炮制时间对杜仲指标成分含量及药代动力学影响研究*

张影月，韩亚亚，郝 佳，王 涛，刘二伟

（1.天津中医药大学中医药研究院，天津 300193；2.天津市中药化学与分析重点实验室，天津 300193）

·中药研究·

炮制时间对杜仲指标成分含量及药代动力学影响研究*

张影月1，韩亚亚1，郝 佳2，王 涛2，刘二伟2

（1.天津中医药大学中医药研究院，天津 300193；2.天津市中药化学与分析重点实验室，天津 300193）

［目的］建立液相色谱-质谱/质谱联用法（LC-MS/MS）应用于同时测定不同炮制时间杜仲中主要成分京尼平苷（GP）、京尼平苷酸（GPA）、桃叶珊瑚苷（AU）、松脂醇二葡萄糖苷（SG）的定量分析方法，研究不同炮制时间对杜仲中4个指标成分在大鼠体内药代动力学行为的影响。［方法］按照杜仲的药典盐炮制方法炮制，分别于0、1、2、4 h取样。以马钱子素（MS）为内标，应用LC-MS/MS建立的方法测定不同炮制时间杜仲中4个目标成分含量及药代动力学入血成分含量。［结果］各目标成分在测定范围内呈良好线性关系；杜仲炮制时间宜控制在2 h较为合理。［结论］本研究从体内暴露角度描述了炮制对目标成分的影响，研究结果对杜仲的炮制和临床应用具有指导意义。

杜仲；炮制；LC-MS/MS；药代动力学

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2016.05.10

杜仲为杜仲科植物杜仲（EucommiaulmoidesOliv）的干燥树皮。性微辛，温；归肝肾经。主要用于肝肾不足、腰膝酸痛、筋骨无力、头晕目眩、妊娠漏血、胎动不安［1］。主要成分有苯丙素类、木质素类和环烯醚萜类成分，具有降血压、抗肿瘤、抗菌和抗病毒等功效［2-4］。杜仲的炮制方法很多，目的多为减毒增效或扩大其药用范围［5］。盐杜仲以盐水炙，“文火”炒制，原则以“断丝”为度，并无严格的时间限制，有研究从体外成分含量的变化研究炮制时间对炮制品质量的影响［6-8］，从体内暴露角度研究不同炮制时间对制杜仲质量的影响未见报道。本研究主要以杜仲盐炮制的时间为条件，以SD大鼠为受试对象，采用药典杜仲盐炮制方法，考察炮制时间对盐杜仲中的4个主要药效成分京尼平苷（GP）、京尼平苷酸（GPA）、桃叶珊瑚苷（AU）、松脂醇二葡萄糖苷（SG）［9-10］含量的影响及口服给药的体内暴露情况差异，使炮制时间控制在合理的范围内，以期为探究更为合理的炮制时间控制提供依据和数据支持。

1 仪器、试药与实验动物

1.1 仪器与试药 Agilent 6430 Quad LC-MS/MS （QQQ）equipped with electro-spray ionization（ESI）source（美国安捷伦公司），超纯水制造机（Mill-QⅡ型）（美国Millipore公司），低温高速离心机（德国Sigma公司），十万分之一天平（AX205）（瑞士梅特勒-托利多公司），XW-80A微型漩涡混悬仪（上海泸西分析仪器厂有限公司），标准品：桃叶珊瑚苷、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、马钱子素购自天津一方科技有限公司，经鉴定纯度在98%以上。乙腈（色谱纯，美国fisher公司）。乙酸（色谱纯，美国天地化学试剂公司）。羧甲基纤维素钠（CMCNa，0.5%）中国医药集团上海化学试剂公司提供。

1.2 实验动物 雄性SD大鼠，8周龄，180～220 g。购自北京华阜康科技有限公司，实验前大鼠在天津中医药大学适应性培养1周［控温（23±2）℃，控湿（50±10）%］，以适应环境。

2 样品制备

2.1 杜仲炮制品的制备 取杜仲生药饮片1 kg，盐浸24 h，收干，晾干。用“文火”炒制，在炒制过程中分别于0、1、2、4 h取样，粉碎，过80目筛。

2.2 杜仲不同炮制时间点供试品溶液的制备 精密称取杜仲不同炮制粉末2.0 g，置具塞锥形瓶中，加入60%甲醇溶液50 mL，密塞，称质量；回流提取1 h，放冷，再称质量，补足减失质量；摇匀，滤过，取续滤液，离心，取上清液，即得。

2.3 杜仲提取物的制备 取杜仲4个炮制时间点药材各60 g，分别以10倍量体积65%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液并浓缩，浓缩液经减压干燥得杜仲提取物。提取率为12.7%。

