青鹏软膏对皮肤干燥志愿者及特应性皮炎样小鼠模型皮肤屏障功能的影响

李云珠 路雪艳 姜薇 李邻峰

100045北京，首都医科大学附属北京儿童医院皮肤科（李云珠）；北京大学第三医院皮肤科（路雪艳、姜薇）；首都医科大学附属北京友谊医院皮肤科（李邻峰）

青鹏软膏对皮肤干燥志愿者及特应性皮炎样小鼠模型皮肤屏障功能的影响

李云珠 路雪艳 姜薇 李邻峰

100045北京，首都医科大学附属北京儿童医院皮肤科（李云珠）；北京大学第三医院皮肤科（路雪艳、姜薇）；首都医科大学附属北京友谊医院皮肤科（李邻峰）

目的 探讨青鹏软膏对皮肤屏障功能的影响及其可能机制。方法 招募12名小腿伸侧皮肤干燥的女性志愿者，青鹏软膏涂于右小腿伸侧（青鹏侧）、青鹏软膏基质涂于左小腿伸侧（基质侧），用药7 d。分别于用药前、用药3 d及用药7 d测定皮肤屏障功能相关指标，如，经表皮失水量（TEWL）及角质层含水量。2,4-二硝基氟苯诱导小鼠背部产生特应性皮炎样改变，分别外用青鹏软膏基质（基质组），50%、75%、100%青鹏软膏治疗（50%、75%、100%青鹏组），每天2次，用药2周后，进行组织病理检查，背部皮褶厚度、TEWL的测定，免疫组化测定表皮丝聚蛋白，外皮蛋白及激肽释放酶7含量。结果 志愿者外用青鹏软膏及其基质，3 d、7 d后均较治疗前TEWL显著下降（青鹏侧t=2.651、3.615；基质侧t=2.996、3.586，均P＜0.05），含水量显著上升（青鹏侧t=9.029、13.842；基质侧t=5.830、11.299，均P＜0.001）。青鹏侧及基质侧TEWL、含水量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。从外观、皮褶厚度及组织病理看，基质组小鼠与模型组相比，皮炎程度差异不大，各青鹏组小鼠皮炎均有不同程度缓解。基质组、青鹏组TEWL均较模型组下降（P＜0.05），而基质组与青鹏组TEWL比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。基质组、青鹏组KLK7表达均较模型组下降（P＜0.05），但各治疗组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 青鹏软膏基质有改善皮肤屏障功能的作用。

皮炎，特应性；模型，动物；小鼠；皮肤；志愿者；青鹏软膏；皮肤屏障

青鹏软膏是一种外用中成药，临床上用于治疗湿疹皮炎类皮肤病，特别是亚急性（非渗出）及慢性湿疹有良效［1-3］。皮肤屏障功能异常是湿疹重要的发病基础，而青鹏软膏对皮肤屏障功能的影响值得研究。本研究首先在小腿皮肤干燥的志愿者中，观察青鹏软膏及其基质对志愿者经表皮失水量（TEWL）及角质层含水量的影响，然后外用致敏剂在小鼠皮肤制备特应性皮炎样模型，此种小鼠模型表皮屏障功能存在明显异常，TEWL增加，角质层含水量下降，与皮肤屏障相关的一些蛋白：丝聚蛋白、外皮蛋白、激肽释放酶7等表达也出现变化［4］。本研究应用这种皮肤屏障受损的动物模型，研究青鹏软膏对皮肤屏障功能影响及其可能机制。

一、资料和方法

（一）资料：6周龄BALB/c雌鼠36只，均产自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号LA 2012-66。青鹏软膏（规格15 g）及青鹏软膏基质均由西藏奇正藏药股份有限公司提供，配制成50%、75%、100%3个浓度。2,4-二硝基氟苯（DNFB，日本Wako公司），配置成0.5%和0.2%的浓度。丝聚蛋白抗体（美国Novus公司），外皮蛋白抗体（英国Abcam公司），激肽释放酶7抗体（美国Santa Cruz公司）。皮肤测试仪（德国Courage-khazaka公司）。

