超滤对大鲵多肽抗氧化活性的影响

青　维,孙　强,白鑫华,冉　旭

(四川大学轻纺与食品学院,四川成都 610065)



超滤对大鲵多肽抗氧化活性的影响

青维,孙强,白鑫华,冉旭*

(四川大学轻纺与食品学院,四川成都 610065)

大鲵,多肽,抗氧化活性,超滤

大鲵(Andriasdavidianus)属两栖纲(Amphibia)有尾目(Caudata)隐腮鲵科(Cryptobrachidae)[1-2],属于国家二级水生野生保护动物。大鲵肌肉是一种低脂肪的优质蛋白源,具有极高的营养价值和食用价值。大鲵肌肉蛋白必需氨基酸含量丰富,组成比例好,较为符合人体需要模式[3]。研究表明,大鲵肌肉蛋白酶解后得到的多肽不但具有清除自由基的能力,而且具有天然、安全、易吸收的优势,摄入体内具有提高机体抗氧化能力和补充营养的双重作用[4]。然而,目前对于食源性抗氧化肽构效关系的研究还不够深入。研究发现,影响抗氧化能力的因子有很多:氨基酸的组成与排列顺序、肽的疏水性与结构、肽的分子量以及水解度都会影响到抗氧化肽的抗氧化能力[5],因此,不同分子量的大鲵多肽的抗氧化活性都会不同。

超滤是一种加压膜分离技术,即在一定压力下,使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的滤膜,而且截留大分子溶质,从而使溶液中不同分子量的物质得到分级分离。超滤技术因其具有操作方便、无相变、效率高、成本低等优点,已被广泛应用于蛋白肽(如大豆肽[6]、乳蛋白多肽[7]、真鲷鱼骨多肽[8]等)的分级分离,既可以分离不同相对分子质量的多肽,又有利于保持多肽的生理活性。郝更新等[9]采用超滤对牡蛎蛋白酶解产物中发挥抗氧化活性的肽片段进行组分分离,发现<4 ku超滤液的还原力均高于同浓度的原液和其他超滤组分。而目前有关超滤对大鲵多肽抗氧化活性影响的研究报道较少。

本研究采用不同截留分子量的卷式聚砜超滤膜对大鲵肉蛋白酶解物进行分级分离,通过3种体外自由基清除实验,比较不同超滤组分多肽的抗氧化能力,为大鲵多肽在食品开发中的应用奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

大鲵四川溪源水产养殖有限公司;中性蛋白酶(2×105U/g)、风味蛋白酶(1.5×104U/g)食品级,江苏锐阳生物科技有限公司;氯化硝基四氮唑蓝、吩嗪硫酸甲酯、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、1,10-菲啰啉上海长哲生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)Sigma公司;硫酸亚铁、双氧水等均为分析纯,成都科龙化工试剂厂。

752N紫外可见分光光度计上海精科实业有限公司;HH-4恒温水浴锅国华电器有限公司;JJ-60W电动搅拌器上海乔枫实业有限公司;pHS-3C酸度计成都世纪方舟科技有限公司;LGJ-30冷冻干燥机北京松源华兴科技发展有限公司;LJ6T-SY04/W1X膜澄清实验设备、聚砜卷式超滤膜成都连接流体分离科技有限公司。

1.2实验方法

1.2.1大鲵多肽的制备冷冻大鲵肌肉在室温下解冻,然后洗净切碎混匀,大小不超过1 cm3,按一定比例加入去离子水,用1 mol/L的NaOH和HCl溶液调至设定的pH,加酶恒温搅拌酶解。参照徐阳等[10]确定的大鲵多肽最佳酶解工艺条件:风味蛋白酶和中性蛋白酶添加量均为6000 U/g,酶解温度55 ℃,酶解时间3 h,料液比1∶8(w/w),初始pH=6.86。酶解结束后将酶解液煮沸15 min灭酶,冷却至室温。上述酶解液经0.22 μm微滤膜过滤即可得到得清澈大鲵多肽酶解液。

