溶解介质对黄芩苷脂质体主要特性的影响*

方晓玉，王亚静，孙爱珍，王文津

（天津中医药大学 现代中药发现与制剂技术教育部工程研究中心，天津 300193）

溶解介质对黄芩苷脂质体主要特性的影响*

方晓玉，王亚静，孙爱珍，王文津

（天津中医药大学 现代中药发现与制剂技术教育部工程研究中心，天津 300193）

［目的］考察溶解介质对黄芩苷脂质体主要特性的影响。［方法］测定黄芩苷在水相 ［水、磷酸盐缓冲液（PBS）］和有机相（95%乙醇、无水乙醇、甲醇中）中的溶解度；分别将黄芩苷全部溶解在水相、有机相及在两相中以一定比例存在，采用薄膜超声法制备黄芩苷脂质体，测定粒径、电位，并用高效液相色谱法测定包封率和渗漏率。［结果］黄芩苷在水、pH6.8 PBS溶液、95%乙醇、无水乙醇、甲醇中的溶解度分别为0.1、10.58、0.45、0.71、4.36 g/L。以pH6.8 PBS溶液、甲醇以及甲醇和pH6.8 PBS溶液为溶解介质制备的脂质体粒径分别为（179.4±15.10）、（145.31± 7.35）、（133.84±4.67）nm；Zeta表面电位（-8.93±0.40）、（-8.69±1.08）、（-8.64±1.13）mV；包封率为（82.64±0.02）%、（48.87±0.01）%、（55.53±0.07）%；渗漏率为（9.30±0.02）%、（49.72±0.04）%、（55.41±0.01）%。［结论］以pH6.8 PBS溶液为溶解介质所得脂质体粒径均匀、包封率高、渗漏量少，稳定性好。

黄芩苷；脂质体；包封率；渗漏率；溶解介质

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2016.05.12

黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）为中医常用中药，古籍记载具有清热燥湿、泻火解毒的功效［1］。黄芩苷（baicalin）是从黄芩的根部提取的一种黄酮类化合物［2］，现代药理研究表明，黄芩苷具有抗菌、消炎［3］、抗氧化［4］、美白［5］等作用。脂质体是一种具有类似生物膜双分子层结构的囊泡，可将药物包封于双分子层结构中制成超微型球状药物载体制剂。将黄芩苷制成脂质体制剂可提高药物的靶向性，并减少不良反应，提高生物利用度。目前，在药物制备成脂质体的过程中，可以将药物溶解于有机相中［6-9］，或溶解于水相中［10-11］，或在复方中根据药物的脂、水溶解性将其溶于相应溶剂中［12］。文章以黄芩苷为模型药物研究溶解介质对其制备的脂质体制剂主要特性的影响。

1 材料

岛津高效液相色谱仪（日本岛津公司），NanoSizer型激光粒度测定仪（英国Malvern公司），Thermo通用台式冷冻离心机ST16R（德国赛默飞世尔公司），JY92-ⅡN型超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司），旋转蒸发仪（上海爱朗有限公司），SHZ-Ⅲ型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂），W201型恒温水浴锅（上海申盛生物技术有限公司），SK3200H型超声仪（上海科导超声仪器有限公司），ALC-1104型电子天平（上海精密科学仪器有限公司），十万分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司），超滤离心管（截留分子量30kD，Millipore公司）。

黄芩苷（天津中新药业研究中心，纯度＞94.0%），大豆卵磷脂（上海艾韦特医药科技有限公司，纯度50%，批号20141119），胆固醇（郑州利伟生物实业有限公司），磷酸二氢钾（天津市光复科技发展有限公司，批号20120216），氢氧化钠（天津化学试剂批发公司，批号20131106），甲酸（天津市富宇精细化工有限公司，批号20140511），甲醇、乙腈（天津市康科德科技有限公司）均为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他药品、试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 黄芩苷溶解度测定 按照2010版《中国药典》测定方法，进行溶解度测定［13］。称取黄芩苷供试品适量，于（25±2）℃温度下分别加入10 mL去离子水、pH6.8磷酸盐缓冲液（PBS溶液）、甲醇、95%乙醇、无水乙醇中，每隔5 min强力振摇30 s，观察其溶解状况，如无目视可见的黄芩苷粉末时，视为药物完全溶解，直至溶液中刚刚出现不溶物时，称量剩余黄芩苷的量即为其在各溶剂中的溶解度。见表1。

