参草通脉颗粒影响慢性心力衰竭大鼠血栓形成的实验研究*

孙晓辉，王 懿，张 艳

（1.辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110847；2.辽宁中医药大学，沈阳 110847）

参草通脉颗粒影响慢性心力衰竭大鼠血栓形成的实验研究*

孙晓辉1，王 懿2，张 艳1

（1.辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110847；2.辽宁中医药大学，沈阳 110847）

［目的］观察参草通脉颗粒对心力衰竭大鼠血栓形成的影响。［方法］选取80只大鼠，随机取20只为正常对照组，其余大鼠经冠脉结扎法配合力竭式游泳、节食等方法造成慢性心力衰竭模型，将造模成功的大鼠分为模型组、中药治疗组、西药治疗组，共4组，均以灌胃给药或蒸馏水28 d。利用蛋白免疫印迹法测定各组血栓素B2 （TXB2）、降纤酶原抑制物（PAI-Ⅰ）的变化情况及血清脑钠素（BNP）的浓度，用比色法测定高能磷酸盐（ATP）浓度。［结果］与正常对照组相比，模型组及各组大鼠TXB2、PAI-Ⅰ及BNP含量显著升高（P＜0.01），ATP水平显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，中药治疗组和西药治疗组TXB2、PAI-Ⅰ及BNP含量明显降低（P＜0.01），ATP明显升高（P＜0.01）；西药治疗组与中药治疗组血清中TXB2、PAI-Ⅰ明显降低（P＜0.01），ATP和BNP含量无明显差异（P＞0.05）。［结论］中药复方参草通脉颗粒可显著降低心力衰竭大鼠BNP的含量水平，降低血小板活化作用，减少心力衰竭后血栓的发生，能够改善线粒体能量代谢，改善心功能，抑制或逆转心室重构。

参草通脉颗粒；慢性心力衰竭；血栓；高能磷酸盐；血清脑钠素；血栓素B2；降纤酶原抑制物

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2016.05.08

慢性心力衰竭（CHF，以下简称慢性心衰）是由于心肌梗死、心肌病、血流动力学负荷过重、炎症等多种原因引起的心肌损伤，造成心肌结构和功能的变化，最后导致心室泵血或充盈功能低下的一种严重威胁人们健康的疾病。随着近年来对慢性心衰的发病机制的研究不断深入，证实多数CHF的并发症与血栓有关，心力衰竭（以下简称心衰）患者肺栓塞、脑卒中和周围动脉栓塞事件发生比一般人群高，同时研究证实CHF的发生与血小板的的激活、血栓的形成和线粒体能量代谢有关，其中血栓的形成与血清中血栓素B2（TXB2）和降纤酶原抑制物（PAI-Ⅰ）的含量相关［1-2］。目前，中医药治疗CHF的优势逐渐显现，本研究通过观察中药复方参草通脉颗粒干预慢性心衰大鼠，探讨其影响血栓形成的作用机制，为中医药防治慢性心衰提供依据。

1 材料

1.1 实验动物 选择SPF级12周龄雄性SD大鼠80只，体质量250～300 g［由辽宁长生生物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK（辽）2010-0001］。

1.2 实验药物及试剂 参草通脉颗粒:由人参、黄芪、丹参、红花、益母草、茯苓及葶苈子组成（由辽宁中医药大学附属医院中药制剂中心制备成颗粒剂）。赖诺普利片，每片10 mg（由上海信谊万象药业股份有限公司生产，批号HI0960265）。TXB2、PAI-Ⅰ试剂盒购自苏州大学血栓与止血研究室，试剂批号MB0311。血清脑钠素（BNP）试剂盒，购自武汉优尔生科技股份有限公司。高能磷酸盐（ATP）试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 主要仪器 HX-300小动物呼吸机（成都泰盟科技有限公司生产），多功能酶标仪（anthos2010型），SONOS5500彩色多谱勒超声心动图（Agilent公司生产）。

