乳酸菌-双歧杆菌-C+菌组合发酵玫瑰抽提物的探究

李永波，李静，吴大旺，肖国学

（黔南民族师范学院生命科学与农学学院，贵州都匀558000）

乳酸菌-双歧杆菌-C+菌组合发酵玫瑰抽提物的探究

李永波，李静，吴大旺，肖国学

（黔南民族师范学院生命科学与农学学院，贵州都匀558000）

以干玫瑰花蕾为材料，浸提料液质量比1∶4，温度80℃，提取时间60 min，浓缩温度60℃～70℃条件下，水抽提玫瑰的干物质得率为15.43%。采用益生菌乳酸菌、双歧杆菌和C+菌组合发酵，适宜玫瑰饮料配方为：玫瑰干粉5g，柠檬酸0.27 g，白砂糖60 g，蜡质0.1 g，定容至1 000 mL，灭菌后加入无菌维生素C 1 200 mg、混合菌种30 mL。饮料主要营养成分为：小分子有机酸（折合成乳酸）0.021g，氨基酸0.052g，蛋白质0.102g，总糖57.5g。

玫瑰花；饮料；益生菌发酵

食用玫瑰属蔷薇科植物，花含有丰富的蛋白质、多糖、VC、膳食纤维和多种氨基酸等营养物质，富含必需氨基酸和不饱和脂肪酸（亚油酸），总脂肪含量较低［1］。因此，营养结构较好，不仅作为观赏花卉，还是一种很好的花卉食品资源。目前国内对玫瑰的加工利用主要有以下几种：干花茶、玫瑰花泡酒、花瓣浸膏、玫瑰干花粉、玫瑰精油提取等利用形式［2-6］，这些初加工产品的使用人群往往有限。如玫瑰花茶，虽然芳香浓郁，但是饮用花茶的人群较小，且利用率较低；泡酒虽然利用率有所提高，但是适宜人群范围较窄；花瓣浸膏一般用作加工汤圆、糕点、玫瑰糖（玫瑰蕊子）等，缺点是不耐储藏，且往往由于不良商贩违规添加其它成分，以次充好，限制了玫瑰加工食品的推广。以上种种因素，极大地制约了食用玫瑰产业的发展，因此，开展食用玫瑰的深加工研究具有现实意义。

查阅文献发现，采用益生菌发酵食用玫瑰的研究鲜见报道，仅有少量相近的研究［5-9］，反映开展该研究工作的价值。采用现代生物抽提技术，通过益生菌发酵，探究生产基于食用玫瑰为原料的玫瑰花饮品，既满足人们追求健康生活的理念，为深加工食用玫瑰提供借鉴。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1生物质材料

双歧杆菌、乳酸菌、副干酪乳杆菌（C+菌）：由黔南民族师范学院生物技术与农学院微生物实验室分离鉴定；干玫瑰花蕾：平阴1号。

1.1.2培养基

菌种活化固体培养基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂15 g～20 g、水1 000 mL、pH 7.0～7.2；种子培养基：玫瑰干粉5 g、蛋白胨5 g、柠檬酸0.27 g、白砂糖60 g、琼脂15 g～20 g、加水定容至1 000 mL；种子扩大培养基：玫瑰干粉5 g、柠檬酸0.27 g、白砂糖60 g、玫瑰蜡0.1 g、加水定容至1 000 mL，pH自然。

1.1.3试剂

蒸馏水、无水乙醇、柠檬酸、0.1 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液、1%酚酞指示剂溶液、1.2%茚三酮溶液（20 g/L）、pH=8.04磷酸缓冲液、氨基酸标准溶液（0.5%甘氨酸溶液）、考马斯亮蓝试剂、标准蛋白质溶液、葡萄糖标准液、浓硫酸、蒽酮试剂［10］，以上药品均为分析纯：购自贵州省化学试剂有限公司；

1.1.4主要仪器设备

721型分光光度计：上海现科分光仪器有限公司；HH.S21-8-S型恒温水浴锅：上海龙跃仪器设备有限公司；ZXFD-A5430型干燥箱：上海智城分析仪器制造有限公司；JYT-5LN型聚能式超声波提取浓缩机组：上海矩源机械有限公司；TGL-20M离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1玫瑰干粉的制备