3 分析方法

3.1 色谱条件 EclipsePlusC18（2.1mm×150mm，5μm）色谱柱。流动相为乙腈（CH3CN含0.1%CH3COOH），水（H2O，含0.1%CH3COOH），梯度洗脱，柱温：20℃，流速：0.3 mL/min，进样量：5 μL。见表1。

表1 色谱分离梯度（ESI-） %

3.2 质谱条件 离子源干燥气流流速为11 L/mL，温度为330℃，毛细管电压4.0 kV。选择合适离子对（M/Z），优化质谱参数碰撞能量（CE）和碎裂电压值（Fr.）。见表2。

表2 化合物离子对及质谱检测参数（ESI-）

4 方法学验证

4.1 专属性 在3项的分析条件下，桃叶珊瑚苷（AU）、京东平苷（GP）、京东平苷酸（GPA）、松脂醇二葡萄糖苷（SG）、马钱子素（MS）5个化合物分离效果良好。保留时间分别为AU 4.14 min、GPA 8.18 min、GP 19.74 min、MS 21.09 min、SG 24.72 min。

4.2 稳定性 取大鼠空白血浆配制高、中、低3个浓度的对照品血浆样品若干份，分别于0 h、室温放置5 h、冻融3次、冰冻1周后按照3.1、3.2下方法进行测定。结果测得各成分浓度无明显降低，结果稳定。

4.3 基质效应和提取回收率 配制目标成分（GP、GPA、AU、SG）高、中、低3个浓度混合标准品溶液，将混合标准品直接溶于甲醇溶液于3.1、3.2项条件下检测为纯标准品的峰面积，将混合标准品溶于大鼠空白血浆进样检测为血浆标准品峰面积，将混合标准品直接溶于经甲醇沉淀后的大鼠空白血浆进样检测为加样标准品峰面积。计算血浆标准品的峰面积与纯标准品的峰面积的比值，即为绝对基质效应。计算血浆标准品的峰面积与加样血浆标准品的峰面积的比值，即为提取回收率。见表3。

表3 GP、GPA、AU、SG在血浆中的基质效应、提取回收率及稳定性

4.4 准确度和精密度 处理3个浓度（高、中、低）的血浆样品，每个浓度每日6份，连续处理3 d。记录GPA、GP、AU、SG峰面积，计算日内和日间精密度。结果见表4。

5 实验部分

5.1 不同炮制时间点样品目标成分含量测定 取按2项方法制备的样品，每个炮制时间点平行取6份。应用3项下的分析条件检测，计算4批样品中指标成分的平均含量，见表5。

表4 GP、GPA、AU、SG在血浆中的准确度和精密度

表5 不同炮制时间杜仲中4个指标成分含量数据表（±s） μg/g

表5 不同炮制时间杜仲中4个指标成分含量数据表（±s） μg/g

炮制时间（h）0 1 2 4 n 6 6 6 6 AU GP GPA SG 148.07±8.47 45.68±6.63 480.50±5.53 677.19±83.46 215.14±5.07 136.36±1.69 814.59±14.55 989.64±81.65 309.01±13.43 214.46±2.67 1 003.84±42.37 755.06±30.29 40.28±13.21 56.69±10.49 403.13±50.43 336.97±20.62

5.2 动物实验 将24只SD大鼠分为4组，依次灌胃给以炮制0、1、2、4 h杜仲提取物（500 mg/kg），每组平行给药6只大鼠。给药后，分别在0、5、10、15、30 min，1、2、3、5、8、12、24 h从大鼠内眦静脉丛取血约0.3 mL，放入肝素化的离心管中离心（8 000 r/min，10 min），取上清血浆50 μL于1.5 mL EP管中，加入150 μL甲醇沉淀蛋白，涡旋，离心（14 000 r/min，10 min）。取上清液于3.1、3.2项条件下进样检测。

5.3 数据处理 实验数据用DAS软件（Drug and Statistics，中国数学药理学会，孙瑞元等编制）拟合曲线并计算药动学参数。

6 结果与分析

实验结果显示炮制时间对杜仲质量具有重要影响（表5），分析数据证明加热时间过长，会使杜仲有效成分含量下降。从结果可以看出随着炮制时间延长部分成分含量下降达7倍以上。由图1可见，炮制时间延长杜仲中指标成分含量均呈明显下降趋势，松脂醇二糖苷在0～1 h有增加趋势，京尼平苷、京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷在1～2 h有明显增加趋势。

