胫前显性营养不良型大疱性表皮松解症基因突变研究

段妍 曾抗 梁燕华 张启国 赵小燕

010010呼和浩特，内蒙古自治区人民医院皮肤科（段妍）；南方医科大学南方医院皮肤科（曾抗、梁燕华）；厦门大学附属第一医院皮肤科（张启国、赵小燕）

胫前显性营养不良型大疱性表皮松解症基因突变研究

段妍 曾抗 梁燕华 张启国 赵小燕

010010呼和浩特，内蒙古自治区人民医院皮肤科（段妍）；南方医科大学南方医院皮肤科（曾抗、梁燕华）；厦门大学附属第一医院皮肤科（张启国、赵小燕）

目的 探讨Ⅶ型胶原基因（COL7A1）在胫前显性营养不良型大疱性表皮松解症（DDEB-Pt）发病中的意义。方法 收集中国汉族1例DDEB-Pt散发患者及其家庭成员和100例健康对照的外周血标本，用改良盐析法提取外周静脉血中的基因组DNA，通过PCR反应扩增和测序进行序列分析。结果 测序结果显示，COL7A1基因73号外显子的第6109位碱基鸟嘌呤（G）转化为腺嘌呤（A），使得三螺旋区第2037位密码子由GCT变成ACT，编码氨基酸由甘氨酸（Gly）变为精氨酸（Arg），即c.G6109A（p.Gly2037Arg）甘氨酸替换突变。结论 COL7A1基因甘氨酸替换突变为致病性突变，是一新发突变。

营养不良性大疱性表皮松解；基因，显性；遗传；突变；COL7A1基因

营养不良型大疱性表皮松解症（DEB）是一种形成瘢痕的遗传性大疱性表皮松解症（epidermolysis bullosa，EB），水疱位于皮肤的深层组织，真皮上层的致密板下。将DEB分为显性遗传（DDEB）和隐性遗传（RDEB）两大亚型［1-2］。胫前显性遗传型营养不良型大疱性表皮松解症（DDEB-Pt）是DEB中少见的临床亚型。我们收集到1例DDEB-Pt散发患者的临床资料并对基因突变进行检测，现报告如下。

一、临床资料

患儿男，11岁，出生时右食指第2关节腹侧出现一蚕豆大水疱，疱壁破裂后残留瘢痕，以后于双侧踝关节出现大小不等丘疹、水疱，水疱破溃后局部皮肤出现增生性瘢痕。并扩展至头皮、躯干及四肢，瘢痕增大、肥厚，皮疹尤以双小腿伸侧及肘关节部位为重。该患儿无类似疾病家族史，其父母非近亲结婚。体检：一般情况好，发育正常，各系统体检均未见异常。皮肤科检查：头皮、背部、腰部、腹部可见散在蚕豆大小水疱、大疱，疱壁松弛，疱液透明，尼氏征阳性，散在分布大小不一的萎缩性瘢痕。双足、双小腿（图1）、髋关节、膝关节、肘关节、指关节可见数个蚕豆至钱币大小的水疱，疱壁紧张，疱液透明，尼氏征阳性，病变部位可见淡红色或暗红色的增生性瘢痕，瘢痕融合成弥漫性斑块，边界清楚，质地较韧。部分瘢痕边缘或瘢痕中间可见数个散在粟丘疹。指趾甲板均增厚，浑浊，暗褐色，部分甲板变形、变脆、脱落。牙齿排列不规则，部分牙齿脱落。左小腿胫前皮损组织病理（图2）：表皮角化过度，多个角栓形成，棘层不规则增生，可见表皮下大疱形成，个别棘细胞松解脱落至疱内，真皮乳头水肿，真皮浅层毛细血管增生扩张，疱内及血管周围可见炎症细胞浸润，包括淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及嗜中性粒细胞等，真皮胶原纤维增生，符合大疱性表皮松解症。

图1 患儿双小腿胫前增生性瘢痕

图2 皮损组织病理 表皮下大疱（HE×100）

二、方法

1.基因组DNA的提取：获得知情同意后，抽取DDEB-Pt患者及正常成员和100例正常人静脉血5 ml置EDTAK3（或EDTANa4）抗凝管中。血标本放置在-85℃超低温冰箱冷冻保存。采用改良盐析法提取外周静脉血中DNA（按照说明书进行）。

