人参皂苷Re对ADP、PAF、AA诱导家兔血小板聚集功能的影响*

闫海峰，代向东，樊克涛，王 怡

（天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室，天津 300193）

·实验研究·

人参皂苷Re对ADP、PAF、AA诱导家兔血小板聚集功能的影响*

闫海峰，代向东，樊克涛，王 怡

（天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室，天津 300193）

［目的］研究人参皂苷Re对血小板聚集功能的影响。［方法］采用体外实验通过Born法观察人参皂苷Re对二磷酸腺苷钠盐（ADP）、血小板活化因子（PAF）、花生四烯酸（AA）诱导的家兔血小板聚集率的影响。［结果］人参皂苷Re体外抑制ADP、PAF、AA诱导的家兔血小板聚集差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。半数抑制浓度（IC50）分别为0.197、0.242、0.443 g/L。［结论］人参皂苷Re呈剂量依赖性抑制体外ADP、PAF、AA诱导的血小板聚集，且抗ADP诱导的血小板聚集作用强于PAF、AA。

人参皂苷Re；血小板聚集；二磷酸腺苷钠盐；血小板活化因子；花生四烯酸

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2016.05.07

人参皂苷Re是人参皂苷单体提取物的有效成分，属于人参三醇型皂苷之一，是人参单体发挥药理活性的主要成分之一。它不仅单存在于人参中，而且还分布于西洋参、高丽参、三七等植物中，但其分布远少于人参中的含量。近年来，国内外对人参皂苷Re的药理研究逐步深入，已有文献报道其具有改善或者降低血糖、抗炎抗氧化、保护心肌损伤、抗心律失常、增强免疫功能、保护胃黏膜等作用［1-14］。但人参皂苷Re对于体外抑制血小板聚集功能的文献作用尚未清楚论述。本研究仅从体外研究人参皂苷Re对二磷酸腺苷钠盐（ADP）、血小板活化因子（PAF）、花生四烯酸（AA）诱导的家兔血小板聚集率的影响并分析其抗血小板聚集的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 人参皂苷Re（以下简称Re，纯度≥95%），规格每瓶1 g（上海融禾医药科技发展有限公司，批号160301）。

1.2 实验动物 日本大耳白兔，体质量2～2.6 kg，雄性20只，由北京金牧阳实验动物养殖有限公司提供，普通级别，动物使用许可证号：SCXK（京）2015-0005。

1.3 试剂与仪器 二磷酸腺苷钠盐（ADP），每瓶100 mg（Sigma公司，批号A2754）；血小板活化因子（PAF），每瓶1 mg（Sigma公司，批号P4909）；花生四烯酸（AA），每瓶100 mg（东京化成工业株式会式，批号A0781）；枸橼酸钠（天津市赢达稀贵化学试剂厂，批号20150207）；盐酸利多卡因注射液，规格5 mL∶0.1 g（河北天成药业股份有限公司，批号H13022313）；无水乙醇（天津市康德科技有限公司，批号1601025）；小牛血清蛋白（Solarbio公司，批号323N054）；Tris BuffeRed Saline（Sigma公司，批号1002043124）；570—VS血小板聚集仪 （美国CHRONO-LOG公司）；LDZ5-2低速自动平衡离心机（北京京立离心机有限公司）。

2 方法

2.1 样本采集 大耳白家兔于清醒状态下用利多卡因局部麻醉，分离出左侧颈总动脉，长约2～3 cm，颈总动脉取血，3.8%的枸橼酸钠溶液抗凝（血∶抗凝剂=9∶1），缓慢颠倒软管混合均匀，以1 000 r/min离心10 min，上清部分即为富血小板血浆（PRP），剩余部分以3 000 r/min离心10 min，上清部分即为贫血小板血浆（PPP），用全自动血细胞计数仪计数血小板，并用PPP调PRP，使血小板计数在（300～500）×109/L。

