地衣芽孢杆菌Bacitracin A高产工业培养基优化

徐　超,吕凤霞,别小妹,陆兆新

(南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095)



地衣芽孢杆菌Bacitracin A高产工业培养基优化

徐超,吕凤霞,别小妹,陆兆新*

(南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095)

为了降低杆菌肽工业发酵生产成本,提高有效成分杆菌肽A产量,采用单因素实验,寻找目前发酵培养基中黄豆粉与玉米粉的廉价替代成分,并通过Box-Behnken响应面法优化筛选后工业培养基。结果表明:小麦麸皮可以取代玉米粉与黄豆粉,作为发酵培养基中唯一有机碳氮源,有效降低发酵成本。响应面优化工业培养基为:麸皮50.3 g/L,硫酸铵1.53 g/L,磷酸二氢钾1.43 g/L,在此条件下预测杆菌肽A最大产量为1.70 g/L。经实验验证,杆菌肽A产量可以达到1.78 g/L。使用优化后的培养基,发酵结束后,菌体芽孢数量及转化率较高,芽孢数可以达到1.25×1011CFU/mL。本研究提供的培养基可同时达到高产,降低成本,高芽孢形成率的效果。

杆菌肽A,高产,响应面

饲料中添加微生态制剂,能够改善动物肠道菌群平衡,提高动物免疫力,提高畜产品的质量[1-2]。芽孢是芽孢杆菌的休眠体,能够帮助微生态制剂通过胃部低酸环境[3],到达肠道发挥作用。所以芽孢数是衡量芽孢杆菌类微生态制剂产品优劣的标准。地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis),能产生多种多肽类抗菌素[4],丰富的胞外酶[5-6]及生物活性物质[7],并且产生的物质对环境和有机体没有危害,是FDA[8]公认安全菌株,杆菌肽[9]是由地衣芽孢杆菌产生的一种对革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌有广谱抑制作用的环肽[10]。根据氨基酸组成和位置的不同,现已发现15种同系物,其中bacitracin A分子式为:C66H103N17O16S,是其中主要的活性物质,生物活性也最强[11]。杆菌肽有高效、无残留及无毒副作用、不产生耐药性及交叉耐药性、排泄快等优点[12],因此杆菌肽及地衣芽孢杆菌微生态制剂广泛应用于饲料农业[13-14]等。

杆菌肽发酵生产使用地衣芽孢杆菌,目前发酵生产培养基以玉米淀粉、豆粕粉、黄豆粉为主要的碳、氮源[15-16],发酵过程需要补料和控制pH,过程复杂能耗高而且培养基成本较高。一些研究通过代谢调控及基因工程可以提高杆菌肽的产量[17-19],但是包括培养基优化在内的研究均使用现有培养基,没有对培养基成本进行考虑,成本较高。如果能够找到取代黄豆粉和玉米粉的廉价培养基成分,并减少培养基组成,可以有效地降低生产成本,提高利润。我国作为农业大国,有很多谷物加工的副产物,仅小麦麸皮的年产量就超过2000 t。如果能以谷物加工副产物取代黄豆粉与玉米粉,不但能提高低值副产品的利用率,还能大幅度降低杆菌肽生产成本,提高经济效益。

麸皮作为谷物加工的主要副产物[20],有丰富的营养价值,可以为微生物生长代谢提供足够营养物质。本文以麸皮为研究对象,探究了以麸皮为主要碳氮源来发酵生产杆菌肽A的可能性。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

出发菌株菌种实验室保存地衣芽孢杆菌F2-X1;杆菌肽标准品(杆菌肽A含量47.1%)德国Dr.Ehrenstorfer公司;乙腈、三氟乙酸色谱纯，德国默克公司;其他试剂均为分析纯,国药集团;种子培养基(g/L)酵母膏5.0,胰蛋白胨10.0,氯化钠10.0,pH调至7.0,1.00×105Pa灭菌30 min;发酵培养基(g/L)黄豆粉40.0,玉米粉15.0,硫酸铵1.0,磷酸氢二钾0.40,pH调至7.0,1.00×105Pa灭菌30 min。

TOMY SX-700高压蒸汽灭菌锅日本TOMY公司;PYX-DHS-50X65隔水式电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂;全温摇瓶柜江苏太仓实验设备厂;电子精密天平北京赛多利斯天平有限公司;AY120万分之一天平日本岛津公司;超净工作台苏净集团安泰公司;804R高速冷冻离心机Eppendorf公司;pH计美国Orion公司;LABOROTA-4001旋转蒸发仪德国Heidolph公司;Dionex UltiMate 3000高效液相色谱系统美国赛默飞公司。

