林伟东,孙威江,2,*,郭义红,彭静
(1.福建农林大学园艺学院,福建福州350002;2.福建农林大学安溪茶学院,福建福州350002)
茶叶中茶氨酸的研究与利用
林伟东1,孙威江1,2,*,郭义红1,彭静1
(1.福建农林大学园艺学院,福建福州350002;2.福建农林大学安溪茶学院,福建福州350002)
茶氨酸是茶叶中非蛋白质氨基酸,是茶汤主要的呈味物质之一。茶氨酸占茶叶中氨基酸总量的50%~60%,约占干茶总量的1%~2%。茶氨酸因生理作用较好,自2013年越来越受到人们的喜爱,并且被应用到生产中。本文对茶氨酸的性质、茶氨酸在茶树体内的合成与代谢、国内外对茶氨酸体外合成的研究以及茶氨酸的保健功效进行综述,并对茶氨酸在以后的发展方向进行展望。
茶氨酸;合成;保健功效
茶氨酸是茶叶中特有的氨基酸,是茶叶中非蛋白质氨基酸,是茶叶浸泡后茶汤主要的呈味物质之一,茶氨酸在茶叶中占氨基酸总量的50%以上,在干茶中约占1%~2%[1]。有研究表明,已经有26种氨基酸在茶叶中被检测到[2],茶氨酸除了在茶叶中被检测出外,在山茶、油茶、茶梅和蘑菇4种天然植物中也能检测到,但含量较少,而在其他植物中则没有被检测到[3]。早在1950年日本学者酒户弥二郎已经研究了从茶叶中提取和精制出茶氨酸,并确定了茶氨酸的化学结构[4]。由于茶氨酸的含量较低、提取较为困难,在发现茶氨酸初期,人们对它的研究较少,直到20世纪末,人工提取茶氨酸技术得到较大的提高,茶氨酸的生理功能及药理作用才得到相关研究人员的重视。
茶氨酸也叫谷氨酸乙胺,属于酰胺类化合物。茶氨酸是绿茶滋味呈味物质之一,与滋味呈正相关,相关系数达0.922 3[3]。在自然界中茶氨酸均是L型,纯品茶氨酸为白色针状晶体,熔点在217℃~218℃之间,比旋光度为[a]20D=7.70,在常温下极易溶于水中,溶解度为44 g,但茶氨酸不溶于无水乙醚、无水乙醇及低极性的有机溶剂[5]。实验表明,在沸水中将茶氨酸煮沸5 min再将该溶液在pH为3.0的溶液25℃下保存12个月,其茶氨酸含量保持不变[6],化学性质较为稳定。茶氨酸的水溶性呈现出酸性,具有红茶的焦糖香和类似味精的鲜爽味能缓解苦涩味,增强甜味感,天冬氨酸和谷氨酸的味觉阈值分别为0.16%和0.15%,而茶氨酸仅为0.06%[7],低阈值使茶氨酸在量低的情况下也容易被感觉到。试验表明茶氨酸没有毒性,且在摄取量的规定上没有限制[8-9]。在红茶的加工过程中茶氨酸会与糖类形成茶氨酸-糖苷复合物,这种复合物呈现出粉红色,是红茶汤色和叶底色泽的化学组分之一,对红茶叶底的红亮有利。除此外,糖类与茶氨酸作用后形成的物质为挥发性香气成分[10]。在浓度为25%的硫酸或者是6 mol/L的盐酸下茶氨酸可以发生水解反应,可分解成乙胺和L-谷氨酸;可以用碳酸钠和醋酸汞进行沉淀反应,易与碱或铜生成淡紫色柱状铜盐[11]。根据茶氨酸的理化性质可对茶氨酸进行定性定量的检测,检测方法包括:茚三酮显色法、纸层析法、气相色谱法、氨基酸自动分析仪、高效液相色谱法、强酸性阴离子交换树脂层析法、碱式碳酸铜沉淀法等[12]。
2.1茶氨酸在茶树体内的合成与降解
在茶树根部丙氨酸在丙氨酸脱羧酶的作用下脱去羧基生成乙胺,随后茶氨酸合成催化酶催化谷氨酸和乙胺消耗ATP合成茶氨酸,经过茶树体枝干由茶树根部运送到叶片,并在叶中积累。有研究表明,合成茶氨酸的速度在茶树的根部比地上部分快12.5倍~20.5倍[13],而谷氨酸生成茶氨酸的速率快于丙氨酸。这就造成茶树第一叶和嫩芽中茶氨酸含量最高,越往下茶氨酸越低。