2.2 血小板聚集率的测定 通过570-VS血小板聚集仪测定血小板聚集率，根据Born法，将加入500 μL检测标本的PPP放入PPP孔，加入500 μL检测标本的PRP放入PRP孔，育温5 min，对照组加入无水乙醇（终浓度为9.26‰）20 μL，实验组加入人参皂苷Re（终浓度分别为0.056、0.112、0.448、0.896、1.792 g/L）20 μL。并育温5 min，荧光基线稳定在100/0的位置。每个比色杯分别加入ADP（终浓度为17.5 μmol/L）、PAF（终浓度为725.63μmol/mL）、AA（终浓度为0.3 mmol/L）20 μL，测定开始后，曲线运行6～9 min至平稳时，按下“停止”按钮。通过仪器描记出来的聚集曲线检测血小板聚集率，并计算聚集抑制率。

聚集抑制率（%）=（无水乙醇组聚集率-实验组聚集率）/无水乙醇组聚集率×100%

2.3 统计学处理 采用SPSS 18.0软件包进行数据统计，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），数据以均数±标准差（±s）表示。

3 结果

3.1 ADP诱导的体外家兔血小板聚集率的影响 与对照组比较，人参皂苷Re 0.112～1.792 g/L呈剂量依赖性抑制ADP诱导的家兔血小板聚集（P＜0.05，P＜0.01）。见表1。

表1 人参皂苷Re对ADP诱导的正常家兔血小板聚集率的影响（±s）

表1 人参皂苷Re对ADP诱导的正常家兔血小板聚集率的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

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3.2 PAF诱导的体外家兔血小板聚集率的影响 与对照组比较，人参皂苷Re 0.112～1.792 g/L呈剂量依赖性抑制PAF诱导的家兔血小板聚集（P＜0.05，P＜0.01）。见表2。

3.3 AA诱导的体外家兔血小板聚集率的影响 与对照组比较，人参皂苷Re 0.112～1.792 g/L呈剂量依赖性抑制AA诱导的家兔血小板聚集（P＜0.05，P＜0.01）。见表3。

4 讨论

血小板在参与止血和血栓形成的过程中起着重要的作用，当血管内皮损失或者受刺激时，血管内皮暴露的细胞外基质将与血小板结合，血小板活化发生聚集形成血栓，血栓的过度形成将会导致一系列的心脑血管疾病的发生，因此，抗血小板聚集治疗（抑制血小板活化）对于减少或防止血栓栓塞性疾病起着重要的角色。血小板的活化主要有3条途径［15］：二磷酸腺苷（ADP）、花生四烯酸（AA）、血小板活化因子（PAF），目前，抗血小板聚集的药物主要有血栓烷A2（TXA2）抑制药（阿司匹林）、ADP受体拮抗药（氯吡格雷）、磷酸二酯酶抑制药（双嘧达莫）、糖蛋白IIb/IIIa受体抑制药等其他抗血小板药［16-17］。但都有着不同的药物不良反应，比如脑出血或胃肠道出血，还可造成血小板或中性粒细胞减少、再生障碍性贫血等［18-21］。因此，中医药抗血小板的治疗逐步成为国内外研发的热点，尤其是一些抗血小板治疗的同时且不良反应较少的中药，现有文献表明中药或中成药复方及单体的有效成分均有抗血小板聚集的作用，如益气活血方、补阳还五汤、白藜芦醇等，其抗血小板的聚集作用通过降低血栓素B2 （TXB2），升高6-酮-PGF1α的含量及可能抑制血小板内PKC活性有关［22-24］。

表2 人参皂苷Re对PAF诱导的体外家兔血小板聚集率的影响（±s）

表2 人参皂苷Re对PAF诱导的体外家兔血小板聚集率的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 终浓度（g/L）血小板聚集率（%）对照组- 59.5±3.84人参皂苷Re 0.056 57.7±3.74 0.112 55.2±4.71* 0.448 42.1±3.41** 0.896 35.7±2.98** 1.792 23.5±3.14**抑制率（%）-3.03 7.23 29.24 40.00 60.50 IC50（g/L）0.242