2 方法

2.1 慢性心衰大鼠造模 从80只未予任何处理的正常大鼠中随机选取20只设为正常对照组（简称正常组）。其余60只大鼠参照文献［3］制备CHF大鼠模型。常规喂养1周后，每100 g体质量用10%水合氯醛0.3 mL腹腔麻醉大鼠，麻醉后固定，行经喉气管插管术连接小动物呼吸机，每分钟80次，潮气量为0.7～0.8 mL。备皮后经碘伏消毒，约在其左侧第3、4肋间横向切开皮肤约1.5 cm长度，打开胸腔，暴露心脏，找到左冠状动脉前降支，在起源点下2～4mm处用6号线结扎至周围心肌变白，将心脏放回胸腔，处理好胸腔内外源性污物，快速逐层缝合第3、4肋间、肌层及皮肤，并将青霉素钠外敷于伤口处，待大鼠呼吸平稳后停小动物呼吸机，恢复胸腔负压，动物能够自主呼吸后，拔出气管插管针。小鼠连接至心电图机，心电图显示ST-T段抬高为结扎成功。手术后注射每日青霉素钠4×104U，每日1次，持续3 d，以防感染。常规喂养1周，第2周将其饲料减少1/2使大鼠饥饿，同时每日进行1次力竭式游泳，以大鼠口吐气泡，四肢无摆动来判断已完全疲劳，即刻捞起。持续2周。期间，大鼠出现精神萎靡，活动度减低，毛色无光泽、脱毛等体征，且经多普勒超声心动图检测左室射血分数（EF）≤60%为慢性心衰造模成功，列入观察对象。造模成功后第2天给药，见图1。

图1 大鼠造模前（正常组）与造模后（模型组）超声

2.2 动物分组及给药方法 将造模成功后的37只大鼠按随机数字表法随机分为3组：模型组（13只）、中药治疗组（12只）、西药治疗组（12只）。正常组随机取出13只以尽量使样本数保持均衡。正常组和模型组予蒸馏水灌胃，每次3 mL，每日1次。用药组按人鼠剂量换算，给药剂质量（g/kg）=人的剂量（g）×系数（0.018）/所求动物体质量（kg）。西药治疗组（简称西药组）予赖诺普利1.5mg/（kg·d）；中药治疗组（简称中药组）予参草通脉5.75 g/（kg·d）。两组药物均溶于3 mL蒸馏水，每日1次灌胃，各组均用药28 d。

2.3 标本采集处理 28 d后，各组大鼠禁食不禁水12 h，经大鼠尾静脉采血后，麻醉处死全部大鼠。取大鼠心脏心肌组织，各组随机取10只，每只大鼠心脏按标准处理，备2份，其于液氮中冷冻后在-80℃条件下保存待检测，比色法测定ATP浓度，酶联免疫吸附法（ELISA法）测定BNP、TXB2及PAI-Ⅰ含量。

2.4 统计学处理 应用SPSS 18.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示。各组间采用单因素方差分析（one-way AONVA）进行比较，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 参草通脉颗粒对CHF大鼠血清BNP水平的影响 见表1。

表1 各组大鼠血清中BNP含量（±s） μg/L

表1 各组大鼠血清中BNP含量（±s） μg/L

注：与模型组比较，*P＜0.01；与正常组比较，#P＜0.01。

组别正常组模型组中药组西药组n 10 10 10 10 BNP 215.97±14.74 499.07±52.85#330.18±21.60*#324.27±29.78*#

与正常组相比，模型组、中药组及西药组BNP水平均升高，组间差异有统计学意义（P＜0.01），提示心衰时血清BNP含量呈上升趋势；同模型组比较，中药组与西药组BNP水平降低，组间差异有统计学意义（P＜0.01），说明药物治疗可减少BNP的生成；中药组与西药组BNP含量比较，组间差异无统计学意义（P＞0.05），说明中药组与西药组疗效相当。