茶氨酸在光照射下会分解成乙胺和谷氨酸,谷氨酸成为氮源,乙胺在胺氧化酶的作用下氧化生成乙醛[14],后被用于儿茶素的合成[15]。研究表明,Konishi在茶树的生长过程用14C标记的茶氨酸被运输至所有叶片。幼嫩芽叶在光培养下14C-茶氨酸代谢旺盛,且叶部大于茎部;而遮光处理的茶树中这种代谢较为缓慢,且发现遮荫能促进茶氨酸的积累[16]。
2.2茶氨酸的分布
2.2.1茶树中不同部位的分布
由于茶氨酸的合成部位是根部,经过枝干运输到叶,这就造成茶树体中不同部位的茶氨酸含量不一样。茶氨酸在茶树中不同部位的分布和含量见表1。
表1 茶氨酸在茶树中不同部位的分布和含量Table 1Theanine in different parts of the distribution and content in tea mg/kg
从其茶氨酸含量的分布分析,幼嫩的芽叶含量最高,可占干茶总重量的1%~2%;在老叶、茎部、根部也有分布;而茶树果、子叶中也有分布,但是含量最少[17]。
2.2.2不同茶类中的分布
因为六大茶类的鲜叶原料的老嫩程度、加工工艺和制作方法不相同,可能是原料中茶氨酸的含量不同,也可能是经过不同的加工工艺造成对茶氨酸的降解,所以茶氨酸在各茶类中的含量也表现出较大的差异[18]。茶氨酸在各类茶中的分布见表2。
表2 茶氨酸在各类茶中的分布Table 2The distribution of theanine in all kinds of tea mg/100 g
从表中分析出,白茶中的氨基酸总量和茶氨酸含量均最多,依次是绿茶、黄茶、乌龙茶、红茶而黑茶中最少,这主要是因为黑茶加工工艺中有渥堆工序,在渥堆湿热过程在真菌会分解大量氨基酸包括茶氨酸,导致含量最低。
茶氨酸口服后的吸收同其他氨基酸一样也要经过小肠。转运氨基酸的特殊运载系统在小肠壁上已经确定出3种,转运的氨基酸类型分别是酸性、中性和碱性。有研究表明,从茶氨酸与蛋氨酸在经过载体运输时产生拮抗作用推测出茶氨酸可能是通过蛋氨酸载体转运系统在肠道中被吸收,由此得出茶氨酸与蛋氨酸、亮氨酸、缬氨酸及异亮氨酸是同一类型的氨基酸[19],依存的载体都要钠离子。小肠吸收茶氨酸后,快速进入到血液、肝脏及脑等组织中,在1小时前后血液和肝脏中茶氨酸达到最高,直到5小时后脑中茶氨酸达到最高,之后逐渐降低,在服用茶氨酸1天后身体中的茶氨酸都会被排出体外[20]。24小时内对服用人员的尿液进行检测,发现检测到完整的茶氨酸、谷氨酸和乙胺,检测浓度与服用的茶氨酸量有关,说明代谢茶氨酸的部位是肾脏[21]。
由于茶氨酸的性质具有甜味和鲜爽味,无气味,又容易溶于水中,可被用于食品的添加剂。在已生产的饮料、糖果、茶氨酸胶囊、片剂中已有注明添加了茶氨酸。提高了生产上对茶氨酸的需求量,要求对茶氨酸的提取与合成方法进行改进,现有的生产茶氨酸的方法中主要包括茶叶提取法、组织培养法、微生物发酵法、化学合成法等。
4.1茶叶中提取法
4.1.1用试剂沉淀法提取茶氨酸
试剂沉淀法主要是利用某些有机或者是无机试剂与茶氨酸形成不溶性的沉淀物的一种方法。例如,碱式碳酸铜与茶氨酸可生成淡紫色柱状铜盐,提取方法上可利用此性质进行茶氨酸的分离[22]。传统的提取办法:利用热水浸提茶叶,使茶叶中氨基酸溶解在茶叶中,再利用沉淀法除去浸提液中的蛋白质、糖类、多酚类和色素,咖啡碱可使用氯仿除去。再经碱式碳酸铜对茶氨酸进行成盐过滤去除其余成分,利用稀硫酸溶解,经过滤收集过滤液、浓缩、精制得到天然的纯品茶氨酸。粗制品的茶氨酸可经过微晶纤维素柱层析法、离子交换柱层析法进行纯化得到精品茶氨酸[23]。
4.1.2离子交换法提取茶氨酸
