5′-羟基-2,2′,4,4′,5-五溴二苯醚与人血清白蛋白结合特征研究

杨　雾，杨露露，伍智蔚，易忠胜

(广西高校食品安全与检测重点实验室，岩溶地区水污染控制与用水安全保障协同创新中心，桂林理工大学化学与生物工程学院，广西　桂林　541004)



5′-羟基-2,2′,4,4′,5-五溴二苯醚与人血清白蛋白结合特征研究

杨雾，杨露露，伍智蔚，易忠胜*

(广西高校食品安全与检测重点实验室，岩溶地区水污染控制与用水安全保障协同创新中心，桂林理工大学化学与生物工程学院，广西桂林541004)

在模拟生理环境下，通过稳态荧光光谱、时间分辨荧光光谱、傅立叶变换红外光谱和三维荧光光谱等方法研究了5′-羟基-2,2′,4,4′,5-五溴二苯醚(5′-OH-BDE-99)与人血清白蛋白的结合特征，并结合分子对接与分子动力学模拟技术对其作用机制进行了分析。荧光光谱实验、非辐射能量转移理论及动力学模拟研究表明，5′-OH-BDE-99能使HSA 发生猝灭作用，且猝灭机制为静态猝灭。傅立叶变换红外光谱、三维荧光光谱及动力学模拟研究表明，5′-OH-BDE-99可诱导HSA 构象和周围环境发生变化。此外，分子对接和热力学方法研究表明，二者间的主要作用力为疏水作用力。

多溴二苯醚；人血清白蛋白；荧光光谱；分子对接；动力学模拟

多溴二苯醚(Polybrominated diphenyl ethers,PBDEs)是一种重要的溴代阻燃剂，广泛应用于电子产品、纺织品和建筑材料等领域[1]。由于其化学性质稳定且难以降解，因而在环境中造成了一定的污染，近年来受到越来越多的关注。多溴二苯醚的衍生物羟基化多溴二苯醚(Hydroxylated polybrominated diphenyl ethers,OH-PBDEs)作为一种新型的环境污染物，其化学结构与PBDEs 相似，但生物毒性更大。OH-PBDEs 结构与甲状腺素和三碘甲状腺原氨酸的结构相似，因而表现出相似的特征进而干扰人体的内分泌平衡[2]。

人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)是人体内血液中含量最为丰富的载体蛋白质，其含量约为40 mg/L，约占血浆总蛋白含量的60%[3]，具有运输和维持正常血液渗透压的功能。它对大量的外源性和内源性物质如代谢产物、脂肪酸、氨基酸、胆红素及药物的运输和分配有重要作用。研究新型环境污染物与HSA 的结合特征，可以进一步分析HSA 的生理活性及其作用机制。一方面，OH-PBDEs 能够经食物链在人体内长期积累并表现出各种潜在毒性，另一方面，它可随血液运输、传递，进而与HSA 结合形成复合物体系。本文模拟人体微环境[4-6]，在pH 7.4，T=310 K 的条件下对5′-羟基-2,2′,4,4′,5-五溴二苯醚(5′-OH-BDE-99) 与HSA 的结合进行光谱研究，并结合计算模拟的方法进一步分析了其结合特征，从而揭示5′-羟基-2,2′,4,4′,5-五溴二苯醚对人体的影响。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

RF-5301PC 荧光分光光度计(日本岛津公司)；F-4600 荧光分光光度计(日本Hitachi公司)；FL3-P-TCSPC 时间分辨荧光仪(法国Horiba Jobin Yvon公司)；TU-1901 双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；傅立叶变换红外光谱仪(美国Nicolet公司);EL204 电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；pHS-3C 型精密pH 计(上海仪电科学仪器股份有限公司)。

人血清白蛋白(HSA,美国Sigma 公司)；5′-OH-BDE-99(美国AccuStandard 公司)；pH 7.4 Tris-HCl 缓冲液(实验室配制)；其他试剂均为分析纯，实验用水为二次水。