表1 黄芩苷溶解度测定结果 g/L

根据溶解度测定结果，有机介质中黄芩苷在甲醇中的溶解度最大。水性介质中在pH6.8 PBS溶液中的溶解度大。故在制备脂质体时分别选择甲醇为有机介质，pH6.8 PBS溶液为水性介质。

2.2 黄芩苷脂质体制备 根据前期预实验结果，初步筛选出了以薄膜超声法制备黄芩苷脂质体的处方工艺。

2.2.1 溶解介质为pH6.8PBS溶液的脂质体 以大豆卵磷脂与胆固醇比例为5∶1，黄芩苷与大豆卵磷脂比例1∶15的量精密称取大豆卵磷脂、胆固醇于250 mL茄形瓶中加甲醇20 mL，超声15 min溶解，置于旋转蒸发仪上减压蒸发除去有机溶剂，至瓶壁形成一层薄膜。另精密称取黄芩苷全部溶于20 mL pH6.8 PBS溶液中。将溶有药物的pH6.8 PBS溶液加入到茄形瓶中，水合洗膜至形成脂质体混悬液，将该混悬液于冰水浴中探头式超声60次（工作时间3 s，间隔时间3 s，功率200 w）即得，于冰箱中4℃条件下保存。

2.2.2 溶解介质为甲醇的脂质体 以大豆卵磷脂与胆固醇比例为5∶1，黄芩苷与大豆卵磷脂比例1∶15精密称取大豆卵磷脂、胆固醇、黄芩苷于250 mL茄形瓶中加甲醇20 mL，超声15 min溶解，于旋转蒸发仪上减压蒸发除去有机溶剂，至瓶壁上形成一层淡黄色薄膜。准确量取20 mL pH6.8 PBS溶液加入茄形瓶中，水合、洗膜至形成脂质体混悬液。将该混悬液于冰水浴中探头式超声60次（工作时间3 s，间隔时间3 s，功率200 w），即得。冰箱4℃条件下保存。

2.2.3 溶解介质为甲醇和pH6.8 PBS溶液的脂质体

以大豆卵磷脂与胆固醇比例为5∶1，黄芩苷与大豆卵磷脂比例1∶15精密称取大豆卵磷脂、胆固醇、一定量黄芩苷于250 mL茄形瓶中，加甲醇20 mL，超声溶解15 min，减压蒸发除去有机溶剂，直至瓶壁上形成一层淡黄色薄膜。另称取剩余量黄芩苷溶解于20 mL pH6.8 PBS溶液中，将其倒入茄形瓶中，水合、洗膜，制得脂质体混悬液，并在冰水浴中探头式超声60次（工作时间3 s，间隔时间3 s，功率200 w）。冰箱4℃条件下保存。

2.3 脂质体粒径、电位测定 取上述3种脂质体样品适量，加去离子水稀释，测定粒径及Zeta表面电位。见表2。

表2 黄芩苷脂质体粒径、电位测定结果（±s）

表2 黄芩苷脂质体粒径、电位测定结果（±s）

溶解介质 PDI Zeta电位（mV）pH6.8 PBS溶液 0.39±0.07-8.93±0.40甲醇 0.31±0.03-8.69±1.08甲醇∶pH6.8 PBS溶液 0.24±0.02-8.64±1.13 n 3 3 3粒径（d/nm）179.40±15.10 145.31±07.35 133.84±04.67