2.PCR扩增及DNA测序：NCBI数据库查取COL7A1基因的外显子序列，应用Primer 5.0及Oligo软件对COL7A1基因的118个外显子设计72对引物并对其进行扩增。PCR反应体系为 50 μl，包括：20 pmol引物，100 nmol MgCl2，20 mmol dNTPs，2.5 μl Taq polymerase，模板 DNA 约 1.4 μl。PCR 反应条件：变性94℃4 min；前12个循环：变性94℃30 s，退火59℃30 s，退火温度每个循环降低0.5℃，延伸72℃45 s；后26个循环：变性94℃30 s，退火55℃30 s，退火温度每个循环降低0.5℃，延伸72℃45 s；最后72℃延伸5 min。取PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析。目的片段经回收、纯化后用ABI3700自动测序仪进行序列测定，结果用Phred-Phrap-Consed软件包（12.0version）进行分析。

三、结果

DDEB-Pt测序结果为对扩增的PCR产物直接测序进行分析，患儿COL7A1基因73号外显子的6109位点鸟嘌呤（G）转化为腺嘌呤（A），使得三螺旋区第2037位密码子由GCT变成ACT，编码氨基酸由甘氨酸（Gly）变为精氨酸（Arg），即COL7A1基因甘氨酸替换突变c.G6109A（p.Gly2037Arg），相同的突变在患儿父母和家系外100例正常对照中未发现（图3）。

图3 3A：患儿COL7A1基因第73号外显子6109位点鸟嘌呤（G）被腺嘌呤（A）替换（c.G6109A）；3B：COL7A1基因第 73号外显子正常DNA序列

四、讨论

2013年6月正式发布的最新大疱性表皮松解症分类方法［3］，即EB分为单纯型大疱性表皮松解症（EBS）、交界型大疱性表皮松解症（JEB）、营养不良型大疱性表皮松解症（DEB）、Kindler综合征，各型又包括不同的类型。到目前为止报道的COL7A1基因突变点总共有730多个（http://www.col7.info）。大部分COL7A1基因突变具有极大的种族及家系特异性，而复发性突变也可见于数个种族，表型异质性的表达可能是由于VII型胶原突变诱发的“蛋白质自杀”，或杂合不同突变的两个等位基因导致的不同后果，或是一些突变表型可能需要两个等位基因纯合子的共表达［4］。

DDEB-Pt是DEB中少见的临床亚型［5］。出生时即可发生，亦可在婴儿期或儿童期发病。主要发生于胫前、前臂，少数可发生于躯干，瘙痒明显，可见瘢痕、粟丘疹及甲营养不良。成人期损害可呈苔藓样斑块。病情呈慢性进行性发展，尤其进入青春期后加重。在临床上易误诊为大疱性扁平苔藓、结节性痒疹症、神经性皮炎等瘙痒性皮肤病，应注意鉴别，结合典型临床表现、组织病理和超微结构检查等可明确诊断。本病与DEB的另一亚型痒疹样营养不良型大疱性表皮松解症（dystrophic epidermolysis bullosa pruriginosa，DEBP）的临床特征有明显重叠，但后者皮疹更为广泛且常伴有瘙痒［6］，另外该病往往迟发，缺乏完整的水疱［7］。我们在1例DDEB-pt散发患者中检测到c.G6109A（p.Gly2037Arg）甘氨酸替换突变，是一个新发突变，即患者COL7A1基因73号外显子的6109位点鸟嘌呤（G）转化为腺嘌呤（A），使得三螺旋区第2037位密码子由GCT变成ACT，编码氨基酸由甘氨酸（Gly）变为精氨酸（Arg），在家族正常人及正常对照中均未检测到。这个散发病例，患儿发病，其父母表型正常，无家族性遗传史。分析其遗传方式有3种可能性：①该患者为RDEB；②该患者可能为自发性突变引起的DDEB；③可能为种系突变导致的DDEB。

［1］Jiang W,Sun Y,Li S,et al.Two novel heterozygous mutations in COL7A1 in a Chinese patient with recessive dystrophic epidermolysis bullosa of Hallopeau-Siemens type［J］.Br J Dermatol,2005,152（6）:1357-1359.DOI:10.1111/j.1365-2133.2005.06638.x.

