陈皮中橙皮苷的溶剂热法提取工艺及检测方法的研究

逄显娟,李　杰,段冷昕,陈克莉

(1.河南科技大学化工与制药学院,河南洛阳 471023;2.河南科技大学医学院,河南洛阳 471003)



陈皮中橙皮苷的溶剂热法提取工艺及检测方法的研究

逄显娟1,李杰2,段冷昕2,陈克莉2

(1.河南科技大学化工与制药学院,河南洛阳 471023;2.河南科技大学医学院,河南洛阳 471003)

以橙皮苷得率为指标,采用溶剂热法提取陈皮中的橙皮苷,通过单因素实验考察了提取温度、乙醇浓度、液料比以及提取时间对橙皮苷得率的影响。在此基础上,利用正交实验法对溶剂热法提取工艺进行了优化。结果表明:提取时间对橙皮苷的得率影响最大,其次是提取温度。优选的橙皮苷提取条件为:提取温度120 ℃,乙醇浓度60%,液料比70∶1 mL·g-1,提取时间45 min,在上述条件下测得橙皮苷得率为6.07%±0.03%。同传统的乙醇回流法相比,溶剂热法的提取时间缩短了近70%,橙皮苷得率约提高1倍。

溶剂热法,陈皮,橙皮苷,正交实验,提取

陈皮(Tangerine peel),芸香科植物宽皮柑橘及其杂种的干燥成熟果皮,是一种药食同源的中药,具有“理气健脾、燥湿化痰”的功效,在临床上常用于治疗胸皖胀满、食少吐泻、咳嗽痰多等症[1],其有效成分包括挥发油、黄酮、多糖、生物碱等物质[2],其中橙皮苷是黄酮类物质的主要成分,也是陈皮的质量控制指标[3]。现代药理研究表明橙皮苷具有抗氧化、抑菌消炎、抗癌、抗肿瘤等作用[4]。此外,橙皮苷还作为食品添加剂、果蔬保鲜剂、抗氧化剂广泛的应用于食品工业[5]。目前,提取橙皮苷的传统方法主要有浸提法、碱提酸沉法和醇回流法[6-7],这些方法操作简单,但橙皮苷的得率较低,且易造成环境污染。近年来,有报道采用微波法[8-9]和超声法[10-11]提取橙皮苷,橙皮苷的得率较高,提取时间也较短,但超声法产生的噪音会对人体产生一定的伤害,微波法使用的仪器比较昂贵,在一定程度上限制了二者的广泛应用。

溶剂热法是一种较新的提取方法,是指将物料置于密闭的反应容器内,然后对体系进行加热提取的一种方法。由于是在密闭的条件下,当提取温度高于溶剂的沸点后,溶剂不会完全汽化,而处于一种临界或超临界状态,从而表现出高活性、高传质速率的特点。目前,关于溶剂热法提取橙皮苷的研究鲜有报道。因此,本研究以陈皮为研究对象,橙皮苷得率为评价指标,考察了溶剂浓度、提取温度、液料比以及提取时间对橙皮苷得率的影响,并借助正交实验,对该提取方法进行了优化,以期建立一种快速、高效、廉价的方法来提取橙皮苷,并为陈皮的深加工及资源的合理利用提供参考和理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

陈皮3 cm×0.5 cm,购自洛阳中药材批发市场;纯净水购自娃哈哈集团公司;甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯,购自天津市科密欧化学试剂有限公司;橙皮苷标准品购自国家标准物质中心。

BT125D双量程电子分析天平德国多利斯公司;PHG9246A电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司;CT14RD高速离心机上海天美生化仪器设备有限公司;天美LC2000液相色谱仪配备LC2030紫外可见检测器,上海天美科学仪器有限公司;KQ2200DE超声波清洗仪昆山市超声仪器有限公司;聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜福建物质结构研究所。

1.2实验方法

1.2.1橙皮苷的提取称取一定量的陈皮粉末(过四号筛)于25 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中,按照料液比加入一定体积分数的乙醇溶液,在不同的条件下进行溶剂热提取,然后移取2 mL提取液以10000 r/min离心分离5 min。移取0.1 mL提取液于10 mL容量瓶中,50%甲醇溶液定容,0.45 μm滤膜过滤,取续滤液作为供试液,用HPLC法测定橙皮苷的含量。

1.2.2橙皮苷的测定

1.2.2.1色谱条件色谱柱:Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相:乙腈-水-磷酸(20∶80∶0.024,V/V);流速:1.0 mL/min;检测波长:283 nm;进样量:20 μL;柱温:室温。