称取玫瑰干花蕾放入提取容器管中，装入量不低于提取罐的55%且不超过75%；加水提取：花蕾与水的质量比1∶4；提取条件：温度80、95、100℃，常压；超声波搅拌，重复4次～6次至浸出液基本无色时止；浓缩：将玫瑰提取液转入浓缩罐，在压力0.15 MPa～0.2 MPa和温度60℃～70℃下进行减压蒸发，得浓缩玫瑰浸膏；干燥：将玫瑰浸膏置于60℃的恒温干燥箱中鼓风干燥至恒重，研磨即得玫瑰干粉，置入冰箱冷藏备用。

1.2.2菌种的活化及扩繁

待试菌种于牛肉膏蛋白胨培养基上活化，种子培养基适应性培养后无菌水洗脱，接种至液体三角瓶，39℃、120 r/min恒温振荡培养48 h后使用。

1.2.3益生菌组合发酵试验

玫瑰干粉5g、柠檬酸0.27g、白砂糖60g、蜡质0.1g、加水定容至1 000 mL，分装250 mL三角瓶各100 mL灭菌后，每瓶加入无菌维生素C 120 mg并接种组合菌种3 mL，混合菌种体积比：乳酸菌∶双歧杆菌∶C+=1∶1∶1，总接种体积比1%、3%、5%。于39℃、120 r/min条件下恒温振荡培养48 h，连续取样测定主要成分。

将发酵完毕的玫瑰饮料置于冰箱冷藏后熟过夜，采用问卷调查法在校园内随机派发自愿品尝的测试者30人以上，记录测试对象对发酵饮料的评价。

1.2.4总酸测定［9］

吸取10.0 mL发酵液于100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容。取10.0 mL稀释液于10 mL的离心管中，3 000 r/min离心20 min，取上清液置于50 mL的小烧杯中，用0.01 mol/L NaOH滴定至酸度计指示pH=8.2，留空白对照。

1.2.5茚三酮法测定氨基酸含量

查相关文献根据其背景值［10-11］设计检测方法：准确吸取200 μg/mL的L-gly标准溶液0.0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mL，分别置于10 mL离心管中，加蒸馏水补充至4 mL，各加茚三酮溶液（20 g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH为8.04）各1 mL，混匀，沸水浴10 min，取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。静置10 min后，在570 nm波长下，以空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的含量为横坐标，吸光度A值为纵坐标，绘制标准曲线，分析计算求检测条件下的回归方程。

外标法：吸取3 000 r/min、离心20 min的玫瑰发酵饮料上清液1 mL，依次加入上述标准溶液，测混合液的光吸收值。代入方程计算发酵液中游离氨基酸的含量。

1.2.6蒽酮硫酸比色法［12］测定总糖

检测方法：取7支大试管，各加入0（CK）、10、20、30、40、60、80 μg/mL标准糖液1 mL，蒽酮试剂4 mL，浓硫酸5mL，冰浴冷却后，管口加盖统一放入沸水水浴。准确煮沸10 min取出，快速冰浴冷却至室温，于620 nm波长下检测空白及其余各试管吸光值A620。以标准糖含量（μg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标，作出标准曲线，求出回归方程。外标法测定发酵液糖含量：发酵液离心，吸取0.5 mL，以蒸馏水稀释摇匀，50 mL容量瓶定容。取0.5 mL发酵稀释液于上述标准葡萄糖溶液中，测混合液吸光值，重复3次，取平均值代入回归方程求解。

1.2.7考马斯亮蓝法测定发酵液中的蛋白质［13］

检测方法：取6支试管，加入不同浓度的标准蛋白溶液：0（CK）、200、400、600、800、1 000 μg/mL各1 mL，加入考马斯亮蓝G-250各5 mL，混匀，于595 nm处比色。以蛋白质含量为横坐标，A595值为纵坐标，绘制标准曲线，求此条件下的回归方程。取发酵液1 mL，处理方法同上，测A595值，重复10次，取平均值代入回归方程计算蛋白质含量。