1.2实验方法

1.2.1光谱法稳态荧光：准确移取1 mL 1.0×10-5mol/L HSA 溶液于10 mL 比色管中，分别加入不同浓度的5′-OH-BDE-99 溶液，并用Tris-HCl 缓冲溶液定容。分别在290，298，310 K温度下恒温5 min，设定参数并测定其荧光光谱。

时间分辨荧光光谱：采用TCSPC 方法测定，设置激发波长280 nm，发射波长334 nm，预设置计数峰值counts 为5000，获得荧光衰减时间。

三维荧光光谱：激发和发射波长范围均为200～500 nm，分别测定HSA 游离体系和5′-OH-BDE-99 -HSA 复合物体系的三维荧光光谱。

紫外光谱：以Tris-HCl 缓冲液作为参比液，测定紫外光谱。

红外光谱：用KBr 压片，测定HSA 游离体系和5′-OH-BDE-99-HSA 复合物体系的红外光谱。

1.2.2动力学模拟法在DELL 服务器、RedHat Linux 系统中进行模拟运算。HSA 晶体结构的代码为1AO6(从蛋白质数据库http://www.rcsb.org/pdb中获得)。

利用Autodock 4.2 进行对接，对接过程中先对蛋白质进行前处理(去水，加氢，加电荷等)，GridBox 为70 Å×70 Å×70 Å，间距0.375 Å。用Lamarckian GA算法运算，将配体小分子5′-OH-BDE-99 与HSA 进行对接。

动力学模拟采用GROMACS 4.6.5程序进行10 ns的运算。模拟力场设定为GROMOS96 43A1，并使用单一点电荷SPC 水模型对HSA 游离体系和HSA-5′-OH-BDE-99 复合物体系分别添加溶剂、建立水盒子、添加抗衡离子、能量最小化，建立平衡系统，计算并进行分子动力学模拟。

2　结果与讨论

2.1计算模拟研究

2.1.1结合作用分析分子对接可用于分析5′-OH-BDE-99 与HSA 的结合作用情况，并确定其结合位点的相关信息。利用Autodock 软件对5′-OH-BDE-99 与HSA 进行对接，结果表明，5′-OH-BDE-99 与HSA 结合在位点Ⅰ(图1A)，其VDW 1.0范围内氨基酸残基以π-cation 作用和疏水作用力的形式键合(图1B)。其中，氨基酸残基Tyr150,Lys195,Arg218,Leu219,Arg222,Leu238,Arg257,Leu260,Ala291 与5′-OH-BDE-99 以疏水作用力结合而形成疏水空腔，说明5′-OH-BDE-99 与HSA 间的结合受到较强疏水作用力影响(图1C)。此外，5′-OH-BDE-99 与氨基酸残基Lys195 和Arg222 间还存在π-cation 作用(图1D)，使二者结合更加稳定，因此引起HSA 的微环境改变。分析配体小分子与HSA 的结合作用，这对维持蛋白大分子的二级结构，如α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲等起到重要作用，即能稳定二者结合所形成的配合物。

图1　5′-OH-BDE-99 在HSA位点Ⅰ的相互作用图Fig.1　The interaction between 5′-OH-BDE-99 and HSA at site ⅠA：binding site(结合位点)；B：VDW 1.0 range of amino acid residues(VDW 1.0范围氨基酸) ；C：hydrophobic force(疏水作用力)；D：π-cation interaction( π-cation 作用)

利用GROMACS 4.6.5 程序并采用MM-PBSA 方法[7]模拟计算结合自由能。在与5′-OH-BDE-99 形成复合物的过程中，HSA每个氨基酸残基对能量均有一定的贡献，其中疏水性氨基酸Ala291,Leu238,Ile290 对自由能贡献较大(图2)，与配体小分子5′-OH-BDE-99 形成稳定的相互作用，说明疏水作用力是促使HSA 与5′-OH-BDE-99 结合的主要驱动力。