1.2.2.2标准工作曲线的绘制精确称取橙皮苷标准品10.0 mg,50%甲醇溶液定容于200 mL容量瓶中。采用逐级稀释法配制成2.5、5.0、10、15、20 μg/mL的标准溶液。按照1.2.2.1色谱条件测定,以橙皮苷标准品的质量浓度为纵坐标,峰面积为横坐标绘制标准曲线。

1.2.2.3精密度实验取同一橙皮苷标准品溶液,按1.2.2.1中的色谱条件重复进样6次,每次进样20 μL,测定橙皮苷的含量,并计算橙皮苷的RSD值。

1.2.2.4重复性实验平行制备供试液6份,按1.2.2.1项下色谱条件测定橙皮苷的含量,并计算橙皮苷得率的RSD值。

1.2.2.5稳定性实验取同一份供试液室温避光放置,按1.2.2.1项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样20 μL分析,检测橙皮苷的含量,并计算RSD值。

1.2.2.6加样回收率实验精密量取0.3 mL(橙皮苷含量为24.1 μg)的橙皮苷提取液于5 mL容量瓶中,分别加入橙皮苷对照品溶液(50 μg/mL)0.4、0.5、0.6 mL,每个浓度各3份,50%甲醇溶液稀释至刻度,摇匀,进样20 μL,计算橙皮苷的平均加样回收率和RSD值。

1.2.3单因素实验设计

1.2.3.1乙醇浓度对橙皮苷得率的影响在提取温度为90 ℃,液料比为20∶1,提取时间为30 min的条件下,选择体积分数分别为30%、40%、50%、60%、70%的乙醇为提取溶剂,考察乙醇浓度对橙皮苷得率的影响。

1.2.3.2液料比对橙皮苷得率的影响固定乙醇浓度为50%,提取温度为90 ℃,提取时间为30 min,选择液料比为20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1和80∶1 mL·g-1进行实验,探讨液料比对橙皮苷得率的影响。

1.2.3.3提取时间对橙皮苷得率的影响在液料比为60∶1,提取温度为90 ℃,乙醇浓度为50%的条件下,提取时间分别为5、15、30、45、60、75 min,研究提取时间对橙皮苷得率的影响。

1.2.3.4提取温度对橙皮苷得率的影响选择实验条件为液料比60∶1,乙醇浓度50%,提取时间30 min,提取温度控制为90、105、120、135、150 ℃,讨论提取温度对橙皮苷得率的影响。

1.2.4正交实验设计在单因素实验的基础上,以橙皮苷提取率为考察指标,选取提取温度(A)、乙醇浓度(B)、液料比(C)和提取时间(D)为考察因素,各设三个水平,进行L9(34)正交实验优化陈皮中橙皮苷的溶剂热法提取工艺。正交实验因素和水平见表1。

表1　正交实验因素水平表

1.2.5数据处理

1.2.5.1橙皮苷得率的计算根据橙皮苷的标准曲线,采用面积外标法计算供试液中橙皮苷的浓度,并按下式计算橙皮苷的得率:

橙皮苷得率(%)=c×V×n/m×104

式中:c为供试液中橙皮苷的浓度(μg/mL);V为提取溶液体积(mL);n为稀释倍数;m为陈皮质量(g)。

1.2.5.2实验数据处理采用Microsoft Excel和Origin软件对橙皮苷的得率进行数据统计分析和作图。

2　结果与讨论

2.1橙皮苷测定的方法学考察

2.1.1线性关系采用Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈-水-磷酸(20∶80∶0.024,V/V)为流动相,在283 nm下测定橙皮苷[12-13],以橙皮苷质量浓度(Y)对峰面积(X)作图,得到橙皮苷的线性回归方程:Y=0.0782+4.0e-5X,R2=0.9999。橙皮苷在2.5～20 μg/mL内线性良好。空白溶剂、标准品及样品的色谱图见图1。从图1中可以看出,在选定的条件下,样品中的橙皮苷和杂峰在20 min内实现了良好分离,峰形对称不拖尾。

图1　空白溶剂(A)、橙皮苷标准品(B)及样品(C)的高效液相色谱图Fig.1　High performance liquid chromatograms of blank solvent (A)、reference substance (B) and sample注：1.橙皮苷；2.未知物。

2.1.2精密度实验取10 μg/mL橙皮苷标准品溶液按1.2.2.1中的色谱条件重复进样6次,统计色谱峰的面积,计算橙皮苷含量,结果如下:10.03、9.96、10.01、9.97、10.04、10.04 μg/mL,橙皮苷含量平均值为10.01 μg/mL,相对标准偏差RSD=0.35%,说明仪器的精密度良好。