1.2.2大鲵多肽的膜分离分级在室温条件下,依次采用截留分子量为20、5、2、0.3 ku的聚砜卷式超滤膜对大鲵多肽酶解液进行超滤分级分离,得到5个不同分子量段的多肽液,将各级多肽液分别冷冻干燥(控制多肽粉水分含量在7%以下),得各分子量段的多肽:ADMAP-1(>20 ku)、ADMAP-2(5～20 ku)、ADMAP-3(2～5 ku)、ADMAP-4(0.3～2 ku)、ADMAP-5(<0.3 ku)。四级膜分离的分离压力分别为0.1、0.15、0.25、0.45 MPa。具体膜分离工艺流程如下:

1.2.3不同超滤组分抗氧化活性的测定

1.2.3.1DPPH自由基清除活性的测定DPPH自由基清除活性的测定方法参照Shimada等人[11]的方法,略作修改:将多肽粉配制成不同浓度样品液,量取4 mL样品液于试管中,加入4 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L,溶于95%乙醇),振荡混匀后在室温下避光反应20 min,以去离子水调零,在517 nm下测定吸光值Ai;空白组为4 mL样品液,加入4 mL 95%乙醇溶液,测定吸光值为Aj;对照组为4 mL DPPH溶液加上4 mL去离子水,测定吸光值为A0。DPPH清除率按公式(1)计算。

(1)

式中:Ai:样品组吸光值;Aj:空白组吸光值;A0:对照组吸光值。

1.2.3.2·OH自由基清除活性的测定·OH自由基清除活性的测定参照Wang等[12]的方法。在该法中,H2O2和Fe2+发生Feton反应产生的·OH自由基能将二价铁离子氧化成三价铁离子。二价铁离子能与1,10-菲啰啉结合生成红色化合物,该化合物在波长为536nm处有吸收。

取1mL1,10-菲啰啉(1.865mmol/L)与2mL样品液于具塞试管中混合,再加入1mLFeSO4·7H2O(1.865mmol/L),最后加入1mLH2O2溶液(0.03%,v/v),将试管置于37 ℃温度下反应60min,于536nm处测量吸光度A,同时以蒸馏水代替样品液作阴性对照Aj,以蒸馏水代替过氧化氢作空白对照A0。样品对·OH自由基的清除率按公式(2)计算。

(2)

式中:A:样品组吸光度;Aj:阴性对照吸光度;A0:空白对照组吸光度。

(3)

式中:A0:空白对照吸光度;A:样品组吸光度。

1.2.4水解度的测定

1.2.4.1总氮和蛋白质含量的测定参照GB 5009.5-2010采用凯氏定氮法测定。

1.2.4.2游离氨基态氮的测定参考赵新淮等人[14]的甲醛滴定法测定大鲵酶解液中的游离氨基态氮含量。

1.2.4.3水解度的计算依据公式(4)计算水解度(DH):

(4)

1.2.5多肽得率的测定多肽得率是指酶解液中多肽含量占原料总蛋白质的百分比。首先参照鲁伟等人[15]的方法,采用加入等量的10%(W/V)三氯乙酸沉淀大分子蛋白质,然后采用双缩脲法测定酶解液中多肽的含量,具体步骤参照《2010版中国药典》的《蛋白质含量测定法》。多肽得率的计算如公式(5)。

表1　大鲵肉酶解液超滤分级结果

(5)

2　结果与分析

2.1大鲵抗氧化肽超滤分级

大鲵肉酶解液经超滤分级后冷冻干燥,所得组分采用直接干燥法测水分含量。各组分含量如表1所示。

由表1可知,大鲵肉酶解液经0.22 μm微滤膜处理后,酶解液中多肽分子量均小于20 ku。酶解液中各组分含量依次是:ADMAP-4>ADMAP-3>ADMAP-5>ADMAP-2,大鲵酶解物中82.5%为分子量0.3～5 ku的多肽,说明超滤可有效分离各分子量段抗氧化肽。