图2　不同氨基酸残基对自由能的贡献Fig.2　Different residues contribution of free energy

2.1.2结构分析通过分子动力学模拟可以研究5′-OH-BDE-99 与HSA 结合在位点Ⅰ的水溶液中的动力学情况。根据均方根偏差RMSD、均方根波动RMSF 及蛋白质回旋半径Rg 等可以判断二者相互作用后结构的变化。

HSA 以及其复合物体系的蛋白质相对初始结构偏差(RMSD)见图3A。从整体观察，5′-OH-BDE-99 在整个模拟过程中RMSD 值的变化幅度不大，表明5′-OH-BDE-99 能够与HSA 形成稳定复合物，且使复合物体系趋于稳定。基于残基分析的均方根波动RMSF 可查看局部蛋白质残基柔性的变化(图3B)，HSA 与5′-OH-BDE-99 结合使蛋白氨基酸柔性发生变化，进而使HSA 内部微环境和构象发生改变。蛋白质的回旋半径Rg值用于度量结构的紧密度(图3C)，HSA-5′-OH-BDE-99 体系的回转半径最终稳定在2.6 Å左右，而HSA 游离体系则最终稳定在2.55 Å左右，表明HSA 中加入5′-OH-BDE-99 使HSA 的结构发生变化。HSA 因其结构部分状态改变而变得更膨松，从而说明5′-OH-BDE-99 与HSA 结合时发生了一定的构象改变。

图3　10 ns MD模拟的HSA 体系和HSA-5′-OH-BDE-99体系的 RMSD(A)、RMSF(B)与Rg(C)Fig.3　Root mean square deviation (RMSD，A),root mean square fluctuation(RMSF,B) and radius of gyration(Rg，C) of free HSA and HSA-5′-OH-BDE-99 complexes from 10 ns of MD simulations

图4　10 ns MD模拟的二级结构变化Fig.4　Changes of secondary structure over 10 ns of MD simulation

从疏水性残基可及表面积SASA 与蛋白二级结构变化可以作进一步分析。游离的HSA 与复合体系HSA 比较，疏水性及表面积由144.56 nm2增至166.37 nm2，而亲水性及表面积则从135.97 nm2降至129.98 nm2。加入5′-OH-BDE-99 后，氨基酸间残基的排斥作用增强，导致HSA 的结构变得疏松，HSA 微环境的疏水性增强，二级结构发生变化。同时，从10 ns 模拟后的二级结构变化(图4)可观察到，加入5′-OH-BDE-99 后，α-螺旋与β-桥含量增加，β-转角、弯曲、无规则卷曲、5-螺旋与3-螺旋含量均有所降低。从前后变化可知，加入5′-OH-BDE-99 改变了HSA蛋白的二级结构。

图5　5′-OH-BDE-99 对HSA 的荧光猝灭光谱和Stern-Volmer 曲线Fig.5　Fluorescence spectra of HSA in the presence of 5′-OH-BDE-99 and Stern-Volmer curve [HSA]=1.0×10-6 mol/L;[5′-OH-BDE-99]=0,1,2,3,4,5,6,7,8,9(×10-8 mol/L);298K

2.2实验研究分析

2.2.1稳态荧光荧光猝灭主要分为动态猝灭、静态猝灭和非辐射能量转移[8]。在激发波长为280 nm下，HSA 内源性荧光主要由色氨酸、酪氨酸与苯丙氨酸的氨基酸残基产生，由于苯丙氨酸残基的荧光量子产率很低，可忽略不计。一定温度条件下，随着5′-OH-BDE-99 浓度逐渐增加，HSA 内源性荧光强度呈现有规律的降低(图5)。表明5′-OH-BDE-99 能够与HSA 结合作用，导致HSA 荧光猝灭。采用Stern-Volmer 方程[9]计算猝灭速率常数：F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q]，式中，F0和F分别为游离态HSA 与加入5′-OH-BDE-99复合体系的荧光强度，Ksv为猝灭速率常数，[Q]为5′-OH-BDE-99的平衡浓度，Kq为双分子猝灭速率常数，τ0为无猝灭剂时生物大分子内源性荧光的平均寿命(其值约为10-8s)。