1.2实验方法

1.2.1杆菌肽A的HPLC检测

1.2.1.1HPLC条件以A:水+0.1%三氟乙酸;B:乙腈+0.1%三氟乙酸,为流动相进行梯度洗脱,其中,A相由30%线性增长为40%,时间为20 min。进样量20 μL,检测波长为220 nm,柱温25 ℃。

1.2.1.2标准曲线的绘制精密配制浓度为2.00、1.00、0.80、0.60、0.40、0.20 g/L杆菌肽标准溶液,HPLC检测峰面积,每个浓度检测3次。以杆菌肽A峰面积平均值为纵坐标,杆菌肽A浓度为横坐标,绘制标准曲线。

1.2.2不同培养基发酵效果比较用接种环挑取斜面保藏菌种,接种于种子培养基,37 ℃,180 r/min培养12 h作为种子液。

分别以小米糠、米糠、小麦麸皮取代发酵培养基中的玉米粉和黄豆粉,添加量均为55.0 g/L,其他成分不变,装于250 mL三角瓶中,装液量为50 mL,接种量1%,37 ℃,180 r/min培养48 h。发酵结束后,取10 mL发酵液10000 r/min,4 ℃离心10 min除菌体和残渣,取上清加两倍体积乙醇振荡30 min,离心,取上清过0.22 μm滤膜,HPLC法检测杆菌肽A产量。每组实验重复3次。不同培养基成分见表1。

表1　不同培养基组成

1.2.3单因素实验以1.2.2中4号培养基为基础培养基,进行单因素实验。发酵条件与1.2.2所述相同,发酵结束后HPLC法测定杆菌肽A产量,以考察不同成分的添加量的范围,每组实验重复3次。其中,麸皮添加水平为20.0、40.0、60.0、80.0 g/L;硫酸铵添加水平为0.50、1.00、1.50、2.00 g/L;磷酸氢二钾添加水平为0.60、1.00、1.40、1.80 g/L。当麸皮、硫酸铵、磷酸二氢钾水平分别变化时,另外两个因素不变且添加量与1.2.2中4号培养基相同。

1.2.4响应曲面优化利用Design-Expert软件,根据单因素实验,以麸皮、硫酸铵、磷酸二氢钾为自变量,以杆菌肽A产量为响应值,根据Box-Behnken中心组合实验原理,设计三因素三水平实验[17]。因素水平见表2。

表2　Box-Benhnken实验因素与水平

1.2.5优化后培养基芽孢生成量使用文中1.2.4优化后培养基,37 ℃,180 r/min培养48 h,发酵结束后,取1 mL发酵液进行梯度稀释,计算菌体数,记为A。另取1 mL发酵液,80 ℃水浴20 min,同样进行梯度稀释,计算芽孢数,记为B。计算芽孢转化率。其中,转化率(%)=A/B×100。

1.2.6数据处理实验中数据处理采用Origin软件,对实验所得数据进行平均值及标准差计算。相应曲面实验设计及统计分析使用Design-Expert软件。

2　结果与分析

2.1杆菌肽A标准曲线

采用方法1.2.1所述杆菌肽A检测方法,所得峰面积采用Origin软件取平均值,以杆菌肽A峰面积平均值为纵坐标,杆菌肽A质量浓度为横坐标绘制标准曲线。得到线性回归方程为y=23.45x-1.04,线性范围为0.094～0.94 g/L,相关性系数为0.9991。

图1　杆菌肽A标准曲线Fig.1　Standard curve of Bacitracin A

2.2培养基的确定

以不同种麸皮为主要碳氮源取代黄豆粉和玉米粉进行发酵,发酵结束后HPLC法检测杆菌肽A产量,如图2所示,其中小麦麸皮发酵产量达到1.41 g/L,高于黄豆粉、玉米粉培养基的1.31 g/L,表明,小麦麸皮可以取代黄豆粉与玉米粉。黄豆粉或玉米粉的价格是小麦麸皮3～5倍,现在生产用培养基中黄豆粉和玉米粉添加量在50.0 g以上,可以有效降低生产成本。

图2　不同培养基产量Fig.2　Different medium composition

小麦麸皮效果明显优于小米糠和米糠,而小米糠和米糠则达不到原有产量。当以不同麸皮进行1∶1配比时,产量同样没有黄豆粉、玉米粉培养基高,且远低于小麦麸皮培养基。虽然麸皮、小米糠与米糠都是谷物加工过程中的副产物,主要营养成分种类基本相同,但含量之间存在差别,麸皮中碳水化合物含量在40%以上[21],而米糠和小米糠中碳水化合物含量低于30%。推测麸皮中的营养成分组成更适合地衣芽孢杆菌利用,并代谢产生杆菌肽A。所以选择小麦麸皮为培养基主要碳氮源进行发酵生产杆菌肽A。

