羟氯喹对调节性T细胞体外分化的调控作用

杨骥 杨雪 杨洁 李明

200032上海，复旦大学附属中山医院皮肤科（杨骥、李明）；复旦大学附属华山医院风湿科（杨雪）；上海市血液中心（杨洁）

·研究报道·

羟氯喹对调节性T细胞体外分化的调控作用

杨骥 杨雪 杨洁 李明

200032上海，复旦大学附属中山医院皮肤科（杨骥、李明）；复旦大学附属华山医院风湿科（杨雪）；上海市血液中心（杨洁）

目的明确羟氯喹对调节性T细胞（Treg）体外分化的调控作用。方法取1例健康人外周血15 ml，分离单个核细胞（PBMC）后，分选幼稚性T细胞用于实验，实验分对照组和试验组，对照组加入转化生长因子β（TGF⁃β）和白细胞介素2（IL⁃2）协同诱导因子体外培养；试验组加入诱导因子及20 μmol/L羟氯喹体外培养。分别在培养的第0、6、12天，通过流式细胞仪检查CD4+Foxp3+Treg的数量和比例。结果培养第0、6和12天，对照组Treg细胞数量分别为（2±0.4）× 104、（13.2±5.2）× 104和（143.5±35.9）×104；试验组分别为（2±0.5）×104、（2.4±0.4）×104和（5.6±3.5）×104。第6和12天，两组CD4+Foxp3+Treg细胞数量差异均有统计学意义（t值分别为3.78、6.16，均P＜0.05）。培养第12天，试验组CD4+Foxp3+Treg细胞比例为79.7%±18.1%，对照组为16%±13%（t=11.77，P＜0.01）。结论羟氯喹在体外具有抑制CD4+Foxp3+Treg细胞增殖和分化的作用。

羟氯喹；T淋巴细胞，调节性；细胞增殖；细胞分化

调节性T细胞（Treg）是一群具有免疫抑制作用的CD4+T细胞，具有维持体内免疫平衡的作用［1⁃3］。研究表明，系统性红斑狼疮（SLE）患者Treg数量减少，功能受损，并与狼疮病情活动指数（SLEDAI）相关［4-6］。羟氯喹是目前临床常用的治疗SLE的基本药物，其对Treg的调控作用并不清楚，本研究观察羟氯喹对体外Treg分化的调控作用。

一、试剂、仪器和细胞

健康人外周血单个核细胞（来源于上海市血液中心），幼稚性CD4+T细胞分选磁珠（德国MiltenyiBiotec公司），FITC标记的CD4单克隆抗体（美国BD Pharmingen公司），PE标记的Foxp3单克隆抗体（美国eBioscience公司），羟氯喹（英国Abcam公司），抗CD3/CD28活化磁珠（Life Dynabeads），转化生长因子β（TGF⁃β）和白细胞介素2（IL⁃2）（美国Peprotech公司），流式细胞仪（FACS⁃Calibur，美国BD公司），胎牛血清（美国Life Invitrogen公司），细胞培养液RPMI 1640G（美国Gibco公司）。

二、方法

1.幼稚性CD4+T淋巴细胞的分选和鉴定：取1例健康人外周血15 ml，分选外周血单个核细胞（PBMC），加入幼稚性T细胞分选磁珠分选。分选到的幼稚性CD4+T细胞经CD4⁃FITC单克隆抗体标记后，通过流式细胞仪鉴定，分选的纯度达95%以上，分选百分率为10%～15%。本研究经伦理委员会，并签署知情同意书。

2.CD4+Treg细胞的扩增及鉴定：对照组，第0天，将分选到的幼稚性CD4+T细胞重悬于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，加入抗CD3/CD28活化磁珠（5 ml/L）、TGF⁃β（10 μg/L）和IL⁃2（20 U/ml）扩增。第6、9天半量换液，补充相应的细胞因子。实验组，在培养的第0天加入20 μmol/L羟氯喹，第6、9天半量换液，补充相应的细胞因子以及羟氯喹。对照组和实验组每组设3复孔，每组初始放入等量分选到的幼稚性CD4+T细胞。部分细胞在培养第0天和第6天收集细胞，并通过流式细胞仪检测CD4+Foxp3+Treg细胞。将收获的细胞用聚丁二酸丁二醇酯（PBS）洗涤1遍，CD4⁃FITC常温避光表面染色15 min，PBS洗涤后，加入固定剂固定30 min；用破膜剂洗涤2次后，加入Foxp3-PE抗体染色30 min。PBS洗涤后，流式细胞仪检测。

3.统计学处理：对照组和实验组CD4+Foxp3+Treg细胞分化数量比较采用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。所有统计分析都在SPSS15.0 for windows统计软件中进行。