根据Stern-Volmer 方程进行线性拟合，并计算出不同温度下的Ksv和Kq。由图5及表1可知，Kq随温度升高而逐渐降低，且Kq值远大于猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭常数2.0×1010L·mol-1·s-1[10]，因此可判断其猝灭机制为静态猝灭。同时，也说明5′-OH-BDE-99 与HSA 发生相互作用形成了复合物，使HSA 内部的疏水作用力增强，导致HSA 构象变化，使HSA 荧光发生猝灭。

表1　HSA-5′-OH-BDE-99 的荧光猝灭常数、表观结合常数、结合位点数及相关热力学常数*Table 1　Fluorescence quenching constants,apparent binding constants,binding sites and relative thermodynamic parameters of HSA-5′-OH-BDE-99 system*

*R1is the correlation ofKsv,R2is the correlation ofKa(R1为Ksv的相关系数，R2为Ka的相关系数)

图6　HSA 在5′-OH-BDE-99 存在下的时间分辨荧光衰减曲线Fig.6　Time-resolved fluorescence decays curve of HSA in the presence of 5′-OH-BDE-99[HSA]=1×10-6 mol/L

2.2.2时间分辨荧光光谱时间分辨荧光光谱是用于研究蛋白与小分子相互作用的重要工具。根据Lakowicz 理论[11]，利用时间分辨荧光可以区分静态和动态猝灭。图6为HSA 在激发波长280 nm，发射波长334 nm下的时间分辨荧光衰减曲线，加入5′-OH-BDE-99 与HSA 结合后，时间寿命衰减，荧光发生猝灭。另一方面，加入不同浓度5′-OH-BDE-99 后的时间寿命衰减时间在4.20 ns左右(见表2)，变化不大，说明其所处的微环境未发生太大的变化，可知此为静态猝灭。这与稳态荧光得到的结论相吻合，证明了HSA 与5′-OH-BDE-99 发生相互作用后，使蛋白微环境发生改变，进而产生荧光猝灭。

表2　HSA 与HSA-5′-OH-BDE-99 体系的荧光寿命Table 2　Fluorescence lifetime of HSA and HSA-5′-OH-BDE-99 system

2.2.3能量转移为进一步验证其猝灭机理，根据紫外光谱和Förster 偶极-偶极非辐射能量转移理论[12-13]判断其猝灭机制。图7为5′-OH-BDE-99 的紫外吸收光谱图与HSA 的荧光光谱图的重叠图谱，利用矩形分割法将光谱重叠部分分割成极小的矩形面积求和，并依据公式(1～3)[14]进行计算：

J=∑F(λ)ε(λ)λ4Δλ/∑F(λ)Δλ

(1)

R0=8.8×10-25K2N-4φJ

(2)

(3)

式中，J为荧光发射光谱与吸收光谱的重叠积分，R0为E=50%的临界距离，K2=2/3，N为介质折射常数(实验中取水和有机物折射指数的平均值，即1.34)，φ为人血清白蛋白的荧光量子产率。经计算得两光谱重叠区积分为J=3.427×10-14cm3·L·mol-1，临界距离R0=3.13 nm，能量转移效率E=0.304。结合位置与色氨酸残基的距离r=3.60 nm<7 nm，满足0.5R

图7　HSA 荧光光谱(a)与5′-OH-BDE-99吸收光谱(b)的重叠图Fig.7　The overlap of fluorescence spectrum of HSA(a) and absorption spectrum of 5′-OH-BDE-99(b) [HSA]=[5′-OH-BDE-99]=1.0×10-6 mol/L