（二）临床试验：

1.病例选择：小腿伸侧皮肤干燥的志愿者，且局部皮肤出现细小白色鳞屑，无明显红斑、丘疹等表现。

2.试验方法：将青鹏软膏涂于右小腿伸侧（青鹏侧）、青鹏软膏基质涂于左小腿伸侧（基质侧），每天2次，每次用量均为2个指尖单位，共用药7 d。要求志愿者不要改变用药前的洗护习惯，直至试验结束。

3.皮肤屏障功能测定：在用药前、用药3 d及用药7 d，分别测定皮肤屏障功能相关指标。测定在无阳光直射、无风，室温22～24℃，湿度40%～60%的环境中进行，志愿者静息10～20 min，使用皮肤测试仪测定志愿者小腿胫前皮肤TEWL和角质层含水量，每个指标检测3次，取其平均值。

（三）动物实验：

1.动物模型的制备［5］：小鼠饲养于恒温恒湿清洁级环境中，饲养2周适应环境后进入实验。实验前一天，用理发器剃除小鼠背部面积2 cm×4 cm毛发，再用电动剃须刀，将残余毛发剃除干净，注意勿损伤小鼠皮肤。将36只小鼠随机分为6组，每组6只。一组小鼠不予任何制剂和药物外涂，作为空白对照（空白组）。其余小鼠用0.5%DNFB 100 μl外涂背部进行2次诱导（间隔2～3 d）；实验第2周起于背部外涂0.2%DNFB 100 μl进行激发，每周 2次（间隔 2～ 3 d），连续 4周；于治疗第8天（实验第7周起的第1天）再次给予0.2%DNFB 100 μl激发 1 次。

2.药物治疗：第6周开始实验，一组模型小鼠不予外用治疗药物，作为未治疗组（模型组），其余4组模型小鼠分别接受背部皮损处外用青鹏软膏基质（简称基质组）、50%、75%、100%青鹏软膏的治疗（50%、75%、100%青鹏组），每天2次，连续用药2周。

3.检测方法：用药2周后，进行各项指标的检测：①大体观察：肉眼观察小鼠皮炎情况；②皮肤厚度测定：应用千分尺测量小鼠背部皮褶厚度，每只小鼠背部随机测量3处不同部位厚度值，取平均值的 1/2 作为皮肤厚度值（μm）［5］；③TEWL测定：在处死小鼠前，用皮肤测试仪检测皮肤TEWL。每只小鼠随机检测背部3处不同部位，所得值取平均数；④组织病理：处死小鼠，取背部涂药处皮肤，经HE染色观察表皮厚度及形态学变化；⑤免疫组化：取背部涂药处皮肤，甲醛固定，制成石蜡切片，按步骤加入丝聚蛋白，外皮蛋白或激肽释放酶7抗体、二抗及显色剂。免疫组化图片使用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0进行表皮细胞平均吸光度值的检测，比较不同组间表皮细胞吸光度值，推测各组目的蛋白表达强度的差异。

（四）统计学处理：用SPSS16.0统计软件，计量资料采用±ss表示，采用配对t检验比较志愿者治疗前后及左右侧胫前皮肤TEWL和角质层含水量，采用单因素方差分析比较各组小鼠皮肤厚度、TEWL、皮肤屏障相关因子蛋白表达量，采用LSD法进行多重比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

（一）临床试验：共12名女性参与研究，年龄（34.75±9.06）岁。青鹏软膏和基质治疗前后，志愿者左右腿胫前皮肤TEWL和角质层含水量见表1。青鹏软膏用药3 d，较用药前TEWL 显著下降，差异有统计学意义（t=2.651，P=0.024）；用药7 d，TEWL较用药前及用药3 d均显著下降，差异均有统计学意义（t=3.615、3.260，P=0.004、0.009）。用药 3 d、用药7 d角质层含水量均较用药前显著上升，差异有统计学意义（t=9.029、13.842，均P＜0.001），用药 7 d与用药 3 d角质层含水量差异无统计学意义（t=1.521，P=0.159）。

