HPLC-MS/MS法测定猪肉中克伦特罗和莱克多巴胺

孙清荣，李楠，郭礼强，王洪涛

（1.山东科技职业学院，山东潍坊261053；2.潍坊出入境检验检疫局，山东潍坊261041）

HPLC-MS/MS法测定猪肉中克伦特罗和莱克多巴胺

孙清荣1，李楠1，郭礼强2，王洪涛2

（1.山东科技职业学院，山东潍坊261053；2.潍坊出入境检验检疫局，山东潍坊261041）

研发聚合物整体柱微萃取（Polymer monolith microextraction，PMME）柱，建立猪肉中克伦特罗和莱克多巴胺的高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）检测方法。样品用乙酸铵缓冲液提取，通过聚（甲基丙烯酸－乙二醇二甲基丙烯酸酯（p（MAA-co-EGDMA））柱进行富集净化，用甲醇洗脱，采用HPLC-MS/MS进行测定，梯度洗脱，流动相为甲醇和含0.1%的甲酸水溶液；质谱采集模式为电喷雾正离子多反应监测模式。以克伦特罗-D9为内标，克伦特罗的的线性范围为0.015μg/L～1.00 μg/L，相关系数（R2）大于0.99，定量限为0.05 μg/kg，3个不同水平的加标平均回收率为88.9%～105.0%，相对标准偏差小于10%。以莱克多巴胺-D3为内标，莱克多巴胺的的线性范围为0.15 μg/L～10.0 μg/L，相关系数（R2）大于0.99，定量限为0.50 μg/kg，3个不同水平的加标平均回收率为89.9%～105.0%，相对标准偏差小于10%。该方法具有操作简单、灵敏度高、重现性好，试剂用量少等特点，符合食品样品中痕量污染物的检测要求。

固相微萃取；HPLC-MS/MS；猪肉；克伦特罗；莱克多巴胺

克伦特罗（Clenbuterol）和莱克多巴胺（Ractopamine）是一类人工合成的肾上腺素β2-受体选择性激动剂。由于β2-受体激动剂过量添加可促进动物（如猪、牛、羊等）生长，使体内的脂肪分解代谢增强，显著提高瘦肉率，所以自20世纪80年代以来，在利益的驱动下，β2-受体激动剂被非法地添加于饲料中。然而，β2-受体激动剂在动物体内代谢慢，残留时间长，被人食用可能导致心动过速、心率失常、肌肉疼痛、恶心和眩晕等症状的发生［1］，严重威胁了人类健康。从1998年至今，我国相继发生至少19起较大规模的瘦肉精中毒事件［2］，涉及人员达4 000多人。2009年，日本通报从我国进口猪、牛肉制品中检出39批次“瘦肉精”残留，涉及全国14家大型出口企业，不仅造成约2.5亿美元经济损失，也对我国肉制品出口质量安全声誉造成不良形象［2］。因此，从根本上解决“瘦肉精”问题，需要政府部门、行业、企业、监管部门等付出不懈努力。

目前，国家规定的瘦肉精有16种，克伦特罗和莱克多巴胺因为价格低廉、容易购买且见效快，是违法分子最常用的饲料添加剂。国内外对克伦特罗和莱克多巴胺残留的检测方法主要有ELISA法［3-4］，HPLC法［5］、GC-MS法［6］、HPLC-MS/MS法［7-8］。其中，ELISA法存在假阳性情况［9-10］，HPLC法灵敏度较低，达不到兽药残留的检测限，GC-MS法前处理较复杂，大大增加了结果的不确定度。而HPLC-MS/MS法具有灵敏度高、假阳性率低的特点，常用作筛选后阳性样品的确证，是β2-受体激动剂残留测定中最常用的定量和确证方法。

由于猪肉样品基质效应较强，样品的前处理是影响其分析结果准确性的关键因素。1989年，Pawliszyn［11］等提出固相微萃取技术，该技术无需溶剂萃取，样品消耗量少，操作简便、快速、选择性好、灵敏度高，集萃取、净化、富集于一体，易于自动化处理。在此基础之上，人们还发展了诸如薄膜微萃取［12］、管内固相微萃取［13］、管外固相微萃取［14］等在内的SPME模式。在本文中，我们研发聚（甲基丙烯酸－乙二醇二甲基丙烯酸酯）［p（MAA-co-EGDMA）］整体柱材料为萃取介质的聚合物整体柱微萃取（Polymer monolith microextraction，PMME）技术，构建了一种新型的固相微萃取模式。

