耐高糖面包酵母发酵工艺优化

窦冰然,郭会明,骆海燕,洪厚胜,3,*

(1.南京工业大学化学与分子工程学院,江苏南京211816;2.南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京211816;3.南京汇科生物工程设备有限公司,江苏南京210009)



耐高糖面包酵母发酵工艺优化

窦冰然1,郭会明1,骆海燕2,洪厚胜2,3,*

(1.南京工业大学化学与分子工程学院,江苏南京211816;2.南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京211816;3.南京汇科生物工程设备有限公司,江苏南京210009)

为了优化耐高糖酵母发酵工艺,基于培养温度、摇床转速、装液量、初始pH、菌体接种量五个因素的单因素实验的结果,之后对装液量、初始pH、菌体接种量进行响应面优化实验。结果表明,最佳工艺条件为:培养温度30 ℃,摇床转速200 r/min,装液量8.4%,pH4.7,接种量7.4%,在此条件下,酵母细胞干重提高了55.72%。同时,利用5.0 L机械搅拌罐以溶氧反馈流加、恒速流加、间歇流加三种糖蜜补充方式进行酵母细胞培养,绘制生长曲线,发现以溶氧反馈流加方式补充糖蜜更有利于酵母繁殖,最大酵母湿重达到143.95 g/L,达到了耐高糖面包酵母高密度发酵的实验水平,确定了酵母最佳的流加补料方式。

耐高糖面包酵母,响应面法,流加培养,优化

面包酵母是一种氨基酸含量较高的单细胞微生物,蛋白质含量在50%左右,并且含有丰富的B族维生素,酶系与生理活性物质[1]。早在几千年前人类就使用面包酵母来发酵面包以及酒类,在现代食品工业中,也被广泛用作人类主食的制作,如作为馒头、面包、包子、饼干糕点等面制食品的优良发酵剂与营养剂[2-4]。在多数情况下,烘烤制品是需要加糖的,有时蔗糖与面粉比高达25%,普通的酵母在这种高糖情况下生长会受到抑制,传统的高糖类面包制作利用加大酵母的使用量来弥补发酵力的不足,但是为了降低制作成本,这就需要使用耐高糖的酵母来保证良好的发酵特性[5-7]。

近年来针对耐高糖面包酵母的研究,多主要集中于菌种的分离筛选及应用方面,但对于其发酵过程的相关优化研究则报道不多。刘青等[8]通过制备的耐高糖酵母单倍体发酵筛选出了具有高发酵力的菌株。杜鹃[9]通过椴树蜜筛选分离出耐高糖酵母菌株,并将其应用于发酵生产蜂蜜醋饮料。Saksinchai S等[10]通过从蜂蜜中筛选出耐高糖酵母菌种,并研究了所选菌种的基因序列相关性。本实验利用市售耐高糖面包酵母分离筛选出菌株,并通过单因素与响应面法进一步优化该菌株的摇瓶条件下发酵工艺参数,通过分析确定最优工艺参数,有效提高酵母生物量并提供有效的理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

安琪牌耐高糖面包活性干酵母市售;斜面培养基(YPD固体培养基)葡萄糖2%,酵母膏1%,蛋白胨2%,琼脂1.5%～1.7%;一级种子培养基(YPD液体培养基)葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母膏1%;二级种子培养基(糖蜜培养基)处理稀释后含糖量25%的甘蔗糖蜜10%,MgSO40.1%,(NH4)2SO40.05%;发酵培养基处理稀释后含糖量25%的甘蔗糖蜜37%,尿素(含氮量10 g/100 mL)14%,(NH4)H2PO4(含磷量以P2O5计10 g/100 mL)1.2%,MgSO47.5 g,维生素B10.2 g,维生素B50.2 g,维生素B60.2 g,生物素0.1 g。

UVmini-1240紫外可见分光光度计岛津制作所;TGL-20B高速台式离心机上海安亭科学仪器厂;MGF-5 5.0 L机械搅拌玻璃发酵罐南京汇科生物工程设备有限公司。

1.2实验方法

1.2.1种子液培养称取1%活性干酵母于YPD 液体培养基中,30 ℃,200 r/min,振荡培养24 h;取0.1 mL菌液,稀释涂布于YPD固体培养基平板上,置于 30 ℃恒温培养箱培养2 d;挑取菌体划线培养,经1次活化,挑取单菌落,斜面保藏。将斜面保藏的酵母菌接一环于YPD液体培养基中,30 ℃,200 r/min 培养,作为发酵用种子液。