2.2.45′-OH-BDE-99 与HSA 作用类型的确定 配体小分子与蛋白质大分子的相互作用力主要有4种，分别为疏水作用力、静电引力、范德华力和氢键作用力[16]。利用反应的热力学参数，可判断两者相互作用类型。Ross 等研究表明[17]，ΔH>0,ΔS>0为疏水作用力；ΔH<0，ΔS<0为氢键和范德华力；ΔH<0,ΔS>0为静电作用力；ΔG<0表明为自发反应。根据热力学公式[18]及不同温度下复合物的结合常数Ka，可求出5′-OH-BDE-99 与HSA 相互作用的热力学参数(见表1)，实验结果得到：ΔG<0，ΔH>0，ΔS>0。由此推断5′-OH-BDE-99 与HSA 相互作用为自发的吸热过程，且主要驱动力为疏水作用力。

2.2.5结合位点与表观结合常数的确定配体小分子与蛋白大分子相互作用的结合位点n与表观结合常数Ka可由公式[19]确定：log[(F0-F)/F]=logKa+nlog[Q]。式中F0和F分别为游离态HSA 与加入5′-OH-BDE-99 复合体系的荧光强度，Ka为表观结合常数，n为结合位点数，[Q]为5′-OH-BDE-99 的浓度。根据公式作图可得到不同浓度的5′-OH-BDE-99 对HSA 荧光猝灭的双对数曲线，由双对数曲线的截距与斜率可得5′-OH-BDE-99 与HSA 的表观结合常数Ka和结合位点数n(见表1)。

由表1 可得，实验具有良好的相关系数，结合位点数n约为1，表明在5′-OH-BDE-99 与HSA 作用时可能只有1个结合位点。5′-OH-BDE-99 与HSA 的结合常数在106数量级以上，其结合常数较大且温度对结合常数的影响不大，说明5′-OH-BDE-99 与HSA 的结合能力较强，5′-OH-BDE-99 与蛋白质发生相互作用结合后，可被蛋白质储存和转运。

2.2.6竞争实验竞争结合实验通常用于确定小分子与蛋白大分子作用的结合位点。由于华法林和布洛芬与蛋白质有较强的结合作用，且其结合位点分别在蛋白的位点Ⅰ和位点Ⅱ，故竞争实验中常用华法林和布洛芬作为荧光探针。华法林和布洛芬作为荧光探针能够对蛋白质的不同区域进行特异性结合，从而确定小分子与蛋白大分子相互作用的结合区域及结合位点。由Stern-Volmer 的修正方程[20]可得到竞争实验的结合常数：F0/(F0-F)=1/f+1/(f·Ka·[Q])，式中F0为游离态HSA 体系的荧光发射强度，F为加入5′-OH-BDE-99 后HSA 体系的荧光发射强度，f为修正因子，Ka为结合常数，[Q] 为5′-OH-BDE-99 的浓度。

根据Stern-Volmer 的修正方程可求出加入探针前后的结合常数K。未加探针之前的5′-OH-BDE-99 与HSA 结合常数(2.36×107L/mol)和加入Ibuprofen 后的结合常数(2.24×107L/mol)很接近，而加入Warfarin 后5′-OH-BDE-99 与HSA 的结合常数(0.23×107L/mol)明显小于未加探针之前，说明5′-OH-BDE-99 与HSA 的结合位置在位点Ⅰ结合空腔，此结果与前述分子对接结果相吻合。

2.2.8三维荧光光谱三维荧光光谱提供了蛋白质更多更为详细的二级结构信息[22]，通过比较加入小分子后HSA 的三维荧光光谱图变化，可以获得HSA 的构象和微环境信息，从而判断其结构发生变化(图8)。图8中峰a 是瑞利散射峰(λex=λem)，峰b 为二阶散射峰(2λex=λem)。加入5′-OH-BDE-99 后，由于形成HSA-5′-OH-BDE-99 复合体系而导致HSA 直径增大，瑞利散射增强，荧光强度增加。峰1 是色氨酸和酪氨酸的荧光特征峰，对比图8A和B可知，峰1 荧光强度显著降低且最大发射波长处发生了微弱的蓝移，表明色氨酸极性微环境改变，内部疏水性增强，即HSA 结构变化。峰 2 是HSA 中与螺旋、卷曲等肽骨架结构相关的信息峰，主要由π→π*迁移引起[23]，此峰荧光强度降低且发生微弱的红移，说明加入5′-OH-BDE-99 影响了HSA的 二级结构。