茶氨酸在工业提取中应用到的最常用的提取方法之一就是离子交换技术。这一技术主要是利用氨基酸具有两性,可选取合适的pH值,用离子交换树脂分离出茶氨酸。在离子交换法提取茶氨酸的研究中,张飞等[24]利用阴离子交换法转化得到茶氨酸,通过考察动态与静态的不同操作条件对离子交换效果的影响。发现静态吸附试验采用717阴离子交换树脂,溶液pH值为8.5,吸附量为0.083 mmol/g,经过16 min的吸附为茶氨酸酶促转化的最佳条件。在实验中根据以上的条件,将转化液稀释3倍,以上样流速为0.5 BV/h,再经盐酸洗脱,旋转蒸发浓缩结晶后可得到纯品的茶氨酸。也有学者采用阳离子从茶渣废液中提取茶氨酸,周楚仪等[25]在研究从茶多酚残液中分离茶氨酸的工艺表明:当上样液质量浓度为2.5 g/L,溶液pH为3.5,洗脱液流速为2.4 BV/h,浓度为0.2mol/L时最有利于茶氨酸的提取。对工业中的茶深加工废液进行离子交换树脂提取茶氨酸是一项经济价值较高,可克服茶叶中茶氨酸含量不高、提取成本较高等因素,这对于茶叶加工厂将是一大茶叶综合利用和功能性成分开发的方向。
4.2组织(细胞)培养法生产茶氨酸
利用组织培养法生产茶氨酸历经的年限较长,早在1992年日本就开展了利用外植体培养法对茶树茎尖进行愈伤组织的培养,用此法进行茶氨酸生产的研究。卢红兵等[26]通过重组菌法制备茶氨酸的研究发现:在37℃下,菌体浓度为20 g/L,pH为10.0,底物浓度为0.25 mol/L,经过5 h的反应时间产量可达到11.26 g/L,且产量较为稳定。史成颖[27]在茶树幼根EST文库构建及茶氨酸代谢相关基因分析研究中也表明:往培养基中添加25 mmol/L盐酸乙胺后,经过6 d和12 d的愈伤组织生长,茶氨酸含量比对照明显高。组织培养法生产茶氨酸,虽然其茶氨酸产量相对直接从茶叶中直接提取要高,并且容易从组织培养细胞中提取出来,但目前技术成本较高,在生产中暂时无法产业化生产,且组织培养法的产率较低,那么研究新的生产茶氨酸的方法显得由为重要。为此李健等[28]研究出采用褐绒盖牛肝菌发酵生产茶氨酸的方法,为天然茶氨酸的生产提供了一种新途径。
4.3微生物发酵法合成茶氨酸
微生物发酵法实际上是运用微生物中的谷氨酸酶在一定条件下进行的合成茶氨酸的非特异反应。张群等[29]实现利用乳牛肝菌液态发酵合成茶氨酸,可得到茶氨酸的生成量为9.08 mg/L。此方法成功合成茶氨酸不仅丰富了茶氨酸在自然中的物种资源,也为茶氨酸的制备开辟了新的合成途径奠定了基础。傅锦坚[30]采用γ-谷氨酰基转化酶工业化生成茶氨酸的产酶菌种,研究发现此菌株经产酶发酵后的转肽酶活性达到6.33 U/mL。转化试验结果为:地衣芽孢杆菌中的γ-谷氨酰基转肽酶对催化L-谷氨酰胺和乙胺合成茶氨酸具有较好的催化能力,且茶氨酸的产量为21 g/L,茶氨酸从谷氨酰胺转化来的产率达35.2%。除了地衣芽孢杆菌催化前体物合成茶氨酸外,也有学者利用重组菌粗酶液催化合成茶氨酸,且对茶氨酸的催化条件进行了优化。在反应5 mL体系中,1.5 mol/L乙胺、0.3 mol/L谷氨酰胺、溶液pH为10.0、1.5 Utransfer粗酶液、经过5 h 37℃反应,乙胺和谷氨酰胺的转化率可达到40%,且茶氨酸合成量达到最高[31]。张玥[32]基于茶树根际土壤可能存在生产茶氨酸合成酶菌株的基础上,进行了茶树根际土壤中筛选茶氨酸合成酶菌株、合成产物鉴定、优势菌种鉴定的研究。研究发现,筛选出42株能够利用甲胺的甲基营养型微生物菌株,筛选出产量达到2.454 g/L的高产茶氨酸能力的优势菌株C2。总之,微生物发酵方法生产茶氨酸不受资源限制、生产成本较低、对环境没有污染、可进行规模化的大量生产、产品安全可靠,生产前景较好。
4.4化学合成法合成茶氨酸