由表2可看出，同时以甲醇和pH6.8 PBS溶液为介质制备的脂质体粒径相对较小，其次是以甲醇为溶解介质制备的脂质体。就多分散系数（PDI）指数而言，3种脂质体相差不大，但同时溶解于甲醇和pH6.8 PBS溶液中所得脂质体比其他两种脂质体更稳定。在本实验中，脂质体表面带负电荷，比较样品的Zeta电位值，可知溶解介质为甲醇或pH6.8 PBS溶液对脂质体的电位值并无明显影响。

2.4 包封率测定

2.4.1 色谱条件 Venusil XBP C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.1%甲酸水∶乙腈（69∶31）；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。

2.4.2 线性关系考察 将黄芩苷分别配制成质量浓度为0.16、0.32、0.48、0.64、0.80 g/L的系列对照品溶液，进样，测定，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标进行线性回归，得回归方程A= 1 143.0C+39 735（r=0.999 7），表明黄芩苷在浓度为0.16～0.8 g/L时线性关系良好。

2.4.3 重复性实验 取黄芩苷脂质体样品1 mL，加甲醇溶定容至10 mL。取适量经0.45 μm微孔滤膜过滤，连续进样5次，测定结果的RSD为0.28%，表明系统的重复性良好。

2.4.4 方法回收率实验 准确称取处方量辅料，制备空白脂质体。另分别精密量取1 mL空白脂质体加入对照品溶液，配制成质量浓度分别为0.4、0.5、0.6 g/L的样品溶液（n=3），高效液相色谱法进行测定，计算回收率。平均回收率为97.84%，RSD 1.19%，符合要求。

2.4.5 游离药物回收率实验 准确称取黄芩苷4、5、6 mg于10 mL容量瓶中，加pH6.8 PBS溶液溶解，定容，配制成质量分数为0.4、0.5、0.6 g/L的低、中、高3种浓度黄芩苷溶液。从中准确量取1 mL至超滤离心管中，按照“2.4.7”项下进行操作，高效液相色谱法测定峰面积，计算平均回收率102.67%，RSD 1.51%，回收率试验符合要求。

2.4.6 精密度实验 取同批次黄芩苷脂质体样品6份各1 mL，分别加甲醇溶解并定容至10 mL。取适量经0.45 μm微孔滤膜过滤，进行测定，测定结果的RSD为0.69%，方法的精密度符合要求。

2.4.7 脂质体包封率的测定 精密量取黄芩苷脂质体1 mL至超滤离心管中，5 000 r/min离心40 min后收集滤液。滤液与同样量1 mL未经超滤的脂质体样品加甲醇超声15 min破乳，稀释定容至同样倍数。取适量用0.45 μm微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱法（HPLC）测定。未经超滤的脂质体中药物量记为Wt，滤液中药物量记为Wf，根据包封率计算公式En%=（Wt-Wf）/Wt×100%，计算药物包封率。结果见表3。

表3 黄芩苷脂质体包封率测定结果（±s） %

表3 黄芩苷脂质体包封率测定结果（±s） %

溶解介质包封率n 3 pH6.8 PBS溶液 甲醇 甲醇∶pH6.8 PBS溶液82.64±0.02 48.87±0.01 55.53±0.07

通过对以不同溶解介质制备的黄芩苷脂质体包封率测定结果分析，发现当药物完全溶解于pH6.8 PBS溶液时包封率最高，其次为同时溶解于甲醇和pH6.8 PBS溶液中的脂质体。

2.5 脂质体渗漏率测定 精密量取制得的脂质体样品1 mL，按照“2.4.7”项下包封率测定方法进行测定，并按下式计算贮存过程中的渗漏率。渗漏率=［（制备时包封量-贮存一定时间后的包封量）/制备时的包封量］×100%［14］。见表4。

