2006 年国际细胞治疗协会干细胞委员会提出间充质干细胞定义标准为 CD73、CD90、CD105 阳性率 ≥ 90%，同时低表达 CD45、CD34、CD14 或 CD11b、CD79α或 CD19、HLA-DR，表达率 ≤ 2%［14］。本实验证实与此标准一致，低表达造血细胞的表面标志分子CD34、CD45，髓样单核细胞分化抗原 CD14，B 细胞分化抗原 CD20，表达率 ＜ 0.5%，强阳性表达Thy-1 CD90，5'-核苷酸酶 CD73，内皮糖蛋白CD105，表达率 ＞ 98%。表明可从胎盘中获得高纯度的间充质干细胞，且不同代次 PMSCs 表面标志无明显差异。

本实验世界范围内首次通过流式细胞术显示不同代次 PMSCs 的细胞周期差异，结果显示大部分细胞均处于 G0/G1 期，但 P0 代处于 G0/G1期细胞明显多于 P9 代 G0/G1期细胞，从中可以看出，随着传代次数的增加，间充质干细胞处于G0/G1 静止期细胞逐渐减少，而（S + G2/M）期细胞逐渐增多，说明随着间充质干细胞传代次数增多，尽管保持干细胞样形态并表达间充质主要表面标记抗原但多向分化潜能逐渐降低。多数学者认为，G0/G1 期细胞比例越高，表明此细胞具有高度分化的潜能［15］，本实验与此结论一致。此外，通过对不同代次 PMSCs 进行多向诱导分化证实，细胞传代培养至 P9 代仍然具有诱导分化潜能，但较之P0 代细胞分化能力显著下降。再次证明随着细胞传代培养，PMSCs 的多向诱导分化能力随着其干性减弱在逐渐降低。

总之，PMSCs 传代至 P6 代以后，较之 P3 代增殖能力稍有降低，但仍可保持旺盛的生长状态，而传至 P9 代时生长缓慢，细胞形态变为短梭形，体积变大，而免疫表型并无明显变化，细胞仍能维持 PMSCs 的基本生物学性状。但是从细胞周期及多向诱导分化潜能发现，随着传代次数的增加，P6、P9 代细胞 G0/G1 期比例明显减少，分化能力逐渐降低，说明体外长期培养后 PMSCs 的诱导分化潜能下降。而从胎盘中分离 P0 代细胞数量不足，不能满足组织工程及临床应用干细胞治疗的需求，所以在选择 PMSCs 作为种子细胞时，应注意选择适宜的扩增代数，以便既能保证足够的细胞数目又能保留细胞最佳的分化能力，结合本实验，P3 代细胞无论是在增殖能力还是多向分化的潜能方面都与 P0 代细胞并无显著性差异，因此使用 P3 代以内的细胞作为组织工程种子细胞是较为理想的选择。

志谢 感谢上海市脐带血造血干细胞库对于实验过程给予资金支持，感谢上海长宁妇幼保健院提供实验材料，以及上海市脐带血造血干细胞库有关部门对于实验材料的保存和运输，感谢实验技术员协助实验的完成。

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Objective To observe the biological characteristics and induced differentiation potential of human placenta derived mesenchymal stem cells （PMSCs） at different passages in vitro and to provide experimental evidences for the safety and efficacy in clinical application of PMSCs.

Methods The human term placenta were obtained in sterile condition. The PMSCs were isolated by digestion using collagenase II and in adherent cultur in vitro. The PMSCs were cultured into the 9thgenerations with the normal cultural condition， and the morphological features of the primary cells， 3rd， 6thand 9thgenerations of PMSCs were observed. The proliferative ability of PMSCs was detected by MTT assay and the growth curve was drawn. The cell cycle and the positive expression rates of the surface markers of the different generations of PMSCs were detected by flow cytometry （FCM）. Meanwhile， the PMSCs were induced to differentiate into adipocytes， osteoblasts and chondroblasts in vitro， and identified by staining with oil red O， alizarin red， Masson， respectively for 14 d after being induced. The multipotent differentiation potential of PMSCs from the different generation were assessed.

Results Placenta derived mesenchymal stem cells were mainly in spindle shaped adherent cells， and PMSCs at different passages had different proliferative capability in vitro， especially the primary cells and 3rdgenerations of PMSCs with more potent proliferative activities. The PMSCs were strongly expressed CD73， CD90， CD105 and lowly expressed CD14， CD34， CD45 and CD20. The proportion of G0/G1 phase in cell cycle was 90.95% at the primary cells， 88.97% at passage 3， 85.93% at passage 6，67.89% at passage 9. The multipotent differentiation potential of PMSCs at passages 6 and 9 were decreased.

Conclusion The appropriate amplification passage should be chose in order to obtain the cells with best differentiation potential and cell quantity when using placenta derived mesenchymal stem cells as seed cells.

Author Affiliation： Shanghai Cord Blood Bank/Shanghai Stem Cell Technology Co.， Ltd./China Stem Cell Group Co.， Ltd.，Shanghai 200051， China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2016, 11(5):400-406

Comparative study of biological activities of placenta-derived mesenchymal stem cells at different passages

ZHANG Yi， XU Hui-li， WANG Feng， WANG Zhe， LI Chun-li， CHEN Liang

Placenta； Mesenchymal stem cells； Cell cycle； Induced multi-direction differentiation

s： CHEN Liang， Email： chenliang@shanghaicordblood.org； LI Chun-li， Email： lichunlicherry@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.05.003

上海市自然科学基金（16ZR1429200）；上海市科委研发平台专项（16DZ2293000）；上海市嘉定区工程技术研究中心项目

200051 上海市脐带血造血干细胞库/上海市干细胞技术有限公司/中国干细胞集团有限公司

陈亮，Email：chenliang@shanghaicordblood.org；李春丽，Email：lichunlicherry@163.com

2016-08-01