［2］Chao SC,Lee JY.Mutation analyses of COL7A1 gene in three Taiwanese patients with severe recessive dystrophic epidermolysis bullosa［J］.J Formos Med Assoc,2007,106（1）:86-91.DOI:10.1016/S0929-6646（09）60222-9.

［3］Fine JD,Bruckner-Tuderman L,Eady RA,et al.Inherited epidermolysis bullosa:updated recommendations on diagnosis and classification［J］.JAmAcadDermatol,2014,70:1103-1126.DOI:10.1016/j.jaad.2014.01.903.

［4］Whittock NV,Asthon GH-S,Mohammedi R,et al.Cornparative mutation detection screening of the type VII collagen gene（COL7A1）using the protein truncation test,fluorescent chemical cleavage of mismatch,and conformation sensitive gel eleetrophoresis［J］.J Invest Dermatol,1999,113（2）:673-686.DOI:10.1046/j.1523-1747.1999.00732.x.

［5］Fine JD,Eady RA,Bauer EA,et al.Revised classification system for inherited epidermolysis billosa:report of the Second International Consensus Metting on diagnosis and classification of epidermolysis bullosa［J］.J Am Acad Dermatol,2000,42（5）:1051-1066.DOI:10.1016/S0190-9622（00）90302-5.

［6］Ee HL,Liu L,Goh CL,et al.Clinical and molecular dilemmas in the diagnosis of familial epidermolysisbullosa pruriginosa ［J］.J Am Acad Dermatol,2007,56（5）:s77-s8l.DOI:10.1016/j.jaad.2006.10.017.

［7］McGrath JA,Schofield OM,Eady RA.Epidermolysis bullosa pruriginosa:dystrophic epidermolysis bullosa with distinctive clinicopathologicalfeatures［J］.Br J Dermatol,1994,130（5）:617-625.DOI:10.1111/j.1365-2133.1994.tb13109.x.