1942年首次运用化学合成法合成了茶氨酸,其生产原料分别是乙胺和吡咯烷酮,单产率仅为9%。之后郑国斌进行了大量的试验采用在惰性气体下,压力为20 MPa~45 MPa和30℃~55℃下,经72 h~96 h直接由L-吡咯烷酮酸与无水乙胺合成茶氨酸,产率达20%以上。也有研究学者根据茶树体内合成茶氨酸的原理,将谷氨酸在高温下脱水转化为环状的内酰胺结构,之后控制反应条件,使乙胺和具有环状结构的谷氨酸结合形成茶氨酸。郭甫成[33]也对茶氨酸的化学合成进行了研究,使焦谷氨酸和无水乙胺反应,茶氨酸产率可达到最高为21.2%,且反应过程时间短、速率快。陈银霞等[34]在研究茶氨酸的性能及合成的研究中也证明可以通过化学合成法以L-谷氨酸为原料生成茶氨酸。还有学者以谷氨酸为原料经过酯化和氨基酰化反应,再经水解和纯化反应得到茶氨酸,该产品可做为营养添加剂,加工条件温和,适合于产业化生产[35]。
5.1抗疲劳作用
根据产生部位的不同将运动性疲劳分成:神经递质的变化和中枢疲劳产生的机制相关两种形式,而体内功能物质的耗竭及代谢产物的堆积直接导致外周疲劳的产生;茶氨酸可以缓解疲劳,其机制可能与茶氨酸可提高兴奋性神经递质含量,而减少抑制性神经递质含量及促进谷氨酸受体活性相关。在茶氨酸的抗疲劳功能研究领域,我国学者谭俊峰等[36]根据人体质量以60 kg计,每日推荐剂量为1.4 g,以相当于人体剂量的5、10、30倍进行对云南昆明种小鼠进行灌胃,而对照组以等量的蒸馏水灌胃连续30 d。研究结果为供给高剂量的小鼠组在负重游泳时间上能够得到明显的延长,并且发现能明显增加肝糖原含量,降低血清尿素含量,而对血乳酸无明显影响。除了以小鼠为实验对象外,也有学者以患病者对象。吴家喻[37]对60名患有慢性疲劳综合征的病人进行30 d的茶氨酸口服实验,发现茶氨酸口服治疗组总有效治疗率远比对照组高。综合以上实验均可得出可通过茶氨酸延缓运动性疲劳。
5.2镇静作用
众所周知,饮用咖啡碱后会感到兴奋,茶叶中也有咖啡碱,但人们饮用茶后反而觉得很平静、心境舒畅、放松,可平静激动的心情。通过饮茶摄入咖啡碱与直接单独摄入等量的咖啡碱人体反应不相同。这一观点已经证实是由于茶氨酸的作用。有研究发现,对两人进行试验,两人分别饮用水100 mL和100 mL的茶氨酸溶液,1小时后进行脑波实验的测定,发现饮用茶氨酸溶液的试用者的脑波处于松弛状态的程度相对饮用蒸馏水的试用者的松弛度明显较强。同时也有研究发现茶氨酸的镇静作用对于情绪不安者具有更好的镇静效果。有研究学者对小鼠戊巴比妥钠镇静催眠作用的研究中发现,在单纯使用茶氨酸时小鼠的正常自发活动受到茶氨酸剂量依赖性抑制,其半数抑制量为0.851 8 g/kg[38]。龙门[19]在研究茶氨酸抑制小鼠中枢兴奋作用中表明:在考察小鼠喂食茶氨酸后对自主活动行为指标的影响因茶氨酸浓度(1 mg/kg~15 mg/kg)的增加呈现剂量效应,且能明显的抑制小鼠的自主活动。
5.3对脑神经细胞保护作用
老年人会随着年龄的增长脑神经细胞逐渐死亡,最终出现老年痴呆症、脑栓塞等脑障碍,老年疾病的发病率也会升高。Egashira N[39]选用大脑中动脉堵塞的小鼠进行实验,分别注射等量的蒸馏水和茶氨酸溶液,实验表明在蒸馏水和茶氨酸溶液(1 mg/kg)分别对小鼠注射一天后,注射茶氨酸溶液的小鼠脑中的梗塞体积显著减小。茶氨酸抑制脑神经死亡的作用可使缺血后脑损害的发生延迟,为进一步手术治疗争取宝贵时间。沈慧[40]也证明茶氨酸对脑缺血大鼠进行再灌注可以保护由此引起的神经损伤,其作用机制与中枢抑制性氨基酸类神经递质含量的提高,中枢兴奋性氨基酸类神经递质被抑制有关。茶氨酸对脑神经细胞的保护作用与大鼠脑中GluR2mRNA、PLC-γ1mRNA的表达量有关。