口腔癌患者尿液萘酚反应物的高效液相色谱荧光检测法筛查

程广强

(福建省测试技术研究所，福建　福州　350003)



口腔癌患者尿液萘酚反应物的高效液相色谱荧光检测法筛查

程广强*

(福建省测试技术研究所，福建福州350003)

利用高效液相色谱荧光检测法(HPLC/FLD)对口腔癌患者尿液中的萘酚反应物(NNR)进行分离分析，通过对34例口腔癌患者和18例健康人尿液的NNR进行分析，比较了癌症患者及健康人尿液中的成分含量差异，提出了一种可用于口腔癌辅助诊断的新方法。结果表明，在健康人及口腔癌患者尿液的萘酚反应物(NNR)中可检出一种标记物，其激发波长为440 nm，发射波长为539 nm。该标记物含量在口腔癌患者中较低，而在健康人群中显著偏高，这与通常的鉴定结果不同。通过采用非参数检验(Mann-Whitney U检验)，该标记物含量在健康人群与口腔癌症患者中存在显著性差异(P<0.01)，其特异度为94.1%，敏感度为94.4%，ROC曲线下面积(AUC)为0.989。该模型具有较高的诊断价值，能够用于口腔癌的辅助鉴定。

口腔癌；尿液萘酚反应物；液相色谱荧光检测(HPLC/FLD)；ROC曲线

尿液作为一种体液，具有重要的临床检验价值，早已列为三大常规检查的内容。由于其取样简单，对人体无伤害，是非常理想的样本。尿液是多组分体系，包含很多人体代谢物，成分较为复杂，信息量较为丰富，因此通过分析尿液成分进行一些特殊疾病诊断的研究报道日益增多。尿液检测研究已应用于胃癌[1-2]、肺癌[3-4]、肝癌[5-6]等癌症检测中，但灵敏度和特异性有限，用于口腔癌诊断的研究也鲜见报道。目前研究癌症患者的尿液成分，主要利用尿液自身的特性，采用尿液自动分析仪或其他光谱、色谱、质谱手段进行检测，如对尿液的自体特异性荧光进行检测[7]；还有一些通过某种特定试剂(如亚硝基萘酚[8-9]等)与尿液中的成分反应生成特定产物，然后采用光谱、色谱、质谱等技术进行分析，确定反应物含量与癌症的相关性。目前已有报道大多直接采用光谱法测量吸光度或者荧光强度，以研究亚硝基萘酚反应物(NNR)与各种癌症的相关性，并对NNR的化学基础与特异性有了较深入的研究[10]。由于尿液与亚硝基萘酚反应后，其成分更为复杂，反映出的吸光度变化或荧光强度变化是各种产物的综合结果，因此笼统地用这些变化来确定与癌症的相关性，具有一定的局限性。本文在已有研究[11]的基础上利用高效液相色谱(HPLC)的高分离性能以及荧光检测器(FLD)的高选择性、高灵敏性来研究NNR，尿液样品在一定条件下与亚硝基萘酚反应后形成NNR，NNR经HPLC分离后，用FLD进行选择性检测。在本文的色谱条件下，检出一种与口腔癌密切相关的物质，其特异度为94.1%，敏感度为94.4%，ROC曲线下面积(AUC)为0.989，该模型具有较高的诊断价值。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2475荧光检测器，HHS-S恒温水浴装置(江苏金坛市正基仪器有限公司)。所用试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。

衍生试剂的配制：将200 mg/Lα-亚硝基-β-萘酚乙醇溶液、3.0 mol/L硝酸与0.1 mol/L亚硝酸钠按2∶3∶3比例混合即得衍生剂。

1.2实验方法

研究样本均取自通过病理活检确诊的口腔癌患者，大多数病例均为口腔鳞癌或者舌癌，正常组均为非癌患者。均于入院第二天采集，嘱尿液采集前一天晚饭后饮水勿超过1 000 mL，自行留取清晨第一次尿液50 mL，保存于聚乙烯塑料瓶中，容器外贴标签(注明受检人员姓名、编号、采集日期)，放入-20 ℃低温冰箱内保存，共采集34例口腔癌患者和18例正常人的尿液样本。取患者晨尿样1.0 mL，加入等体积的衍生剂于55 ℃水浴保温反应30 min后，吸取1.0 mL过0.45 μm滤膜后进样分析。

1.3液相色谱分析条件

色谱柱：Symmetry C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，柱温：30 ℃，柱压：12 MPa；流动相：甲醇-水(50∶50)；流速：1.0 mL/min；荧光检测条件：λex/λem=440 nm/539 nm,Gain：10。

2　结果与讨论

2.1实验条件的优化

2.1.1温度对显色反应的影响尿液中可与α-亚硝基-β-萘酚反应的成分较多，包括酪氨酸、5-羟-3-吲哚乙酸、愈创木酚衍生物、对羟酚取代物、尿高香草酸[12-14]等，均可形成NNR。本文采用酪氨酸为参考基准物质，反应时间为10 min，对衍生反应温度进行优化。酪氨酸与α-显色剂的显色反应在室温下进行缓慢且反应灵敏度较低，适当加热有利于显色反应的进行，根据各温度下显色产物荧光强度的对比，发现在55 ℃时，试样完全显色且显色产物在一定时间内比较稳定，因此选择加热温度为55 ℃。

2.1.2反应时间对显色反应的影响 在最佳反应温度(55 ℃)下考察了反应时间对显色反应的影响，结果显示，随着反应时间的延长，衍生物的荧光强度逐渐增强，当反应时间为30 min时，衍生物的荧光强度达到最大，因此选择最佳反应时间为30 min。