3.2 参草通脉颗粒对CHF大鼠血清血栓素TXB2，PAI-Ⅰ的影响 见表2。

表2 各组大鼠血清TXB2 PAI－Ⅰ变化（±s） μg/L

表2 各组大鼠血清TXB2 PAI－Ⅰ变化（±s） μg/L

注：与模型组比较，*P＜0.01；与正常组比较，#P＜0.01。

组别正常组模型组中药组西药组n 10 10 10 10 TXB2 032.450±5.065 123.688±14.262#41.750±5.946#* 064.375±7.501#* PAI-Ⅰ14.175±2.152 43.400±7.651#25.900±6.286*#29.713±4.529*#

与正常组相比，模型组、中药组及西药组TXB2、PAI-Ⅰ含量显著升高（P＜0.01），提示心衰时血清TXB2、PAI-Ⅰ含量呈上升趋势；同模型组比较，中药组与西药组TXB2、PAI-Ⅰ水平显著降低（P＜0.01），说明中西药物治疗均可降低TXB2、PAI-Ⅰ的生成，且中药组优于西药组（P＜0.01）。

3.3 参草通脉颗粒对CHF大鼠细胞内ATP浓度的影响 见图2。

与正常组相比，模型组、中药组与西药组ATP浓度降低显著（P＜0.01），提示心衰时细胞内ATP含量下降；与模型组比较，中药组与西药组ATP浓度提高（P＜0.01）；中药组与西药组ATP浓度比较，组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

4 讨论

慢性心衰属于中医的“胸痹”、心悸”、“怔忡”、“水肿”等病证的范畴。根据多年的临床观察和大量的实验研究发现慢性心衰的主要病机为气虚血瘀水停［4］，参草通脉颗粒是经过多年临床经验总结出来的以益气活血为主要功效治疗慢性心衰的经验方，疗效显著。方中以人参和黄芪为君药以益气助阳，以丹参、红花、三七3味药为臣药活血通脉，加益母草祛瘀生新、强心利尿，葶苈子与茯苓泻肺逐水、强心。诸药合用，起到化瘀不伤血，利水不伤阴，补气而无温燥之弊，是标本兼治慢性心衰的良方。研究中药复方参草通脉颗粒治疗CHF的作用机制，为其进一步广泛应用于临床提供更有利的依据。

图2 各组大鼠细胞中ATP浓度

目前，研究表明慢性心衰与血栓形成或血栓栓塞的危险性增加有关。在CHF患者中，此类事件的发生率可显著上升，并与临床预后有密切关系。慢性心衰血栓事件的发病机制可从以下3个方面论述：血流异常、血管壁异常和血成分异常［5］。心衰发生时易导致神经内分泌系统被激活，血浆中血管紧张素Ⅱ和内皮素水平升高，使血管内皮损害/功能不全。在此情况下，外界病理或生理刺激因子可促使血小板活化，过度聚集导致血栓前状态或血栓栓塞症。研究表明血栓素A2（TXA2）可直接引起血小板聚集及二磷酸腺苷（ADP）的释放，且具有强烈的血小板聚集和血管收缩作用。同时TXA2本身很不稳定，在体液中的半衰期仅为30～60 s，然后迅速变成稳定的代谢产物TXB2，所以常用TXB2反映TXA2的水平，可评价血小板的活化程度［6］。由于血管内皮细胞结构和功能受损，PAI-Ⅰ合成与释放异常，引起PAI-Ⅰ活性变化，影响了纤溶系统的功能。研究表明，心功能越差，血小板释放PAI-Ⅰ越多，外周静脉血中浓度越高，血小板活化程度越高，血液高凝状态越重［7］。BNP的合成分泌受心室容量负荷和室壁张力的影响，血BNP含量能够直接反映心室功能，是评价心衰严重程度的主要指标之一。研究表明BNP含量与心衰的程度、左室舒张末径呈现正相关，与EF呈现负相关［8］。且能量代谢主要作用是维持细胞代谢、结构和功能等方面内容［9］。心脏需要大量能量来维持自身收缩功能，正常心肌能量供应时线粒体的氧化呼吸链和ATP的生成是偶联的，心衰发生时线粒体有氧氧化功能受抑制，偶联机制被破坏，线粒体数量增加，同时能量代偿期增加，呼吸功能和ATP的合成受到抑制。由此心衰时，能量代谢异常贯穿于心肌从代偿性肥大到衰竭的全过程，促进线粒体DNA的合成，改善心肌能量代谢状况，是减轻或预防心衰的发生主要靶点。本研究证明了影响血栓形成的TXB2和PAI-Ⅰ与ATP的含量与慢性心衰发生密切相关。