1.2.2初始发酵培养条件250 mL三角瓶装40 mL培养基,接种量10%,初始pH4.8,30 ℃,220 r/min,摇瓶培养24 h。

1.2.3菌体生物量的测定比浊法:酵母菌体的生长引起发酵液混浊度的增高。通过紫外分光光度计测定一定波长下的OD值,以此判断酵母的生长状况。在600 nm下测定适当稀释的发酵液的OD值。

酵母湿重:取发酵液10 mL,10000 r/min离心两次,每次10 min。

酵母干重:将上述离心后弃去上清液的酵母菌体,在105 ℃烘箱中干燥至恒重,即为酵母干重。

1.2.4酵母发酵时间的测定将酵母种子液按10%的接种量接种于装有250 mL YPD液体培养基的三角瓶中,再分装于15个50 mL三角瓶中,装液量均为10 mL,摇床培养,设置温度30 ℃,转速200 r/min。以刚放入摇床为0 h,每隔2 h取出一个三角瓶,测定发酵液的OD600 nm。以时间为横坐标,OD600 nm值为纵坐标绘制出酵母的生长曲线。

1.3实验设计

1.3.1温度单因素实验在二级种子培养基的基础上,对酵母的发酵条件进行优化,以温度为单因素进行实验,设置五个水平,分别为26、28、30、32、34 ℃。其他培养条件为转速200 r/min,装液量16%,接种量10%,初始pH4.8。测定酵母细胞干重,绘制曲线进行对比,设置3次重复。

1.3.2转速单因素实验以转速为单因素,设置五个水平,分别为140、160、180、200、220 r/min。其他培养条件为温度30 ℃,装液量16%,接种量10%,初始pH4.8。测定酵母细胞干重,绘制曲线进行对比,设置3次重复。

1.3.3装液量单因素实验以装液量为单因素,设置五个水平,分别为4%、10%、16%、22%、28%。其他培养条件为温度30 ℃,转速200 r/min,接种量10%,初始pH4.8。测定酵母细胞干重,绘制曲线进行对比,设置3次重复。

1.3.4初始pH单因素实验以初始pH为单因素,设置五个水平,分别为4.2、4.5、4.8、5.1、5.4。其他培养条件为温度30 ℃,转速200 r/min,接种量10%,装液量10%。测定酵母细胞干重,绘制曲线进行对比,设置3次重复。

1.3.5接种量单因素实验以接种量为单因素,设置五个水平,分别为4%、8%、12%、16%、20%。其他培养条件为温度30 ℃,转速200 r/min,初始pH4.8,装液量10%。测定酵母细胞干重,绘制曲线进行对比,设置3次重复。

1.3.6响应面设计在单因素实验的基础上,选取对酵母生长影响大的三个因素:装液量、pH、接种量,以酵母干重为响应值利用Design-Expert8.0.5b软件进行3因素3水平的Box-Behnken响应面设计,优化耐高糖面包酵母培养条件。响应面实验的因素水平表见表1。

表1　响应面设计因素水平表

1.3.7酵母流加方式对比实验5.0 L罐中糖蜜流加策略对比实验 取一环斜面保藏的酵母菌于一级种子培养基,以30 ℃,200 r/min,摇瓶培养24 h为条件制备一级种子液;取一级种子液30 mL以接种量7.4%制备二级种子液350 mL,pH4.7,其他培养条件与一级种子液相同。将二级种子液以10%接种量接于5.0 L机械搅拌罐中,分别以恒速流加、间歇流加、溶氧反馈流加三种方式流加糖蜜,发酵26 h后,以时间为横坐标,酵母菌体湿重为纵坐标,绘制酵母发酵曲线。

1.4数据处理

实验所用到的数据分析软件:Design-Expert(8.0.5b),SPSS Statistics(17.0)。

2　结果与讨论

2.1酵母发酵时间的确定

从图1可知,耐高糖活性干酵母在YPD液体培养基中,0～6 h处于迟滞期,6～24 h处于对数生长期,24 h之后达到平稳期,因此将优化实验的发酵时间设为24 h。

图1　酵母生长曲线Fig.1　Growth curve of yeast

2.2单因素实验

2.2.1培养温度对酵母干重的影响由图2中可以看出,当培养温度由26～30 ℃,随着温度的升高,酵母的细胞干重随之增加,当培养温度达到30 ℃时,酵母干重达到最大值,当培养温度大于30 ℃,酵母干重逐渐下降,但26～32 ℃之前酵母干重变化不大,随着温度的增加,酵母干重并没有较大的改变,当温度为34 ℃时,酵母干重下降明显,因此选择酵母培养的最佳温度30 ℃作为响应面实验培养温度。