基质侧用药3 d，较用药前TEWL显著下降，差异有统计学意义（t=2.996，P=0.013）；用药 7 d，TEWL 较用药前及用药3 d均显著下降，差异均有统计学意义（t=3.586、3.108，P=0.004、0.011）。用药3 d含水量较用药前显著上升，差异有统计学意义（t=5.830，P=0.000）。用药7 d，含水量较用药前及用药3 d均显著上升，差异有统计学意义（t=11.299、2.472，P=0.000、0.033）。治疗前，治疗3 d及治疗7 d，分别比较青鹏软膏与基质治疗后胫前皮肤TEWL和角质层含水量，差异无统计学意义（均P＞0.05）。

表1 志愿者左右腿胫前皮肤不同治疗时间经表皮失水量和角质层含水量比较（μm，±s）

表1 志愿者左右腿胫前皮肤不同治疗时间经表皮失水量和角质层含水量比较（μm，±s）

注：a：与用药前相比，P ＜ 0.05，b：与用药 3 d 相比，P ＜ 0.05

分组 例数 经表皮失水量 角质层含水量0 d 3 d 7 d 0 d 3 d 7 d青鹏侧（右腿） 12 42.49±15.04 33.20±7.93a 28.43±4.01ab 46.66±6.63 61.53±8.57a 64.75±5.76a基质侧（左腿） 12 43.65±14.93 32.25±7.39a 28.46±4.64ab 47.31±7.14 62.56±8.20a 67.20±5.46ab t值 0.670 1.082 0.047 0.492 0.535 2.088 P值 0.517 0.305 0.964 0.632 0.604 0.061

图1 6组小鼠皮肤大体改变 1A～1F：治疗2周后各组小鼠皮损炎症程度从模型组至100%青鹏组依次减轻：模型组背部可见明显红斑脱屑，皮肤红肿；治疗组各组背部均未见明显鳞屑，皮肤肿涨程度随给药浓度增加而逐渐减轻

（二）动物实验：

1.大体观察：除空白组，治疗前各组小鼠背部皮肤可见明显红斑、浸润增厚、浆痂、鳞屑。药物治疗2周后，模型组小鼠背部皮肤仍有明显红斑、浸润增厚、浆痂、鳞屑；基质组小鼠背部皮肤虽未见明显浆痂，但红斑、增厚等皮损表现与模型组无明显差异；各种浓度的青鹏组小鼠背部皮炎均有不同程度缓解（图1）。各组小鼠皮肤组织学改变见图2。未经治疗的模型组小鼠组织病理可见特应性皮炎样改变：棘层肥厚，部分区域见细胞间水肿，真皮浅层见大量单个核细胞浸润。基质组小鼠表皮增厚及炎症细胞浸润仍明显。各组青鹏组小鼠表皮变薄，炎症细胞浸润不同程度减轻。

2.皮肤厚度：采用LSD检验进行两两之间的多重比较。结果显示，基质组与模型组差异无统计学意义（P＞0.05），各青鹏组皮肤厚度均低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

图2 6组小鼠皮肤组织病理改变（HE×100） 2A～2F：模型组小鼠组织病理可见特应性皮炎样改变：棘层肥厚，部分区域见细胞间水肿，真皮浅层见大量单个核细胞浸润；基质组小鼠表皮增厚及炎症细胞浸润仍明显；各浓度青鹏组小鼠表皮变薄，炎症细胞浸润不同程度减轻

表2 6组小鼠皮肤厚度、经表皮失水量、皮肤屏障相关因子蛋白平均表达量的比较（±s）

表2 6组小鼠皮肤厚度、经表皮失水量、皮肤屏障相关因子蛋白平均表达量的比较（±s）

注：n=6。a：与模型组相比，P ＜ 0.01；b：与模型组相比，P ＜ 0.05

组别 皮肤厚度（mm）经表皮失水量（g·m-2·h-1） 丝聚蛋白 外皮蛋白 激肽释放酶7空白组 0.35±0.06a 5.12±0.50a 0.55±0.05b 0.71±0.08a 0.42±0.02b模型组 1.07±0.18 30.64±4.10 0.52±0.01 0.54±0.03 0.44±0.02基质组 1.06±0.07 11.83±0.68a 0.50±0.01 0.56±0.03 0.41±0.02b 50%青鹏组 0.95±0.03b 12.91±0.70a 0.49±0.02 0.57±0.04 0.41±0.01a 75%青鹏组 0.87±0.08a 14.50±0.76a 0.48±0.03 0.58±0.02 0.41±0.01a 100%青鹏组 0.44±0.06a 13.25±0.61a 0.47±0.02 0.58±0.02 0.40±0.02a