2.3单因素实验

2.3.1麸皮添加量对杆菌肽A产量的影响本实验培养基中没有葡萄糖等速效碳源,因为速效碳源被菌体很快利用后,分解代谢产物对次级代谢酶类的合成有阻遏作用,只有这些速效碳源消耗尽之后,阻遏作用被解除,菌体才转入次级代谢产物合成阶段。而地衣芽孢杆菌可以产生纤维素酶[5]和蛋白酶[6],降解麸皮中的纤维素和蛋白类物质,为菌体生长提供有机碳氮源,也可提供杆菌肽合成的氨基酸前体。

从图3可以看出,麸皮添加量对杆菌肽A产量有很大影响,当麸皮含量由20.0 g/L增加到40.0 g/L时,产量提高了1倍左右。因为实验所用培养基成分简单,麸皮为主要的营养成分且营养丰富[22],当培养基中麸皮含量较低时,不能达到地衣芽孢杆菌营养需求,所以在提高麸皮含量的同时,杆菌肽A的产量增加。当麸皮浓度从40.0 g/L增加到80.0 g/L时,杆菌肽A产量降低。这是因为过多的麸皮会增加培养基的粘稠度,使溶氧降低,地衣芽孢杆菌经次级代谢途径产生杆菌肽A时,需要氧作为电子受体,所以麸皮含量过高时,限制杆菌肽A产生的主要因素变为溶氧[23]。同时溶氧过低也会导致菌体密度下降,进而影响次级代谢产物积累。

图3　不同添加量麸皮对产量的影响Fig.3　The influence of different bran addition on the production

2.3.2硫酸铵添加量对杆菌肽A产量的影响硫酸铵添加量对杆菌肽A产量的影响如图4所示,当硫酸铵添加量增加到1.50 g/L时,产量达到最大。在生长初期,麸皮中多肽或蛋白类物质没有降解,无法提供有机氮源。氮源是微生物生长代谢所必须的元素,硫酸铵中铵离子可以为菌体生长和代谢提供无机氮源。

图4　不同硫酸铵添加量对产量的影响Fig.4　The influence of different(NH4)2SO4addition on the production

2.3.3磷酸二氢钾添加量对杆菌肽A产量的影响从图5可以看出,随着磷酸二氢钾含量的增加,杆菌肽A产量先增加后降低,当添加两位1.40 g/L时产量最高。磷酸盐是地衣芽孢杆菌经非核糖体合成途径合成杆菌肽[24]所必须的,氨基酸前体的活化及一些与代谢有关酶的合成都与磷酸根有关,而且添加量高与低都会抑制杆菌肽合成[25]。

图5　不同磷酸二氢钾添加量对产量的影响Fig.5　The influence of different KH2PO4addition on the production

2.4Box-Behnken实验设计和响应面

2.4.1模型建立及显著性检验以杆菌肽A产量为响应值,根据实验结果,利用Design-expert软件对数据进行二次回归模拟,得到回归方程:

杆菌肽A产量=1.60+0.33A+0.0028B+0.071C+0.024AB-0.094AC-0.13BC-0.31AA-0.098BB-0.14CC

表3　Box-Behnken实验设计与结果

由表4可以看出,模型显著,失拟项不显著,模型的相关系数为R2=97.28%,调整后的R2=93.79%,模型能很好的预测发酵培养基组分与杆菌肽A产量的关系,可信度较高。因素A(麸皮)对杆菌肽A产量的线性效应是极显著的(p<0.001),因素C(磷酸二氢钾)的影响是显著的(p<0.05)。BC的交互作用的显著的(p<0.05)。

表4　方差分析

2.4.2响应面优化及分析由图6～图8可以看出，各因素对响应值(杆菌肽A产量)的影响。麸皮对杆菌肽A产量的影响最大,磷酸二氢钾次之,硫酸铵最小。等高线图中全部为椭圆形,表明个因素之间均有一定的交互作用。从图6可以看出,当磷酸二氢钾浓度一定的情况下,在麸皮含量较低时,随着麸皮含量的增加,杆菌肽A的产量是增加的,当麸皮量增加到50.3 g/L时,随着麸皮含量的增加,杆菌肽A的产量降低,二者存在交互作用。图7表示了麸皮和硫酸铵的交互作用。在硫酸铵含量一定的情况下,杆菌肽A的产量随麸皮含量的变化也是先增加后降低的,等高线的形状为椭圆形,二者同样有交互作用。图8表示硫酸铵和磷酸二氢钾的交互作用显著。等高线磷酸二氢钾的交点多于硫酸铵,表明磷酸二氢钾的作用更明显。当硫酸铵含量一定时,随着磷酸二氢钾含量的增加,杆菌肽A的产量先增加后降低,并且在不同的硫酸铵浓度下变化幅度存在差别,两者交互作用明显。