图2　温度对酵母干重的影响Fig.2　Effect of temperature on dry weight of yeast

2.2.2转速对酵母干重的影响由图3可以看出,当转速由140 r/min增加到200 r/min时,酵母的干重随之增加,但转速在140～200 r/min之间变化趋势较为平稳;当转速大于200 r/min时,酵母干重逐渐下降,当转速增加到220 r/min时,酵母干重低于180 r/min时的酵母干重,因此选择酵母培养的最佳转速200 r/min作为响应面实验摇床转速。

图3　转速对酵母干重的影响Fig.3　Effect of rotational speed on dry weight of yeast

2.2.3摇瓶装液量对酵母干重的影响由图4可以看出,当摇瓶装液量从4%～10%时酵母的干重随之增加,在10%时达到最大值;当装液量大于10%,酵母干重逐渐下降。从装液量4%～16%的变化过程中,酵母干重有一个明显的先增加后减少的趋势,故选择摇瓶装液量为10%较为合理。

图4　装液量对酵母干重的影响Fig.4　Effect of broth content on dry weight of yeast

2.2.4初始pH对酵母干重的影响由图5中可以得出,当初始pH由4.2～4.8时,酵母的干重随之增加,在pH4.8时达到最大值;当初始pH大于4.8时,酵母干重逐渐降低。因此,选择培养基初始pH为4.8较为适宜。

图5　pH对酵母干重的影响Fig.5　Effect of pH on dry weight of yeast

2.2.5接种量对酵母干重的影响由图6可以看出,当接种量从4%～8%时,酵母的干重随之增加,在8%时达到最大值;当菌体接种量大于8%时,酵母干重逐渐下降。因此,选择菌体接种量8%较为适宜。

图6　接种量对酵母干重的影响Fig.6　Effect of inoculation amount on dry weight of yeast

表2　响应面实验设计方案与结果

2.3响应面优化实验

2.3.1实验结果与模型建立响应面优化实验方案与结果见表2。利用Design-Expert 8.0.5对表2数据进行二次多元多元回归拟合,得到以酵母干重对编码自变量A、B、C的二次多项回归方程:酵母干重(g/L)=16.79-1.20A-0.50B-0.18C+3.72AB+0.68AC-0.05BC-4.29A2-2.75B2-1.22C2。对数学模型进行的方差分析及显著性结果见表3。由表3可知,此回归方程模型极显著(p<0.0001<0.05),失拟项p=0.8755>0.05,说明该模型失拟性检验结果不显著,此模型对于实验数据的拟合度较高,实验误差较小,该模型可以用于分析和预测酵母干重的结果[11]。对于模型回归方程系数的显著性实验表明,一次项系数A、B、C,交互系数AB、AC,二次项系数A2、B2、C2影响极显著。F值反映了各个因子对于响应值得重要性,F(A)>F(B)>F(C),说明3个影响因子对于酵母干重的影响强弱顺序为:装液量>pH>接种量。

注:*:表示差异显著,p<0.05;**:表示差异极显著,p<0.01。

2.3.2响应面分析与优化根据上述拟合出的回归方程绘制响应面分析图,以确定装液量、pH、接种量3个因素对酵母细胞干重的影响,响应面曲面和等高线图见图7～图9。由图7～图9可知,摇瓶装液量和初始pH、装液量和接种量的交互作用较强,pH与接种量交互作用较弱。该模型预测的最佳摇瓶发酵工艺条件为:装液量8.39%,pH4.69,接种量7.42%,此条件下酵母细胞干重的预测值为17.0325 g/L。

图7　pH、装液量及其交互作用对酵母干重影响的响应面图Fig.7　Response surface for the effect of pH and liquid volume on dry weight of yeast

图8　接种量、装液量及其交互作用对酵母干重影响的响应面图Fig.8　Response surface for the effect of inoculation amount and liquid volume on dry weight of yeast

图9　接种量、pH及其交互作用对酵母干重影响的响应面图Fig.9　Response surface for the effect of inoculation amount and pH on dry weight of yeast

2.3.3最佳摇瓶发酵工艺条件的验证在预测出最佳工艺条件的基础上,考虑到实际操作中的简便性等问题将该条件修正为:培养温度30 ℃,摇床转速200 r/min,装液量8.4%,pH4.7,接种量7.4%,在此工艺条件下,重复实验3次,得到酵母细胞干重16.88 g/L,验证值和模拟值较为接近,说明采用响应面法得到的该模型结果较为可靠[12],拥有一定实用价值。与初始发酵培养结果酵母细胞干重10.84 g/L相比,优化后结果提高了55.72%。