3.TEWL：模型组小鼠TEWL明显较空白组小鼠升高（P＜0.01）。与模型组相比，基质组及3个青鹏组TEWL均在一定程度上有所降低，但这4个组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。

4.免疫组化：模型组小鼠表皮内丝聚蛋白、外皮蛋白表达均较空白组小鼠降低（P分别为＜0.05、＜0.01），而激肽释放酶7则相反（P＜0.05）。基质及不同浓度青鹏软膏对特应性皮炎样小鼠模型表皮丝聚蛋白和外皮蛋白表达影响均不大（均P＞0.05），而基质和不同浓度青鹏软膏对激肽释放酶7表达均有抑制作用（P＜0.05），但各治疗组间差异不大（P＞0.05）。见表 2。

三、讨论

皮肤具有保护人体并抵御外界刺激和伤害的重要功能，除具有物理防护作用外，还具有生物、化学、水分等物质通透性的调节功能。这些功能的遗传性或获得性损伤与皮肤病有着密切的联系。TEWL测定的是通过皮肤扩散入外界环境的水分，它是皮肤通透屏障功能的一个重要参数，皮肤屏障功能受损时，TEWL增加。研究显示，慢性皮肤炎症患者，如，特应性皮炎患者，存在明显的皮肤屏障功能异常，表现为TEWL升高、角质层皮脂含量下降、角质层细胞间脂膜皮脂成分变化、某些酶活性改变及丝聚蛋白合成减少等［6］。

丝聚蛋白，外皮蛋白及激肽释放酶7都是参与表皮终末分化阶段的重要蛋白［7］，丝聚蛋白主要存在于表皮颗粒层和透明层，与角蛋白中间丝相互作用，凝聚形成致密的角蛋白纤维束，从而构成角质形成细胞扁平坚韧的支架结构。同时，在角质形成细胞向角质层分化过程中，该蛋白由颗粒层被释放至细胞间隙并逐渐降解，形成多种氨基酸，是皮肤天然保湿因子中的重要组分之一。外皮蛋白紧邻细胞膜，构成角质化包膜的外表面，为其他蛋白在角质化包膜上交叉连接提供了支架。激肽释放酶属于丝氨酸蛋白酶，它参与角桥粒（角质形成细胞间连接）的裂解，从而使角质层细胞脱落。正常情况下，激肽释放酶7被丝氨酸蛋白酶抑制剂（LEKTI）抑制，处于失活状态，而LEKTI由SPINK5基因编码，并受表皮pH值调节。研究显示，特应性皮炎患者存在SPINK5基因突变，从而可使丝氨酸蛋白酶的活性异常，激肽释放酶7等活性增加，引起角桥粒非成熟性裂解并增加角质形成细胞的脱落，导致皮肤屏障功能受损［8］。已有研究显示，在皮肤屏障功能受损的疾病中，丝聚蛋白，外皮蛋白表达下降［9-10］，激肽释放酶表达增加［11］；而外皮蛋白基因敲除的小鼠模型以及过度表达激肽释放酶7的小鼠，均出现皮肤屏障受损的特应性皮炎样皮损［12-13］。因此，这些分子表达的改变将会影响角质层的完整性，从而改变皮肤的屏障功能。