图8　HSA(A)与 HSA-5′-OH-BDE-99 (B)的三维荧光光谱Fig.8　Three-dimensional fluorescence spectra of HSA(A) and HSA-5′-OH-BDE-99 (B) [HSA]=4.0×10-6 mol/L;[5′-OH-BDE-99 ]=2.0×10-7 mol/L

3　结　论

本文采用稳态荧光、时间分辨荧光、傅立叶变换红外光谱、三维荧光光谱及分子对接和动力学模拟等方法，分析了5′-OH-BDE-99 与HSA 间的结合作用情况，结果表明实验研究与计算模拟相一致。5′-OH-BDE-99 对HSA 具有荧光猝灭作用，猝灭机制主要为静态猝灭和非辐射能量转移，结合作用主要驱动力为疏水作用力。通过荧光探针研究以及计算模拟确定5′-OH-BDE-99 特异性结合HSA 在华法林结合位点(位点Ⅰ)。利用傅立叶变换红外光谱、三维荧光光谱及动力学模拟研究了5′-OH-BDE-99 对HSA 二级结构的影响，表明HSA 游离体系和HSA-5′-OH-BDE-99 复合物体系在动力学模拟中能够达到稳定，并发生一定的构象变化。对5′-OH-BDE-99 与HSA 结合作用及其特征的研究，有助于理解羟基化多溴二苯醚类环境干扰物在生物过程中的毒性，还可为其毒理研究提供一定的数据信息。

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Study on the Binding Characteristics of 5′-Hydroxy-2,2′,4,4′,5-pentabromo Diphenyl Ether and Human Serum Albumin

YANG Wu,YANG Lu-lu,WU Zhi-wei,YI Zhong-sheng*

(Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Food Safety and Detection,Collaborative Innovation Center for Water Pollution Control and Water Safety in Karst Area,College of Chemistry and Bioengineering,Guilin University of Technology,Guilin541004，China)

The primary objective of this study is to evaluate the binding characteristics of human serum albumin(HSA) and 5′-hydroxy-2,2′,4,4′,5-pentabromo diphenyl ether(5′-OH-BDE-99) in physiological conditions.Several spectroscopy techniques such as steady-state fluorescence spectroscopy,time-resolved fluorescence,FTIR and three-dimensional fluorescence spectrometry,combined with molecular docking and molecular dynamics simulation were employed to comprehensively analyze the mechanism of interaction between 5′-OH-BDE-99 and HSA.The results of fluorescence spectroscopy experiments,non-radiation energy transfer theory and dynamic simulation showed that 5′-OH-BDE-99 could quench the intrinsic fluorescence of HSA through static quenching mechanism.The experiments of FTIR,three-dimensional fluorescence spectra and dynamic simulation revealed that the binding of 5′-OH-BDE-99 to HSA could induce conformational and microenvironmental changes.Moreover,according to molecular docking and thermodynamic method,hydrophobic force is the main acting force.

polybrominated diphenyl ethers;human serum albumin(HSA);fluorescence spectroscopy;molecular docking;dynamic simulation

2016-03-15；

2016-04-21

国家自然科学基金资助项目(21267008)；广西自然科学基金资助项目(2013GXNSFAA019034)；广西高等学校高水平创新团队及卓越学者计划项目(桂教人〔2014〕49号)

易忠胜，博士，教授，研究方向：化学计量学与环境毒理学，Tel:0773-5898551，E-mail:yzs@glut.edu.cn

研究报告

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.001

O657.3；TQ314.248

A

1004-4957(2016)09-1079-08