表3 人参皂苷Re对AA诱导的体外家兔血小板聚集率的影响（±s）

表3 人参皂苷Re对AA诱导的体外家兔血小板聚集率的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 终浓度（g/L）血小板聚集率（%）对照组- 64.6±3.27人参皂苷Re 0.056 63.3±3.89 0.112 58.6±5.44* 0.448 49.7±6.80** 0.896 41.4±5.64** 1.792 30.2±4.61**抑制率（%）-2.01 9.29 23.07 35.91 52.25 IC50（g/L）0.443

本研究旨在研究人参皂苷Re体外对ADP、PAF、AA诱导的家兔血小板聚集的影响，通过本实验可知人参皂苷Re 0.112 g/L组有抑制ADP、PAF、AA诱导的体外家兔血小板聚集的作用（P＜0.05），人参皂苷Re 0.448、0.896、1.792 g/L组与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01），且有明显的量效关系，实验表明人参皂苷Re可能不是通过某一特异受体发挥抗血小板聚集的作用，而是从多种途径发挥抑制血小板聚集的作用，从人参皂苷Re半数抑制浓度（分别为0.197、0.242、0.443 g/L）上可以看出人参皂苷Re对于ADP抑制血小板聚集作用强于PAF、AA，人参皂苷Re抗血小板聚集作用可能主要通过ADP途径发挥抗血小板聚集的作用，也许通过抑制血小板表面上的受体来降低钙离子（Ca2+）的释放，阻止血小板的黏附、聚集的作用，有待进一步研究。

［1］高 钧，卢守四，张 蕾，等.人参皂苷Re促进胰高血糖素样肽-1分泌的研究［J］.中国药物与临床，2011，12（11）: 1383-1385.

［2］Han DH，Sang HK，Higashida K，et al.Ginsenoside Re rapidly Reverses insulin Resistance in muscles of high-fat diet fed rats［J］.Metabolism Clinical&Experimental，2012，61（11）:1615-1621.

［3］Gao Y，Yang MF，Su YP，et al.Ginsenoside Re Reduces insulin Resistance through activation of PPAR-γ pathway and inhibition of TNF-α production［J］.Vision Research，2013，32（10）:399-404.

［4］Quan HY，Yuan HD，Jung MS，et al.Ginsenoside Re lowers blood glucose and lipid levels via activation of AMP-activated protein kinase in HepG2 cells and high-fat diet fed mice［J］.International Journal of Molecular Medicine，2012，29（1）:73-80.

［5］Paul S，Shin HS，Sun CK.Inhibition of inflammations and macrophage activation by ginsenoside-Re isolated from Ko－Rean ginseng（Panax ginseng C.A.Meyer）［J］.Food&Chemical Toxicology An International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association，2012，50 （5）:1354-1361.

［6］Cho WCS，Yip TT，Chung WS，et al.AlteRed expRession of serum protein in ginsenoside Re-tReated diabetic rats detected by SELDI-TOF MS［J］.Journal of Ethnopharmacology，2006，108（2）:272-279.

［7］李 杰，宋嘉懿，张丽英，等.人参皂苷Re对糖尿病大鼠的心肌保护作用及其机制探讨［J］.山东医药，2013，42（1）: 9-11.

［8］胡婷婷.人参皂苷Re对心肌缺血再灌注损伤中炎症反应及PGI-2/TXA-2系统的影响［D］.长春:吉林大学，2010.

［9］Paul S，Shin HS，Sun CK.Inhibition of inflammations and macrophage activation by ginsenoside-Re isolated from Ko－Rean ginseng（Panax ginseng C.A.Meyer）［J］.Food&Chemical Toxicology An International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association，2012，50 （5）:1354-1361.

［10］张丽英.人参皂苷Re对糖尿病早期抗氧化和抗细胞凋亡作用的研究［D］.长春:吉林大学，2012.