2.2液相色谱条件的优化

将上述衍生物进行高效液相色谱分离分析，以期寻找口腔癌患者与正常人尿液样品中NNR的液相色谱荧光检测谱图差异，寻求合适的标记物用于诊断分析。结果发现，衍生物中一种NNR具有较强的荧光特性，其峰高值与口腔癌具有相关性。为获得最佳的实验效果，进一步对液相色谱的分离条件进行优化。

2.2.1色谱条件的优化比较了流动相中甲醇的体积分数对衍生物出峰时间的影响。结果表明，甲醇的体积分数越大，衍生物的保留时间越短，峰形越尖锐，当流动相中甲醇的体积分数为50%时，出峰时间在6.1 min左右，相对较为理想，因此选择流动相中甲醇的体积分数为50%。

2.2.2检测器的选择 在最佳反应条件及色谱条件下，分别用紫外二极管阵列检测器(UV)和荧光检测器检测，得到萘酚反应物的色谱图见图1。由图1可见，采用UV检测时，虽然口腔癌患者和正常人尿液样品的谱图中能显示出有差异的色谱峰，但谱图的干扰峰较多，其差异峰的纯度不高，无统计学意义(图1A)； 而采用荧光检测时，口腔癌患者和正常人的尿液样品谱图中的色谱峰显示具有明显差异(图1B)，且无杂质峰干扰，可作为口腔癌患者的特征标记物峰，故选择使用荧光检测器。

图1　萘酚反应物的高效液相色谱紫外检测色谱图(A,λ=254 nm)与荧光检测色谱图(B,λex/λem=440 nm/539 nm)Fig.1　Chromatograms of NNR with UV detector(A,λ=254 nm) and FLD detector(B,λex/λem=440 nm/539 nm)

图2　两组人群实验数据的散点图Fig.2　Scatter diagram of two group people

图3　ROC曲线图Fig.3　ROC curve

2.3实际样品检测

对34例口腔癌患者和18例正常人尿液样品中的NNR进行分离分析，选取保留时间6.1 min的峰为标记物，比较癌症患者及健康人尿液中NNR含量的差异。结果表明，在口腔癌患者尿液中该标记物的荧光强度较低(未检出～27.8×10-2V)，而在健康人群中则显著偏高(10.0×10-2～84.0×10-2V)。将所得数据绘制散点图(图2)，从散点图也可直观看出两组数据存在明显差异。

2.4检测结果的统计分析

ROC曲线为受试者工作曲线(Receiver operating characteristic curve,简称ROC曲线)，又称感受性曲线(Sensitivity curve)，常用于医学统计分析[15]。ROC曲线是反映特异度和敏感度连续变量的综合指标，可揭示敏感度和特异度的相互关系，通过将连续变量设定出多个不同的临界值，从而计算出一系列敏感性和特异性，再以敏感性为纵坐标，(1-特异性)为横坐标绘制曲线，其曲线下面积(AUC)越大，诊断准确度越高。一般认为，当AUC为0.5～0.7时，有较低的准确性；0.7～0.9时，有一定的准确性；大于0.9时，有较高的准确性。本文采用SPSS13软件，将检测所得数据输入软件进行统计分析，绘制了ROC曲线(如图3)。从图3可以得出AUC为0.989，特异度为94.1%，灵敏度为94.4%，表明该模型具有很高的诊断价值。

3　结　论

本文建立了口腔癌患者尿液中NNR的高效液相色谱荧光检测方法，方法具有很好的准确性。通过分析口腔癌患者和正常人尿液样品中的NNR含量发现，两组数据存在显著性差异，说明此法用于口腔癌普查筛选具有一定意义。建立的ROC曲线，曲线下面积(AUC)为0.989，说明诊断效果较好，方法的特异度为94.1%，灵敏度为94.4%。

致谢：衷心感谢本课题组全体成员的努力，特别是本所的倪沁颜同志和福建中医药大学附属人民医院口腔科林耿冰医生。同时也感谢本所苏勤同志提供SPSS13.0软件用于数据分析。

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Screening of Naphthol Reactant in Urine of Oral Cancer Patients by High Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection

CHENG Guang-qiang*

(Fujian Institute of Testing Technology , Fuzhou350003,China)

A new aided diagnosis of oral cancer was developed for the separation and analysis of nitrosonaphthol reactant(NNR) of urine in oral cavity cancer patients by using high performance liquid chromatography with fluorescence detection(HPLC/FLD),based on the analysis of urine NNR of 34 cases of oral cancer patients and 18 healthy people and their difference of composition content.The experimental results showed that a marker with excitation wavelength of 440 nm and emission wavelength of 539 nm,could be detected in urinary nitrosonaphthol reactant(NNR) from healthy people and patients with oral cavity cancer under the condition of this paper.The marker content was relatively low in oral cancer patients and significantly high in healthy persons,which is quite different from the usual test results.Significant differences were found in the matter content in healthy people and those with oral cancer patients(P<0.01) using a non parametric test (Mann-Whitney U test).Further data analysis showed that the specificity was 94.1%,the sensitivity was 94.4%,the area under the ROC curve(AUC) was 0.989.The model showed a high diagnostic value,and could be used for the auxilary identification of oral cancer.

oral cancer；nitrosonaphthol reactants；high performance liquid chromatography with fluorescence detection(HPLC/FLD)；ROC curve

2016-02-01；

2016-03-10

福建省科技计划项目公益类科研院所基本科研专项资助(2009R10002-1)

程广强，硕士，高级工程师，研究方向：分析化学，Tel：0591-87872379，E-mail:1585920616@qq.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.024

O657.72；O625.313

A

1004-4957(2016)09-1199-04