2.45 L罐中糖蜜流加策略对比实验

将工艺优化后的二级种子液接种于5 L机械搅拌罐中,通过三种不同的糖蜜流加方式进行培养,绘制酵母生长曲线实验结果见图10,由图10可知,0～7 h流加方式不同对于酵母生长没有产生明显差别,7 h之后,通过在使用溶氧反馈流加方式补充糖蜜条件下,酵母的生长情况明显优于恒速流加与间歇流加方式,在26 h发酵结束时,利用溶氧反馈流加培养的酵母最大湿重为143.95 g/L。

图10　三种不同流加方式对酵母菌体浓度的影响Fig.10　The effects of three different feedingmethods on yeast concentration

溶氧反馈式流加是一种底物限制性流加方式。在糖蜜限制培养的条件下,补入的葡萄糖很快会被菌体利用,根据菌体的底物比消耗速率的改变,溶氧也随之改变。因此,随着糖蜜的不断流加,溶氧处于振荡状态,能够给予菌体生长一定的氧气,有利于菌体的快速增殖,同时可有效避免副产物积累。与恒溶氧流加比较,恒速流加方式下,菌体增长较慢,酵母湿重稍小[13]。这是因为补料初期糖蜜浓度充足,有利于细胞生长,但补料后期,糖蜜浓度较低,菌体生长所需要的碳源无法及时供应,使得在细胞生长最旺盛时,没有及时补加充足的营养和氧气,从而导致酵母菌体的生产强度减弱,效率降低[14]。而间歇流加方式是一种每隔一段时间一次性补入较多的糖蜜的方式,其在罐内的糖浓度容易产生残留,且瞬时残糖较高,波动较大,造成底物抑制,菌体生长也就变得缓慢且生产效率低[15]。

3　结论

对耐高糖面包酵母的培养条件进行了优化,在单因素实验的基础上,利用响应面优化的方法确定了其二级种子最佳工艺条件:培养温度30 ℃,摇床转速200 r/min,装液量8.4%,pH4.7,接种量7.4%,在此工艺条件下,与优化前的初始发酵条件下培养的酵母细胞干重10.84 g/L相比,优化后结果提高了55.72%。而在酵母上罐培养阶段,实验发现相比于恒速流加和间歇流加,以溶氧反馈流加方式补充糖蜜更有利于酵母的快速繁殖,上罐过程中最大菌体湿重为143.95 g/L。

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Optimization of fermentation process of sugar-tolerant bread yeast

DOU Bing-ran1,GUO Hui-ming1,LUO Hai-yan2,HONG Hou-sheng2,3,*

(1.Nanjing Tech University,College of Chemistry and Molecular Engineering,Nanjing 211816,China;2.Nanjing Tech University,College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing 211816,China;3. Nanjing Highke Bioengineering Equipment Co.,Ltd.,Nanjing 210009,China)

In order to optimize the sugar-tolerant bread yeast fermentation process,the conditions including fermentation temperature,rotation speed,liquid volume,initial pH,inoculation amount were optimized by experiment of single factor at first. Based on the experimental result,liquid volume,initial pH,inoculation amount were chosen to study on response surface optimization. The experimental results indicated that the optimum conditions were as follows:temperature at 30 ℃,rotation speed 200 r/min,8.4% liquid volume,pH4.7,7.4% inoculation amount. The condition increased dry weight of yeast by 55.72%. At the same time,by making growth curve to compare three methods including dissolved oxygen feedback feeding,constant feeding,intermittent feeding in 5.0 L mechanical stirring fermentation tank. It showed that the dissolved oxygen feedback feeding is best and the maximum wet yeast weight reached 143.95 g/L,the experiment reached the level of high density fermentation of sugar-tolerant bread yeast,and determine the optimal feeding mode of yeast.

sugar-tolerant bread yeast;response surface method;feeding cultivation;optimization

2016-03-24

窦冰然(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：食品发酵与分析检测，E-mail:835066485@qq.com。

洪厚胜(1965-)，男，博士，教授，研究方向：生物过程及生化反应设备， E-mail:hhs@njtech.edu.cn。

国家高技术研究发展计划(863计划)-生物过程关键技术及装备开发(2012AA021201)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)18-0208-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.031