2.1.3重复性实验按照料液比为1∶20称取陈皮粉末于聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中,然后加入体积分数为50%乙醇溶液,在90 ℃提取30 min,平行制备6份样品。依照1.2.1步骤处理提取液,高效液相色谱法检测,橙皮苷的得率分别为:1.82%、1.87%、1.84%、1.81%、1.82%、1.86%,橙皮苷得率的平均值为1.84%,相对标准偏差RSD=1.3%,表明该方法的重复性良好。

2.1.4稳定性实验取2.1.2一份样品,按照1.2.2.5设计时间点进行检测,供试液中橙皮苷的检测结果如下:9.52、9.36、9.32、9.24、9.21、9.17 μg/mL,供试液中橙皮苷含量平均值为9.30 μg/mL,相对标准偏差RSD=1.4%,说明样品在24 h之内基本保持稳定。

2.1.5加样回收实验按照1.2.2.6方法处理样品,按上述色谱条件进行检测,计算回收率。橙皮苷低、中、高质量浓度的平均回收率分别为101.6%、99.3%、97.6%,平均回收率为99.5%,相对标准偏差RSD=2.0%,表明该检测方法具有良好的准确性。

2.2单因素实验结果

2.2.1乙醇浓度对橙皮苷得率的影响由图2可知,橙皮苷的提取率随着乙醇浓度的升高,先增大后减小。乙醇浓度为50%时,提取率达到最大,这是由于橙皮苷在乙醇中的溶解性要优于在水中的溶解性,随着乙醇浓度的增大,提取率随之增大。当乙醇溶度超过50%时,橙皮苷的提取率有降低的趋势,可能是由于高浓度的乙醇使陈皮中的多糖发生凝固,阻碍了乙醇向细胞内的扩散,使得橙皮苷不能有效溶出,导致橙皮苷得率降低,因此实验中以50%的乙醇为提取溶剂较为适宜。

图2　乙醇浓度对橙皮苷得率的影响Fig.2　Effects of ethanol concentration on the yield of hesperidin

2.2.2液料比对橙皮苷得率的影响液料比对橙皮苷得率的影响如图3所示。随着液料比的增加,橙皮苷的得率逐渐增大,提取溶剂体积的不断增大,致使陈皮粉末与溶剂的接触面积亦不断增大,使得橙皮苷的得率不断增大。当液料比大于60∶1(mL/g),橙皮苷的得率降低,这可能是由于在此条件下,橙皮苷在提取溶剂中的溶解量已达到最大,继续增加溶剂体积只会稀释橙皮苷的浓度,从而表现为橙皮苷的得率降低。因此,选择液料比为60∶1较为合适。

图3　液料比对橙皮苷得率的影响Fig.3　Effects of solvent ratio on the yield of hesperidin

2.2.3提取时间对橙皮苷得率的影响对提取时间对橙皮苷得率的影响进行了研究,结果见图4。从图中可以看出,随着提取时间的延长,橙皮苷的得率逐渐增大,但提取时间超过30 min后,橙皮苷的得率趋于平稳。由于溶剂热法是在密闭体系中进行的反应,提取过程中溶剂的自生压力可以有效的加快溶剂的渗透和溶质的扩散速率,因此可以在较短的时间内,使药物细胞内外有效成分的溶解扩散达到平衡,达到提高橙皮苷得率的目的。

图4　提取时间对橙皮苷得率的影响Fig.4　Effects of extraction time on the yield of hesperidin

2.2.4提取温度对橙皮苷得率的影响考察提取温度对橙皮苷得率的影响,结果见图5。由图可知,当温度在90～120 ℃时,橙皮苷的得率随温度的升高逐渐增大。这主要是由于温度的升高,加快了溶剂进出细胞的交换速率,使溶剂和固体组织更加充分接触,有效成分的溶解更加迅速、完全。此外,随着提取温度的升高,体系内溶剂产生的自生压力也随之增大,压力的增大一方面有助于提取溶剂向固体组织渗透、扩散,另一方面也有助于加快植物细胞壁的破裂,有助于提高橙皮苷的得率。当提取温度为120 ℃时,橙皮苷的得率最高,此后随着温度的升高逐渐降低,这可能是由于较高的温度和压力,致使陈皮中的蛋白质变性凝结,阻碍了橙皮苷的溶出。因此,在此条件下橙皮苷的提取温度选择120 ℃为宜。

图5　提取温度对橙皮苷得率的影响Fig.5　Effects of different temperature on the yield of hesperidin