本研究中，实验大鼠心脏彩超显示造模成功，BNP含量上升，提示心功能下降。实验结果提示中药组和西药组大鼠血清BNP含量下降，提示参草通脉颗粒可明显改善心功能。慢性心衰大鼠模型组与正常组相比TXB2、PAI-Ⅰ及BNP含量显著升高（P＜0.01），ATP水平显著降低（P＜0.01）；与模型组大鼠相比，中药组和西药组TXB2、PAI-Ⅰ及BNP含量明显下降（P＜0.01），ATP明显升高（P＜0.01）；西药组与中药组血清中TXB2、PAI-Ⅰ明显降低（P＜0.01），ATP和BNP含量无明显差异（P＞0.05）。提示参草通脉颗粒能增加ATP合成，增强心肌收缩力，减轻心室重构，减少TXB2、PAI-Ⅰ含量，降低血小板活化，从而降低血栓形成的危险性，对防治慢性心衰引起血栓的发生有一定的作用。

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Experimental study on the effect of Shencao Tongmai granule on thrombosis in chronic heart failure rats

SUN Xiao-Hui1，WANG Yi2，ZHANG Yan1
（1.Department of Cardiology，Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China；2.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China）

［Objective］To observe the effect of the pulse of the herb on thrombosis in heart failure rats.［Methods］A total of 80 rats，twenty were randomly selected as the normal control group，the remaining rats by coronary artery ligation method with the exhaustive swimming and diet to make chronic heart failure model，the successful model of the rats were divided into model group，treatment group of Chinese medicine，western medicine treatment group，a total of 4 groups，all with intragastric administration or distilled water for 28 days.Thromboxane B2 were measured by Western blot assay （TXB2），fibrinolytic proenzyme inhibitor（PAI-Ⅰ）and the changes of serum brain natriuretic peptide （brain natriuretic peptide，BNP）for the determination of the concentration of high energy phosphate Colorimetry （adenosine triphosphate，ATP）concentration.［Results］Compared with the normal group，model group and the other groups of rats TXB2，PAI-Ⅰand BNP levels increased significantly（P＜0.01），ATP level were significantly decreased （P＜0.01）；compared with the model group，Chinese medicine group and Western medicinegroupTXB2，PAI-ⅠandBNPcontentdecreasedsignificantly（P＜0.01）.ATPdecreased significantly（P＜0.01）；TXB2，PAI-Ⅰof serum in medicine group and Chinese medicine group decreased significantly （P＜0.01），no significant difference between the ATP and BNP content（P＞0.05）.［Conclusion］Shencao Tongmai granule of the traditional Chinese medicine compound can significantly decrease the level of BNP content in rats with heart failure，reduce platelet activation，reduce the incidence of thrombosis after heart failure，can improve mitochondrial energy metabolism，improve heart function，inhibiting or reversing ventricular remodeling.

Shencao Tongmai granule；chronic heart failure；thrombosis；ATP；BNP；TXB2；PAI-Ⅰ

R541.6

A

1673-9043（2016）05-0314-04

2015-06-18）

沈阳市科技计划项目（F13-316-1-10）。

孙晓辉（1970-），男，主管中药师，从事药学研究工作。

张 艳，E-mail:yanzhang1016@126.com。