1.2.8统计分析

氨基酸、蛋白质含量数据分析采用LSD法分析。

2　结果与分析

2.1玫瑰干粉的制备

玫瑰在不同的温度下所需抽提时间及浓缩效果见表1。

表1　浓缩提取条件与效果Table 1Concentration extraction conditions and enrichment extraction effect

80℃水提取60 min情况下，所得玫瑰干粉颜色好，苦味适中，气味香浓，得率最大，建议在此条件下提取玫瑰浸膏。

2.2玫瑰抽提物发酵

在菌种加入量不同的情况下，益生菌组合发酵饮料随机调查品评结果见表2。

表2　乳酸菌-双歧杆菌-C+菌组合发酵Table 2The combination of lactic acid bacteria and C+bacteria fermentation

结果表明：组合菌种接种量以3%为宜。接种量过少，菌多糖形成量偏少，口感偏甜；接种加大至5%时，发酵速度过快易产生沉淀，酸甜失调。

2.3pH值随时间的变化曲线

发酵过程中pH值的变化见图1。

图1　pH值随时间变化的曲线Fig.1The pH value curve varied with time

发酵初期发酵液pH值下降快，发酵至10 h pH值降至最低3.95，此后pH值基本不再下降，说明组合菌的产酸代谢基本停止。

2.4总糖随时间的变化曲线

用蒽酮硫酸法测得玫瑰浸膏中的总糖含量与光吸收值符合下述回归方程：

其中：X为糖含量，μg/mL；A620为吸光率。

发酵过程中总糖的变化见图2。

图2　总糖随时间变化的曲线Fig.2Change curve of total suger with time

从图2可知，发酵初期，组合菌的代谢活跃，糖的消耗较快，这在发酵开始的前10个小时变化最明显。之后，尽管糖含量的总趋势逐步降低，但变化幅度很小。

2.5氨基酸含量测定分析

用茚三酮法测得游离氨基酸的含量与光吸收值符合下述回归方程：

式中：Y为游离氨基酸含量，μg/mL；A570为吸光率。发酵液中游离氨基酸含量随时间变化特点见图3。

图3　不同浓度游离氨基酸与茚三酮反应的吸光率（外标法）Fig.3The light absorption rate of different concentrations of free amino acid and ninhydrin reaction（External Standard Method）

2.6蛋白质含量测定分析

标准蛋白经考马斯亮蓝染色后其A570变化曲线如图4。

用考马斯亮蓝法测得标准蛋白质的含量与光吸收值符合下述回归方程：P=1 538.5 A570-9.23

式中：P为游离蛋白质含量，μg/mL；A570为吸光率。

将发酵液的吸光率代入回归方程计算得蛋白质平均含量为0.102 g/L。

图4　不同浓度的标准蛋白经考马斯亮蓝染色后的吸光率Fig.4The light absorption rates of different concentrations of standard protein dye by Coomassie brilliant blue

2.7对发酵液中游离蛋白质、氨基酸含量的统计分析

LSD法统计分析表明：玫瑰抽提物中游离氨基酸极少，茚三酮法不能直接准确检测。经混合菌株发酵后，发酵液中游离氨基酸的含量上升明显，水溶性蛋白质的含量有所下降，具体见表3。

表3　对玫瑰花饮料营养成分进行差异显著性比较Table 3The differences of nutritional components in rose beverage were compared

3　结论与讨论

3.1结论

干玫瑰花苞在浸提料液质量比1∶4，温度80℃，时间60 min，浓缩温度60℃～70℃，水抽提玫瑰干物质得率为15.42%。玫瑰花饮料配方：玫瑰干粉5 g，柠檬酸0.27 g，白砂糖60 g，蜡质0.1 g，菌种30 mL。每1 000 mL饮料主要营养成分含量：小分子有机酸（折合成乳酸）0.021 g，氨基酸0.052 g，总糖57.5 g，蛋白质0.102 g。