［11］孟红旭，姚明江，刘建勋.人参皂苷Re对大鼠心室肌细胞钠、钾离子通道的影响［J］.世界中医药，2013，9（10）:1147-1149.

［12］Su X，Pei Z，Hu S.Ginsenoside Re as an adjuvant to enhance the immune Response to the inactivated rabies virus vaccine in mice［J］.International Immunopharmacology，2014，20（2）:283-289.

［13］Song X，Chen J，Sakwiwatkul K，et al.Enhancement of immune Responses to influenza vaccine（H3N2）by ginsenoside Re［J］.International Immunopharmacology，2010，10（3）:351-356.

［14］Lee S，Kim MG，Ko SK，et al.Protective effect of ginsenoside Re on acute gastric mucosal lesion induced by compound 48/80［J］.Journal of Ginseng Research，2014，38（2）: 89-96.

［15］Vermylen J，Badenhorst PN，Deckmyn H，et al.Normal mechanisms of platelet function［J］.Clin Haematol，1983 （12）:107-110.

［16］曾拥军，陈孝东，毛成洁，等.缺血性卒中或短暂性脑缺血发作患者的卒中预防指南 ［J］.国际脑血管疾病杂志，2006，30（5）:325-361.

［17］卜晓斐，刘到鹏，付晓丽，等.噻吩并吡啶类抗血小板聚集药物研究概况 ［J］.现代药物与临床，2012，27（1）:43-48.

［18］Verheugt FW.Aspirin，the poor man's statin［J］.Lancet，1998，351（9098）:227-228.

［19］Patrono C，Coller B，Dalen JE，et al.Platelet-Active Drugs: The Relationships Among Dose，Effectiveness，and Side Effects［J］.Chest，1998，114（5 Suppl）:234S-264S.

［20］Gur H，Wartenfeld R，Tanne D，et al.Ticlopidine-induced seveRe neutropenia［J］.Postgraduate Medical Journal，1998，74（868）:126-127.

［21］Kao TW，Hung CC，Chen YC，et al.Ticlopidine-induced aplastic anemia:Report of thRee Chinese patients and Review of the literatuRe［J］.Acta Haematologica，1997，98（4）: 211-213.

［22］田 昕.益气活血方对动脉粥样硬化家兔干预作用的实验研究［J］.辽宁中医药大学学报，2007，16（4）:324-327.

［23］宫 丽，张继平，李齐欢，等.补阳还五汤家兔含药血清对PAF诱导的家兔血小板聚集的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2009，15（7）:60-61.

［24］杨雨民，王兴祥，王世君，等.白藜芦醇在体外对ADP诱导人血小板聚集的抑制作用及其机制［J］.药学学报，2008， 55（4）:356-360.

Effection of Ginsenoside Re on ADP，PAF，AA-induced platelet aggregation

YAN Hai-feng，DAI Xiang-dong，FAN Ke-tao，WANG Yi
（Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To study the effect of ginsenoside Re on platelet aggregation function.［Methods］In vitro，through the Born law，effect of ginsenoside Re on sodium salt adenosine diphosphate（ADP），platelet-activating factor（PAF），arachidonic acid（AA）-induced platelet aggregation rate of.［Results］Ginsenoside Re in vitro ADP，PAF，AA-induced platelet aggregation was statistically significant difference （P＜0.05，P＜0.01），median inhibiting concentration（IC50），0.197 g/L，0.242 g/L，and 0.443 g/L respectively.［Conclusion］The ginsenoside Re in a dosedependent inhibition of in vitro ADP，PAF，AA-induced platelet aggregation，and ADP-induced platelet aggregation was stronger than PAF，AA.

ginsenoside Re；platelet aggregation；ADP；PAF；AA

R285.5

A

1673－9043（2016）05－0310-04

2016-05-07）

国家重点基础研究发展计划（“973”计划）项目资助（2012CB518404）。

闫海峰（1987-），男，硕士研究生，研究方向为方剂学。

王 怡，E-mail:vip-wangyi@126.com。