在喂食茶氨酸各剂量组后大鼠脑中GluR2mRNA表达量均高于模型对照组,且高剂量组表达量高于低剂量组。同样的在喂食茶氨酸后大鼠脑中PLC-γ1mRNA的表达量均高于对照组且高剂量组表达量较大[41]。茶氨酸对脑细胞神经的保护作用在何敏菲的研究中同样被证实,何敏菲[42]证实咖啡碱与茶氨酸能够显著促进细胞的生长,且促进作用的强度随着茶氨酸的浓度升高而增强,最高修复率和保护率分别为35.1%和47.1%。茶氨酸能够保护和修复脑神经细胞这一重大功能,必将在未来的医疗救护上起到重要作用,可以为医生拯救伤者争取到宝贵的时间,也将在一些老年病的疗养上起到重要作用。
5.4抗肿瘤作用
肿瘤细胞中谷氨酸盐的代谢比正常细胞中谷氨酸盐的代谢要活跃,而茶氨酸是谷氨酸盐的衍生物,作为谷氨酸盐的竞争物,茶氨酸主要抑制肿瘤细胞中谷氨酸盐的代谢从而抑制肿瘤细胞的生长。外国学者Sugiyama等[43]研究认为,茶氨酸和谷氨酸盐使用相同的载体,当摄入茶氨酸时,其会与谷氨酸争夺载体使肉瘤细胞摄入谷氨酸盐减少15%,且减少量依茶氨酸的剂量有关。后来外国学者Zhang等[44]用含0.1%茶氨酸或2%绿茶粉末的酪蛋白食物喂养患有肝细胞恶性肿瘤的白鼠14 d,研究发现,随着喂养时间的延长肿瘤细胞的体积和重量在慢慢减少,因此认为茶氨酸对肿瘤细胞有直接抵抗作用。茶氨酸除了能直接抗癌也能抑制癌细胞的浸润的能力。随着肿瘤细胞生长,肿瘤细胞会对周围组织的浸润进行周边的扩散,转移到身体的其他部位,服用茶氨酸抑制癌细胞的浸润可以有效的延长癌症患者的生命。除了直接使用茶氨酸进行癌症细胞的抑制外,近几年有研究将茶氨酸的衍生物茶氨酸溴香酰胺(TBrC)用于各种癌细胞的治疗,例如TBrC用于抑制肺癌细胞、肝癌细胞和乳腺癌细胞的生长,并在研究领域取得了较大的成果,这对未来临床治疗或辅助治疗癌细胞具有重要意义[45-47]。
5.5减轻体脂作用
茶氨酸可以有效减少体内脂肪含量,在用茶氨酸不同浓度溶液喂养雌鼠16周后,发现当茶氨酸溶液的浓度为0.04%时能有效的降低小鼠体重和体内脂肪组织含量。又有研究者在小鼠饲料中添加0.028%茶氨酸喂养16周后,与对照组相比体重明显下降,且腹腔脂肪将至对照组的58%。同时在血液和肝脏中胆固醇含量也明显减少,表明茶氨酸能够有效的减少体内胆固醇含量。此外研究还发现茶氨酸能有效抑制由于氨基半乳糖所引起的肝细胞坏死,抑制脂质的过氧化,从而恢复肝细胞的抗氧化能力。茶氨酸在减肥作用方面具有一定的效果,但茶氨酸引起体脂减少的机制尚不明确。
5.6降血压的作用
茶氨酸可以很好的调节心血管系统,降低血压为主要部分。通过动物实验研究表明,茶氨酸能够有效的降低高血压大鼠的血压。用1.5 g/kg或2.0 g/kg的茶氨酸注射高血压的大鼠会引起血压的显著降低,降低程度与注射用的茶氨酸剂量有关,在注射2.0 g/kg的茶氨酸时可降低约40 mmHg,但不影响心率的变化,而对血压正常的大鼠则没有效果。还有研究发现,茶氨酸被大鼠吸收后可在脑中积累,可明显降低脑中5-羟色胺及其代谢产物5-羟基吲哚醋酸的含量。且已证实茶氨酸与5-羟色胺降血压的作用机理不相同,茶氨酸主要是通过影响末梢神经或血管系统而调节血压,抑制由于应激作用引起的血压升高。有外国研究学者对16名高血压例志愿者采用随机、交叉、安慰剂对照设计,观察服用咖啡因或茶氨酸后对高血压的调节作用。研究结果表明,患者在接受应激作用的前体下,高反应人群在服用茶氨酸后能够明显降低应激性血压的升高,但是不对因过重体力应激而引起的血压升高起调节作用[48]。