3.2讨论

水提取玫瑰干粉的主要影响因素有浸提时间和温度，浸提温度愈高，虽得率也相当，耗时短，但香味损失重。发酵饮料中有机酸含量折合乳酸计算得0.021 g/L，由于乳酸的电离度比其它有机酸大，故实际酸含量要大些。发酵至10 h pH值降至最低3.95，此后pH值基本不再下降，说明组合菌的产酸代谢基本停止，推测pH值已对菌体生长活动产生抑制，但是此时发酵液中的糖含量仍在缓慢下降，造成饮料口感越来越酸。经益生菌发酵，游离氨基酸的含量上升明显，水溶性蛋白质的含量有所下降，说明通过发酵饮料中的鲜味物质增加，较好地改善了口感。

［1］马猛华，崔波，于海峰，袁传帧.玫瑰花的研究进展［J］.山东轻工业学院学报（自然科版），2008，22（4）：38-42

［2］吴荣书，赵晓峰，董文明，等.新型食用玫瑰花酱的研制［J］.食品研究与开发，2005（3）：125-127

［3］陈嘉，马俊，曾凡坤，等.玫瑰花露酒的研制［J］.现代食品科技，2006（3）：152-153

［4］赵晓峰.食用玫瑰茄红色素的稳定性研究［J］.中国调味品，2009（12）：91-93

［5］王文勃，薛艳芳，王帅，等.玫瑰花饮料的研究［J］.农产品加工：学刊（下），2014（7）：9-12

［6］李可怡，何玲，夏源苑.玫瑰花浸提条件及玫瑰花饮料工艺的研究［J］.饮料工艺，2011，14（10）：22-25

［7］李玉荣，张素华，卞言广.干制花卉饮料最佳技术参数的探讨［J］.广东农业科学，2010（6）：160-163

［8］樊丹敏，寇灿，莫新春，等.玫瑰花饮料的研制［J］.饮料工艺，2014（12）：8-10

［9］孟岳成，石双妮，陈杰.玫瑰花最佳浸提工艺优化及其茶饮料［J］.食品科技，2012（8）：92-96

［10］徐怀德，刘邻渭，李元瑞，等.几种干花成分分析及玫瑰花饮料加工技术研究［J］.西北农业科技大学学报（自然科学版），2003，31（3）：91-95

［11］刘家富，汪禄祥，黎其万，等.云南食用玫瑰的营养成分研究［J］.西南农业学报，2006，19（增刊）：129-132

［12］王秀奇，秦淑媛，高天慧，等.基础生物化学实验指导（第二版）［M］.北京：高等教育出版社，1999

［13］冯昕，王吉中，尧俊英，等.考马斯亮蓝法测定乳与乳制品中蛋白质含量［J］.粮食与食品工业，2010，17（3）：57-59

Lactobacillus-Bifidobacterium-Lactobacillus Paracasei Combined Fermentation of Rose Beverage

LI Yong-bo，LI Jing，WU Da-wang，XIAO Guo-xue
（Academy of Life Science and Agriculture，Qiannan Normal College for Nationalities，Duyun 558000，Guizhou，China）

Using dry rose bud，extraction of solid-liquid mass ratio 1∶4，temperature 80℃，extracting time 60 min，concentrated temperature 60℃-70℃，the extraction yield of rose is 15.43%by water.The probiotic fermentation with lactobacillus，bifidobacterium and combination C+bacteria，appropriate rose beverage recipe for：rose powder 5 g，citric acid 0.27 g，granulated sugar 60 g，wax 0.1 g，the capacity to 1 000 mL，sterilization. Then joining 1 200 mg of vitamin C，30 mLmixed bacteria.Main nutrition of drinks are as follows：small molecule organic acids（converted into lactic acid）0.021 g，amino acid 0.052 g and protein 0.102 g，total sugar 57.5 g.

rose；drink；probioticfermentation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.040

贵州省科技厅项目（S2016JP00401745313）；贵州省科技厅项目（黔科合LH［2012］7427）；黔南民族师范学院微生物学院级重点学科项目（zdxk2011-09）

李永波（1976—），男（汉），副教授，硕士，研究方向：应用微生物学。

2016-06-06