图6　麸皮和磷酸二氢钾对杆菌肽A产量影响Fig.6　Combined effects of barn and KH2PO4on the bacitracin A production

图7　麸皮和硫酸铵对杆菌肽A产量影响Fig.7　Combined effects of barn and(NH4)2SO4on the bacitracin A production

图8　硫酸铵和磷酸二氢钾对杆菌肽A产量影响Fig.8　Combined effects of(NH4)2SO4 and KH2PO4on the bacitracin A production

2.5最佳培养基的确定及验证

根据模型,得到的最佳培养基为:麸皮50.3 g/L,硫酸铵1.53 g/L,磷酸二氢钾1.43 g/L,在此条件下预测最大产量为1.70 g/L。以此培养基进行发酵,杆菌肽A的产量为1.78 g/L,与预测值十分接近。

2.6芽孢形成量

发酵结束后,通过方法1.2.5所述方法计数,计算培养基中菌体数为(1.54±0.05)×1011CFU/mL,芽孢数为(1.25±0.04)×1011CFU/mL。芽孢转化率达到了81%。菌体数与芽孢转化率均在较高水平。有研究表明,与速效碳源缺乏的培养基相比,过多的速效碳源会导致生物量降低和能量利用率低[26-27]。本研究采用的培养基没有速效碳源,碳源仅来自纤维素、淀粉等有机碳源降解产物,因此,有利于生物量的增加和能量利用率的提高,生物量的增加同时也增加次级代谢产物的积累,可以提高杆菌肽A的产量。有研究通过添加无机盐来提高芽孢形成量[28],芽孢形成量为3.60×1010CFU/mL,低于本研究所用培养基。因为麸皮中有机氮源相对较少,实验培养基中添加了无机氮源,有利于芽孢的形成。同时发酵过程中,由于胞外蛋白分泌较多及菌体密度较高,菌体处于低溶氧水平,也有利于芽孢形成[29]。

3　结论

麸皮可以很好的代替黄豆粉和玉米粉来发酵生产杆菌肽,以麸皮为主要碳氮源的工业化培养基价格低廉,可以降低生产成本。通过响应面法优化工业培养基,得到最佳配比为:为麸皮50.3 g/L,硫酸铵1.53 g/L,磷酸二氢钾1.43 g/L,在此条件下杆菌肽A产量可以达到1.78 g/L。同时麸皮为主要碳氮源的培养基还可以实现高芽孢转化率,芽孢数可以达到1.25×1011CFU/mL。因此,使用本实验所优化培养基进行发酵,可达到高杆菌肽A产量,同时又实现了高芽孢生成量。在杆菌肽发挥效果的同时,产品还可以起到微生态制剂的效果。

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Optimization of bacitracin a high-yield industrial fermentation medium

XU Chao,LV Feng-xia,BIE Xiao-mei,LU Zhao-xin*

(College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

In order to reduce the cost of bacitracin industrial fermentation,improve the bacitracin a production,single factor experiment was used to looking for cheap ingredients to replace soybean flour and corn flour. And screened industrial culture medium was optimized by the Box-Behnken response surface method. Results showed that,wheat bran could replace corn flour and bean flour,as carbon and nitrogen sources in fermentation medium,reduces the cost of fermentation medium cost. The screened medium was:bran 50.3 g/L,ammonium sulfate,1.53 g/L,potassium dihydrogen phosphate 1.43 g/L,the predicted maximum yield was 1.70 g/L under this condition. Through certification,Bacitracin A production could reach 1.78 g/L. This paper was found that,using the optimized medium,the ability of produce spore by bacterium was high,the number of spore could reach 1.25×1011CFU/mL. The culture medium could achieve high yield,cost down and high spore formation rate at the same time.

bacitracin A;high yield;response surface

2016-03-11

徐超(1990-)，男，硕士研究生，研究方向：食品微生物及产物分析，E-mail：15063839264@163.com。

陆兆新(1957-)，男，教授，研究方向：酶工程、食品微生物、农产品加工，E-mail：fmb@njau.edu.cn。

国家科技部支撑计划(2011BAD23B05)。

TS201.3

B

1002-0306(2016)18-0197-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.029