图1 杜仲中指标成分AU、GP、GPA、SG变化趋势图

图2 不同炮制时间杜仲口服给药后血浆中所测化合物药时曲线比较

口服不同炮制时间的杜仲提取物后，药时曲线见图2，可见口服炮制2 h的杜仲提取物，京尼平苷和京尼平苷酸的最高血药浓度Cmax为最高，为口服炮制0 h提取物Cmax的2倍左右。AUC0-24h和AUC0-∞均为最高，可见炮制时间的不同可以影响京尼平苷和京尼平苷酸在体内的暴露水平，炮制2 h口服给药提高了它们在大鼠体内的血药浓度。口服炮制1 h的杜仲提取物，桃叶珊瑚苷和松脂醇二糖苷的最高血药浓度Cmax为最高，为口服炮制4 h提取物的2倍左右，从AUC值分析，2 h炮制时间大部分成分体内暴露最高。AUC0-24h和AUC0-∞无明显变化趋势，可见炮制时间对桃叶珊瑚苷和松脂醇二糖苷的体内暴露水平无明显的影响，说明提取物中指标成分含量和体内暴露情况并不完全一致，但体外和体内结果均表明杜仲炮制4 h时指标成分均显著下降，提示杜仲炮制炒制时间不宜超过4h。见表6、表7。

7 结论

有关杜仲成分的现代仪器分析方法中液相色谱-质谱联用技术有其独特的优势，具有高灵敏度和高专属性［11-13］，适用于杜仲中微量成分的研究分析以及药代动力学研究［14-16］。本实验建立了高灵敏度的LC-MS/MS方法，以马钱子素为内标，同时测定生物血浆样品中京尼平苷、京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷和松脂醇二葡萄糖苷含量，并通过方法学验证。由表6、表7可以看出，口服炮制2 h杜仲提取物AU、GPA、GP曲线下面积AUC0-24h相对于口服其他炮制点的提取物有明显升高，由此可见炮制2 h杜仲中的主要成分相对于其他炮制时间杜仲在大鼠体内的吸收量有所提高，表明了合理的炮制时间对于杜仲中主要成分在大鼠体内的吸收有一定的促进作用，可提高杜仲中药效成分的生物利用度。中药药效作用具有多样性和复杂性［17-18］，本实验从体内暴露水平角度表征了中药多组分在生物体内的整体药代动力学特征，反应了杜仲中主要成分在生物体内的存留特性，为最终阐明炮制对药效物质基础的影响以及建立独具特色的中药药代动力学理论提供一定的依据［19-20］。

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表6 不同炮制时间杜仲口服给药后GP、GPA的药代参数

表7 不同炮制时间杜仲口服给药后AU、SG的药代参数

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Influence of processing time on Eucommia cortex and its pharmacokinetics study

ZHANG Ying-yue1，HAN Ya-ya1，HAO Jia2，WANG Tao2，LIU Er-wei2
（1.Institute of Traditional Chinese Medicine Research，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Key Laboratory of Pharmacology of Traditional Chinese Medical Formulae，Ministry of Education，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objectives］To develop a set of LC-MS/MS method for the simultaneous determination the compound of geniposide，geniposidic acid，aucubin and pinoresinol diglucoside in the different processed barks of Eucommia and for the analysis of biolcgical samples which contain the compound of geniposide，geniposidic acid，aucubin and pinoresinol diglucoside from the rats'oral administration of the Eucommia.［Methods］The Eucommia was processed with saline water according to Chinese pharmacopoeia.In the parch processing course，samples were randomly collected at 0，1，2 and 4 h respectively.Validation of a high performance liquid chromatography tandem triple quadrupole mass spectrometry LC-MS/MS （QQQ）method，with the strychni prime as internal standard，was used for the determination of the four target compounds in rats'plasma to study the pharmacokinetics of Eucommia.［Results］The determination methods with good precision and stability were suitable for the assay of Eucommia in the biological samples.It is reasonable to control the process time for Eucommia at 2 hours.［Conclusion］Additionally，these constituents demonstrated good pharmacokinetic properties in the body.The pharmacokinetics parameters in our research provided with information for the clinical application.

Eucommia；processing；LC-MS/MS；pharmacokinetics

R283.1

A

1673-9043（2016）05-0322-05

2016-06-05）

高等学校博士学科点专项科研基金联合资助课题（20131210120010）；国家科技重大专项“孵化基地”课题（2013ZX09401004）；天津市高等学校创新团队（TD12-5036，TD12-5033）；天津市抗癌重大专项项目（12ZCDZSY17000）。

张影月（1991-），女，硕士研究生，研究方向为中药药代动力学。

刘二伟，E-mail:liuwei628@hotmail.com。