在当今快速发展的社会,一些植物的功能性成分正慢慢被开发和利用。茶氨酸为人体非必须且为非蛋白氨基酸,茶氨酸是一种安全、无毒、同时具有多种功能的成分,具有广阔的药理开发前景。茶氨酸在上世纪50年代就已被发现,现在茶氨酸已在食品的添加、功能性保健产品的开发、疾病的防御和治疗上得到广泛的应用,但茶氨酸的研究大多还停留在动物实验上,缺乏医学临床治疗的支持,且茶氨酸药理作用的机制不明确,还有待研究和突破现有的领域。因此应当加强茶氨酸制备的研究,开发新的功能性产品,保健药物;加强对生物体内茶氨酸药物的吸收、分布、代谢和排泄等情况的研究;更清楚的了解茶氨酸的生理、药理功能及作用机制,更好的利用和开发茶氨酸。在将来茶保健品中茶功能性成分和医药的结合必将更加紧密,以茶氨酸为主要成分的药品在医药上的应用必将更加受到重视。因此,应采用先进的现代分子生物学研究茶氨酸,结合医学临床研究,阐明茶氨酸的药理作用机制,为医学上利用茶氨酸提供理论参考。
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The Research and Utilization of Theanine in Tea
LIN Wei-dong1,SUN Wei-jiang1,2,*,GUO Yi-hong1,PENG Jing1
(1.College of Horticulture,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,Fujian,China;2.Anxi College of Tea Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,Fujian,China)
Theanine is none of the protein amino acid,one of the main flavor substances in tea.Occupy the total amino acids 50%-60%in the tea,which occupy take up total dry tea about 1%-2%.Because of the good physiological function,theanine is becoming more and more popular since 2013,and it has been applied widely to the production.This article summarizes tea from the nature of theanine,the synthesis and metabolic of theanine in tea,the study of theanine in vitro synthesis at home and abroad,and the health care functions of theanine,at the end of article prospected the theanine in future development direction.
theanine;synthesis;healthcarefunction
10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.048
国家“863”计划(2013AA10260605);紫化芽叶茶树种质资源的挖掘保存与创新利用(2015N5008)
林伟东(1990—),男(汉),在读硕士研究生,本科,研究方向:茶树遗传育种。
孙威江(1964—),男(汉),教授,博士生导师,博士,研究方向:茶叶质量安全认证。
2015-11-05