2.2不同超滤组分对DPPH自由基的清除作用

不同超滤组分不同浓度对DPPH自由基的清除作用如图1所示。

图1　不同超滤组分对DPPH自由基的清除作用Fig.1　DPPH· scavenging activity of different UF fractions

由图1可以看出,大鲵多肽浓度在0～4 mg/mL的范围内,各超滤组分DPPH自由基清除率随着大鲵多肽浓度的增加而不断上升。当大鲵多肽浓度超过4 mg/mL后,DPPH自由基清除能力无显著提高。由于EC50(ADMAP-2)>EC50(ADMAP-5)>EC50(ADMAP-3)>EC50(ADMAP)>EC50(ADMAP-4),说明大鲵多肽各超滤组分对DPPH·自由基清除能力从大到小的顺序为:ADMAP-4>ADMAP>ADMAP-3>ADMAP-5>ADMAP-2。当各组分浓度为4 mg/mL时,清除率由高到低依次为93.24%、91.67%、82.32%、80.57%、55.69%。其中,ADMAP-4表现出的清除能力最强(p<0.05),比同浓度VC对DPPH·自由基的清除活性低2.54%,有明显差异(p<0.05),其EC50值为0.4 mg/mL。ADMAP-2表现出的清除能力最小,说明分子量过大的多肽对DPPH自由基清除能力较低。超滤前的ADMAP也表现出较强的清除能力,其EC50约为1 mg/mL。结果表明,超滤处理能够有效分离得到大鲵多肽中对DPPH·自由基清除活性较强的组分。如图1所示,不同分子量分布的大鲵多肽对DPPH自由基清除活性不同(p<0.05),分子量在0.3～2 ku范围内的多肽清除DPPH自由基能力最强。

2.3不同超滤组分对·OH自由基的清除作用

不同超滤组分不同浓度对·OH自由基的清除作用如图2所示。

图2　不同超滤组分对·OH自由基的清除作用Fig.2　·OH scavenging activity of different UF fractions

由图2可以看出,大鲵多肽浓度在0～4 mg/mL的范围内,随着大鲵多肽浓度的增加,各超滤组分·OH自由基清除率不断上升,表明大鲵多肽不同超滤组分对·OH自由基的清除率具有明显的量效关系。当大鲵多肽浓度超过4 mg/mL后,·OH自由基清除能力变化不明显。在多肽浓度相同时,各组分对·OH自由基清除能力依次为:ADMAP-4>ADMAP>ADMAP-3>ADMAP-5>ADMAP-2。如表1所示,各组分的分子量大小顺序为:ADMAP-2>ADMAP-3>ADMAP-4>ADMAP-5。由上述结果可以推断得出:各超滤组分的分子量太大或太小,大鲵多肽的·OH自由基清除活性都不高,适中分子量范围(0.3～2 ku)的大鲵多肽·OH自由基清除活性最强。

图3　不同超滤组分对自由基的清除作用Fig.· scavenging activity of different UF fractions

3　结论

大鲵多肽酶解液经20、5、2、0.3 ku的超滤膜超滤分离后得到四种不同分子量范围的多肽,大鲵酶解物中82.5%的多肽分子量集中在0.3～5 ku。在体外抗氧化实验中,各超滤组分均表现出一定的体外抗氧化能力,且各超滤组分与酶解原液的清除DPPH·能力、清除羟自由基能力、清除超氧阴离子能力均为ADMAP-4>ADMAP>ADMAP-3>ADMAP-5>ADMAP-2,说明分子量在0.3～2 ku的大鲵多肽表现出较强的抗氧化能力,这一结果为大鲵抗氧化多肽在保健食品的应用提供理论基础。

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Effects of UF(ultrafiltration)on the antioxidant activity ofAndriasdavidianuspeptides

QING Wei,SUN Qiang,BAI Xin-hua,RAN Xu*

(College of Light Industry,Textile and Food Engineering,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

Andriasdavidianus;peptides;antioxidant activity;ultrafiltration

2016-03-30

青维(1992-)，女，硕士研究生，研究方向：食品科学，E-mail：qwlbl702@sina.com。

冉旭(1968-)，男，博士，副教授，研究方向：农产品加工与贮藏，E-mail：ranxu01@sina.com。

TS201.1

A

1002-0306(2016)18-0139-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.018