三、结果

1.羟氯喹对体外CD4+Foxp3+Treg细胞分化数量的影响：体外诱导幼稚性T细胞向Treg诱导分化6 d后，CD4+Foxp3+Treg细胞数量增多，培养至12 d增多更明显。而实验组在培养第6天和第12天CD4+Foxp3+Treg细胞数量增加受到明显抑制，与对照组比较，差异均有统计学意义。见表1。

2.羟氯喹对体外CD4+Foxp3+Treg细胞分化比例的影响：体外诱导幼稚性T细胞向Treg分化前CD4+Foxp3+Treg细胞比例为1.23%±0.1%，诱导12 d后对照组为79.7%±18.1%，试验组为16.0%± 6.1%（图1），两组比较，t=11.77，P＜0.01。

四、讨论

羟氯喹治疗SLE的主要机制为减低皮肤对紫外线的敏感性，稳定溶酶体膜，抑制变性DNA与抗体结合，抑制细胞免疫和补体活性［7-8］。

我们的研究表明，体外羟氯喹不仅能时间依赖地抑制幼稚性T细胞向Treg细胞分化，减少Treg细胞扩增的数量，也抑制了Fox3+Treg细胞在CD4+T细胞中的比例，表明羟氯喹在体外对Treg的分化和增殖具有抑制作用。推测羟氯喹在治疗SLE的过程中并不是通过促进Treg的分化，而可能是通过其他途径抑制免疫炎症。

尽管本研究提示，羟氯喹对体外Treg分化和增殖具有抑制作用，但我们研究时采用的是20 μmol/L羟氯喹，其主要依据临床羟氯喹200 mg/d的等效剂量换算，其他剂量的羟氯喹对Treg分化的影响作用有待进一步研究并明确。此外本研究结果提示，羟氯喹抑制幼稚性T细胞向Treg分化，而羟氯喹对成熟Treg的分化和增殖的影响也有待进一步明确。

表1 羟氯喹干预体外诱导幼稚性T细胞向调节性T细胞分化后不同时间CD4+Foxp3+Treg细胞数量的变化（x± s，× 104）

图1 羟氯喹对体外CD4+Foxp3+Treg细胞分化影响的流式细胞仪检测图

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Regulatory effect of hydroxychloroquine onin vitrodifferentiation of regulatory T cells

Yang Ji,Yang Xue,Yang Jie,Li Ming
Department of Dermatology,Zhongshan Hospital,Fudan University,Shanghai 200032,China（Yang J,Li M）;Department of Rheumatology,Huashan Hospital,Fudan University（Yang X）;Shanghai Blood Center,Shanghai 200051,China（Yang J）

ObjectiveTo evaluate the regulatory effect of hydroxychloroquine onin vitrodifferentiation of regulatory T cells（Treg）.MethodsFifteen milliliters of peripheral blood were obtained from a healthy human subject followed by isolation of monouclear cells and sorting of naive T cells.Then,the naive T cells were classified into two groups:control group cultured with the presence of tumor growth factor（TGF）⁃β and interleukin（IL）⁃2,experimental group cultured with the presence of 20 μmol/L hydroxychloroquine and inducing factors.The number and percentage of CD4+Foxp3+Treg cells were determined by flow cytometry at days 0,6,and 12.ResultsThe number of Treg cells at days 0,6,and 12 were（2 ± 0.4）× 104,（13.2 ± 5.2）× 104,and（143.5 ± 35.9）× 104respectively in the control group,（2± 0.5）× 104,（2.4± 0.4）×104,and（5.6±3.5）× 104respectively in the experimental group.There was a significant difference in the number of CD4+Foxp3+Treg cells between the two groups at days 6 and 12（t=3.78 and 6.16,respectively,bothP＜0.05）.At day 12,the percentage of CD4+Foxp3+Treg cells was 79.7% ±18.1%in the experimental group,compared to 16% ± 13%in the control group（t=11.77,P＜ 0.01）.ConclusionHydroxychloro⁃quine could inhibit the differentiation and proliferation of CD4+Foxp3+Treg cellsin vitro.

Hydroxychloroquine;T⁃lymphocytes,regulatory;Cell proliferation;Cell differentiation

Li Ming,Email:li.ming@zs⁃hospital.sh.cn

李明，Email：li.ming@zs⁃hospital.sh.cn

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2016.07.014

国家自然科学基金（81472874、81401346）；上海市科委医学类引导项目（134119a8400）；2014年上海市青年医师培养计划；复旦大学附属中山医院优秀骨干计划（2015ZSYXGG13）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81472874，81401346）,Medical Guide Project of Shanghai Municipal Science and Technology Commission（134119a8400）;Shanghai Municipal Cultivation Plan for Youth Physicians in 2014;Outstanding Talent Plan of Zhongshan Hospital Affiliated to Fudan University（2015ZSYXGG13）

2015⁃09⁃23）

（本文编辑：颜艳）