表4 黄芩苷脂质体渗漏率测定结果（±s） %

表4 黄芩苷脂质体渗漏率测定结果（±s） %

溶解介质渗漏率n 3 pH6.8 PBS溶液 甲醇 甲醇∶pH6.8 PBS溶液9.30±0.02 49.72±0.04 55.41±0.01

从测定结果可以看出，于冰箱中4℃条件下放置1周后，溶解介质为甲醇、甲醇和pH6.8 PBS溶液时制备的两种脂质体渗漏明显，而溶解介质为pH6.8 PBS溶液所制备的脂质体样品渗漏量很少，可见pH6.8 PBS为溶解介质时所得脂质体稳定性更好。

3 讨论

在脂质体的质量评价中，粒径说明脂质体的大小，多分散系数（PDI）表明了粒径大小的分布情况，当PDI指数大于0.3时，认为粒径大小的分散范围较宽，当PDI指数小于0.3时则认为脂质体大部分粒子的粒径分布于某一数值范围之间［15-16］。在粒径测定结果中以pH6.8 PBS溶液为溶解介质制备的脂质体粒径相对较大，分布范围也较宽，另两种脂质体的粒径小，分布范围较窄，说明溶解介质的确对脂质体的粒径有影响。包封率测定方法的选择在脂质体质量评价中是一项重要工作。当前包封率测定方法有很多，如葡聚糖凝胶柱色谱法、微柱离心法、超速离心法、鱼精蛋白凝聚法等并各有特点［17-20］。本实验采用超滤离心法测定黄芩苷脂质体的包封率，其操作简单、快捷，成本较低，且超滤离心管容量可调整，经实验验证回收率符合要求，适用于黄芩苷脂质体的包封率测定。

目前，文献中关于黄芩苷制剂的研究报道多数重点考察制备过程中的工艺条件，鲜有考察溶解介质对其脂质体制剂特性的影响。本文以此问题为研究对象，考察了溶解介质为甲醇、pH6.8 PBS溶液及同时溶于甲醇与pH6.8 PBS溶液时对黄芩苷脂质体粒径、电位、包封率及渗漏率的影响，结果说明在制备脂质体时，需要考虑溶解介质对制剂特性的影响。因此，对于类似黄芩苷这种脂溶性与水溶性均较差的药物，应该根据制剂要求进行适宜溶解介质的筛选。

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Effects of dissolved medium on baicalin liposome main characteristics

FANG Xiao-yu，WANG Ya-jing，SUN Ai-zhen，WANG Wen-jin
（Engineering Research Center of Modern Chinese Medicine Discovery and Preparation Technique，Ministry of Education，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To investgate the effects of dissolution medium on main characteristics of baicalin liposome.［Methods］Determination of baicalin solubility in methanol，PBS and the mixture of both.Baicalin liposome was prepared by thin-film dispersion method based on the measuring content of baicalin.The particle size，zeta potential and distribution of baicalin was measured with zeta potential and particle size analyzer，the leakage and encapsulation efficiency were examined by HPLC.［Results］The results showed that solubility of baicalin were 0.1，10.58，0.45，0.71，4.36 g/L in water，PBS，95%ethanol，absolute ethanol and methanol.Particle size of liposomes prepared by PBS，methanol，methanol and PBS as the solvent medium were 179.4±15.10，145.31±7.35，133.84±4.67 nm；zeta potential were-（8.93±0.40），-（8.69±1.08），-（8.64±1.13）mV；encapsulation efficiency were （82.64±0.02）%，（48.87±0.01）%，（55.53±0.07）%；the leakage rate were 9.30%±0.02，49.72%±0.04，55.41%±0.01.［Conclusion］The size distribution of baicalin liposome prepared by PBS as solvent medium was symmetrical and high coated rate，good stability.

baicalin；liposome；encapsulation efficiency；leakage rate；dissolution medium

R284

A

1673－9043（2016）05－0332-04

2016-05-14）

国家科技部“重大新药创制”专项课题（2013ZX0 9508-105，2012ZX0903201）。

方晓玉（1988-），女，硕士研究生，主要从事药物新剂型与新技术研究。

王亚静，E-mail:yajing022@163.com。