（本文编辑：吴晓初）

2015年本刊审稿专家名单

按姓氏汉语拼音为序

柏冰雪 蔡绥勍 曹双林 常建民 陈 浩 陈宏翔 陈辉树 陈 崑 陈玲玲 陈柳青 陈 敏

陈明亮 陈木开 陈 翔 陈晓栋 陈 旭 陈学军 陈 周 程 浩 崔盘根 崔 勇 戴宇文

邓丹琪 邓 军 段德鉴 樊 昕 樊翌明 范青源 范瑞强 范文葛 范 星 方 方 方 红

冯爱平 冯佩英 冯素英 冯义国 高 敏 高明阳 高天文 高兴华 高 宇 耿 龙 龚向东

顾 恒 顾 华 顾伟鸣 郭书萍 韩建德 郝 飞 何 弘 何 黎 洪玉晓 黄长征 纪 超

贾 虹 蒋 冠 蒋 献 蒋 艺 金哲虎 晋红中 鞠 梅 鞠 强 康晓静 赖 维 劳力民

雷铁池 雷 霞 李承新 李诚让 李春英 李东升 李福伦 李海涛 李 航 李邻峰 李 岷

李 明 李其林 李 强 李珊山 李慎秋 李 薇 李 巍 李新宇 李玉叶 李远宏 李振鲁

李政霄 栗玉珍 梁 伶 廖文俊 林 麟 林 彤 林有坤 刘邦民 刘栋华 刘华绪 刘健航

刘 玲 刘玲玲 刘 梅 刘 巧 刘双全 刘彤云 刘维达 刘 玮 刘业强 刘泽虎 刘志刚

卢 彬 卢 忠 鲁 严 鲁元刚 路永红 吕小岩 吕雪莲 吕中法 栾 琪 罗 燕 骆 丹

马翠玲 马东来 马 琳 马鹏程 满孝勇 蔄茂强 孟如松 潘 萌 庞晓文 乔建军 冉玉平

桑 红 施 为 施 辛 石春蕊 史同新 宋秀祖 宋志强 宋智琦 苏晓红 苏 英 孙建方

孙 青 孙秋宁 汤建萍 唐先发 陶 娟 田 燕 涂彩霞 涂 平 万慧颖 汪 盛 王宝玺

王大光 王 飞 王 刚 王宏伟 王洪生 王 华 王 莉 王良录 王 琳 王培光 王千秋

王秀丽 魏玉平 乌日娜 吴秋菊 吴 玮 吴信峰 吴 严 吴 艳 吴 焱 伍津津 席丽艳

夏汝山 夏志宽 肖风丽 肖生祥 徐金华 徐天华 徐秀莲 徐子刚 许爱娥 颜 艳 杨海平

杨 骥 杨莉佳 杨希川 杨秀敏 杨 勇 杨志勇 姚 煦 姚志荣 叶冬青 尹先勇 于晓静

曾维惠 曾宪玉 曾学思 张 斌 张国龙 张国毅 张海萍 张 宏 张建中 张峻岭 张理涛

张立新 张 丽 张 敏 张 韡 张锡宝 章强强 章星琪 赵 广 赵 亮 郑和平 郑 捷

郑 敏 郑志忠 钟连生 周炳荣 周平玉 朱慧兰 朱鹭冰 左亚刚

《中华皮肤科杂志》2014年度优秀审稿专家名单

为进一步提升中华皮肤科杂志的学术影响力，并感谢审稿专家对本刊长期以来的支持，自2015年起，我们将每年评选上一年度的优秀审稿人并给予奖励。希望各位审稿专家继续为我们审稿，把好质量关，并推荐您身边的中青年专家加入我们的审稿队伍。本刊的审稿专家库现有291位专家，2014年全年有审稿记录者241位，根据审稿篇数、审稿质量、审稿时间等，评选出优秀审稿专家44位，按综合得分降序排列。名单如下：

郝 飞 马东来 马鹏程 曾学思 范青源 王千秋 常建民 陈 浩 蔄茂强 方 红 方 方

陈 崑 黄长征 陈柳青 廖文俊 孙建方 王秀丽 顾 恒 周平玉 龚向东 陈晓栋 宋智琦

马翠玲 雷铁池 高 宇 李承新 李邻峰 杨希川 李春英 冯素英 樊翌明 樊 昕 韩建德

刘志刚 陈辉树 席丽艳 施 辛 鲁元刚 杨 勇 陈 翔 李 岷 李福伦 鲁 严 李 航

Mutation analysis of the COL7A1 gene in pretibial dominant dystrophic epidermolysis bullosa

Duan Yan,Zeng Kang,Liang Yanhua,Zhang Qiguo,Zhao Xiaoyan
Department of Dermatology,Inner Mongolia People′s Hospital,Hohhot 010010,China （Duan Y）;Department of Dermatology,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China （Zeng K,Liang YH）;Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Xiamen University,Xiamen 361003,China（Zhang QG,Zhao XY）

ObjectiveTo explore the role of typeⅦ collagen （COL7A1）gene in the pathogenesis of pretibial dominant dystrophic epidermolysis bullosa （DDEB-Pt）.MethodsPeripheral blood samples were obtained from a sporadic Chinese patient of Han nationality with DDEB-Pt,his parents and 100 healthy human controls.A modified salting-out method was used to extract genomic DNA from the blood samples,and PCR was performed to amplify 118 exons of the COL7A1 gene followed by DNA sequencing.ResultsA G→A mutation was identified at position 6109（G6109A）in exon 78 of the COL7A1 gene in this patient,which caused a change from GCT to ACT at codon 2037 in the triple helix region,and resulted in the substitution of glycine（Gly）by arginine（Arg）（p.Gly2037Arg）.ConclusionA novel glycine substitution mutation was identified in the COL7A1 gene in the patient with DDEB-Pt,which may be a pathogenic mutation.

Epidermolysis bullosa dystrophica;Genes,dominant;Heredity;Mutation;COL7A1 gene

Liang Yanhua,Email:liangdoctor@163.com

2015-04-29）

梁燕华，Email：liangdoctor@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.01.014

内蒙古自治区人民医院博士科研启动基金（CBS201533）

Fund program:Doctoral Scientific Research Foundation of Inner Mongolia People’s Hospital（CBS201533）