2.3正交实验结果与分析

在单因素实验的基础上,以提取温度(A)、乙醇浓度(B)、液料比(C)以及提取时间(D)为因素按表1进行L9(34)正交实验。由表2的实验结果和极差分析可知,陈皮中橙皮苷的最佳提取条件为A2B3C3D3。由极差分析可知,四种因素对橙皮苷得率的影响强弱依次为提取时间、提取温度、乙醇浓度、液料比。

表2　正交实验结果

2.4最佳工艺条件的验证实验

根据正交实验结果,最佳提取条件为提取温度120 ℃、乙醇浓度60%、液料比70∶1 mL·g-1,提取时间45 min。按此条件,反复进行了三组验证实验。同时采用相同原料,将本法与乙醇回流法[6](乙醇浓度75%,液料比为35∶1,提取温度为85 ℃,提取时间为2.5 h)进行了对比,实验结果见表3。从表3中可以看出,优选得到的溶剂热法条件重复性好,稳定可行。相对于传统的乙醇回流法,溶剂热法提取率高,时间短。其原因主要有以下两个方面,一是温度的影响,温度的升高加快了分子扩散的速度,促进了整个提取过程的质量转移。同时,溶剂的黏度、表面张力也会因温度的升高而降低,黏度和表面张力越低,其渗透性越好,润湿基质的能力就越强,提取效果就越好。二是压力的作用,由于是在密闭的体系中进行提取,温度越高溶剂的自生压力也越大,压力的升高增强了溶剂对基质的穿透能力,促进了细胞壁的破裂,加快了溶质的溶出速度。在实际操作过程中,溶剂热法具有设备简单、操作简便、对环境无污染等优点,有较好的应用价值。

表3　溶剂热法验证实验

3　结论

3.1建立了高效液相色谱法测定陈皮提取液中橙皮苷含量的方法,色谱条件为色谱柱:Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相:乙腈-水-磷酸(20∶80∶0.024,V/V);流速:1.0 mL/min;检测波长:283 nm;进样量:20 μL;柱温:室温。橙皮苷在2.5～20 μg/mL(R2=0.9999)范围内线性良好,回归方程为Y=0.0782+4.0e-5X,平均回收率为99.5%,相对标准偏差RSD为2.0%,该方法可用于陈皮药材中橙皮苷的含量测定以及质量评价。

3.2在单因素实验的基础上,采用正交实验法对橙皮苷的溶剂热法提取工艺参数进行了优化。结果表明,影响橙皮苷溶剂热法提取工艺的主次因素的顺序为提取时间、提取温度、乙醇浓度、液料比。溶剂热法提取陈皮中橙皮苷的最佳条件为:提取温度120 ℃,乙醇浓度60%,液料比70∶1 mL·g-1,提取时间45 min,在上述条件下橙皮苷的得率为6.07%±0.03%。与传统的乙醇回流提取法相比,溶剂热法具有得率高(提高1倍)、时间短(缩短近70%)、操作简单等优点,该提取工艺为陈皮中橙皮苷的提取以及其它黄酮类化合物的提取提供了一种新方法、新途径。

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Study on solvothermal extraction and determination of hesperidin from Tangerine peel

PANG Xian-juan1,LI Jie2,DUAN Leng-xin2,CHEN Ke-li2

(1.School of Chemical Engineering and Pharmaceutics,HenanUniversity of Science and Technology,Luoyang 471023,China;2.Medical College,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

The purpose of this paper was to study the optimum technology parameters of hesperidin extraction from the tangerine peel by using the orthogonal experiment on the basis of single factor experiment. Extracting temperature,extracting reagent concentration,ratio of liquid to solid,extraction time and its optimum level range were also investigated using single factor experiment design and orthogonal experiment design. Results showed that the influences of extraction time on extraction of hesperidin was the largest,and then was extraction temperature. The optimum technological parameters for hesperidin extraction by thermal solvent method from tangerine peel were obtained as follows:120 ℃,60% ethanol solution,70∶1 mL·g-1of the ratio of liquid to solid,45 min. Under the above optimum conditions,the yield of hersperidin was 6.07%±0.03%. Comparing with traditional ethanol reflux method,the solvothermal method could shorten the 70% extraction time and increase the 100% yield of hersperidin.

solvothermal;tangerine peel;hersperidin;orthogonal design;extraction

2016-03-04

逄显娟(1981-)，女，博士，讲师，研究方向：天然药物化学， E-mail:xjpang2001@sina.com。

国家自然科学基金(U1204826)；河南科技大学青年科学基金项目(2015QN050)；河南科技大学大学生训练计划(SRTP)( 2015115)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)18-0267-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.042