本次研究发现，在皮肤干燥的志愿者，外用青鹏软膏或基质对皮肤屏障功能的改善作用相同，提示青鹏软膏基质也具有恢复皮肤屏障功能的作用。在皮肤屏障功能受损的特应性皮炎样小鼠模型，外用青鹏软膏或其基质均能降低TEWL，改善屏障功能，而青鹏软膏与基质对屏障功能的影响没有显著差别。但动物实验研究也发现，青鹏软膏可以减轻皮炎症状、降低皮肤厚度，其基质则没有这些作用，说明青鹏软膏基质虽然可以恢复皮肤屏障功能，但不具备抗炎作用。奇正青鹏软膏的基质成分包括液体石蜡、甘油、水等保湿滋润成分。既往研究发现，某些润肤剂可以改变表皮分化脱落相关基因的表达从而改善皮肤屏障功能［14］。我们的动物实验结果显示，外用青鹏软膏或基质至少可以通过减少激肽释放酶7在表皮的表达改善皮肤屏障功能，而不影响丝聚蛋白等，具体的作用机制还需进一步研究。

声明 本文无药厂资助

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Effects ofQingpengointment on skin barrier function in volunteers with xerosis and atopic dermatitis-like mouse models

Li Yunzhu,Lu Xueyan,Jiang Wei,Li Linfeng
Department of Dermatology,Beijing Children′s Hospital,Capital Medical University,Beijing 100045,China （Li YZ）;Department of Dermatology,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China（Lu XY,Jiang W）;Department of Dermatology,Beijing Friendship Hospital,Capital Medical University,Beijing 100050,China（Li LF）

ObjectiveTo estimate effects ofQingpengointment on skin barrier function,and to explore their potential mechanisms.MethodsA total of 12 female volunteers with xerosis on the extensor surfaces of legs were enrolled into this study.All the volunteers were topically treated withQingpengointment on the right leg（Qingpengside）and its vehicle on the left leg （vehicle side）twice daily for 7 consecutive days.Skin barrier function-associated indexes including transepidermal water loss（TEWL）and the water content of the stratum corneum were measured before the treatment,after 3-and 7-day treatment separately.Thirty-six BALB/c female mice were randomly and equally divided into 6 groups:a blank control group receiving no induction or treatment,a model group induced by 2,4-dinitrofluorobenzene（DNFB）on the back for 5 consecutive weeks,3Qingpenggroups and a vehicle group induced by DNFB on the back for 5 consecutive weeks followed by topical treatment with different concentrations（50%,75%,100%）ofQingpengointment or its vehicle twice a day for 2 consecutive weeks.At the end of treatment,skin appearance of mice was observed with naked eyes,skinfold thickness and TEWL were measured.Then,all the mice were sacrificed,and skin tissue specimens were resected from the back of mice followed by histopathologic examination and immunohistochemical staining for the detection of filaggrin （FLG）,involucrin（IVL）and kallikrein 7（KLK7）expressions in the epidermis.ResultsAfter start of treatment,both theQingpengside and vehicle side showed significantly decreased TEWL on day 3（t=2.651,2.996,respectively,bothP＜0.05）and 7 （t=3.615,3.586,respectively,bothP＜0.05）,but increased water content of the stratum corneum on day 3（t=9.029,5.830,respectively,bothP＜0.001）and 7（t=13.842,11.299,respectively,bothP＜0.001）compared with those before the treatment.However,no significant differences were observed in TEWL or the water content of the stratum corneum between theQingpengside and vehicle side at any of the time points（allP＞0.05）.In addition,there were no marked differences in mouse skin appearance,skinfold thickness or histopathologic manifestations between the vehicle group and model group,while the manifestations of dermatitis were attenuated to different extents in the threeQingpenggroups compared with the model group.Both TEWL and KLK7 expression levels were significantly decreased in the vehicle group and threeQingpenggroups compared with the model group（allP＜0.05）,but similar between the vehicle andQingpenggroups （allP＞ 0.05）.ConclusionThe vehicle ofQingpengointment can improve skin barrier function.

Dermatitis,atopic;Models,animal;Mice;Skin;Volunteer;Qingpengointment;Skin barrier

Li Linfeng,Email:zoonli@sina.com

2015-03-09）

（本文编辑：吴晓初）

李邻峰，Email：zoonli@sina.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.01.012

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