我们研究小组首先将有机聚合物整体柱材料引进In-tube SPME技术中，制备了p（MAA-co-EGDMA）毛细管整体柱［15］。该整体柱性质稳定，其疏水的主链和酸性的侧链羧基官能团使其对疏水的碱性化合物有较好的萃取效率，将此PMME技术应用于β2-受体激动剂残留的预处理，该法能较好地去除猪肉中的基质干扰，再结合HPLC-MS/MS，建立了一种猪肉中β2-受体激动剂分析的新方法。试验结果表明，该方法的克伦特罗检测限低至0.05 μg/kg，莱克多巴胺检测限低至0.5 μg/kg。这种方法具有重现性好、回收率高、样品用量少等特点，适合于其定性、定量测定。

1　试验部分

1.1仪器与试剂

100 μL移液器、5810型离心机：德国Eppendorf公司；Agilent1200-6430液相色谱质谱联用仪（配ESI源）：美国Agilent公司；0.01 mg电子天平、0.01 g电子天平：德国梅特勒公司；T25型均质器、涡流混匀器：德国IKA公司；N-EVAP氮吹仪：美国organomation Associates公司；MCX柱：美国waters公司；PCX柱：天津Agela公司。

标准品克伦特罗和克伦特罗-D9（Clenbuterol-D9）：德国Dr.Ehrenstorfer公司；标准品莱克多巴胺和莱克多巴胺-D3：美国Sigma-Aldich公司；N，O-双三甲基硅基三氟乙酰胺：德国Macherey-Nagel公司；（100 mg，5 mL）C18固相萃取小柱：美国Agilent公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）：瑞士Acros公司；甲基丙烯酸（MAA）、偶氮二异丁腈（AIBN）、十二醇、甲苯：上海医药集团试剂公司；甲醇、乙酸乙酯、乙腈和甲酸均为色谱纯：美国Biopure公司；试验用水为超纯水。

1.2标准溶液的配制

1）称取克伦特罗、克伦特罗-D9、莱克多巴胺标准品各10 mg，加甲醇溶解并分别定容至100 mL，分别配成浓度为100 mg/L的标准储备液；莱克多巴胺-D3用丙酮溶解配成浓度为100 mg/L的标准储备液，于4℃冰箱中放置，备用。

2）用移液器取1 mL克伦特罗储备液用甲醇定容至100 mL，配成浓度为1 mg/L的中间储备液；移取克伦特罗中间储备液1 mL，莱克多巴胺储备液0.1 mL，用甲醇定容至100 mL，混标工作液中克伦特罗浓度为10 μg/L，莱克多巴胺浓度为100 μg/L；内标混标配制同前，用甲醇定容100mL，克伦特罗-D9浓度为10μg/L、莱克多巴胺-D3浓度为100 μg/L。试验中用甲醇稀释成所需要的浓度。

1.3P（MAA-EGDMA）毛细管整体柱的制备

PMME毛细管整体微萃取柱（20 mm×0.53 mm，i. d.）的合成为Y.Fan等［21］的方法上做了一定的改进：称取甲基丙烯酸48 mg，乙二醇二甲基丙烯酸酯420 mg，甲苯110 mg，十二醇860 mg，AIBN 4.5 mg，混匀，超声5 min。然后灌入内壁经（γ-甲基丙烯酰）丙基三甲氧基硅烷衍生后的毛细管中，两端以硅橡胶封口，于烘箱中60℃反应16 h后，用甲醇冲洗以除去致孔剂与未反应单体。最后除去一次性医用注射器（1 mL）针头的钢管部分，截取2 cm制备好的毛细管整体柱，用粘胶将其固定至原针头的钢管部位即可。

1.4萃取过程

1.4.1提取

精密称取（5±0.01）g猪肉样品于具塞离心管中，加入内标混合标准工作液100 μL，加入乙酸铵缓冲液10 mL，均质1 min然后加入β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶30 μL，涡混，37℃温育过夜。反应完毕后10 000 r/min离心10 min，收集上清液入另一50 mL离心管中，加入10 mL正己烷，涡混1 min，10 000 r/min离心10 min。（如上清液混浊，可用滤纸过滤）

1.4.2P（MAA-EGDMA）毛细管整体柱净化

1）活化：准确吸取0.3 mL的活化溶液（依次为甲醇、0.02 mol/L磷酸盐溶液（pH 7.0））于1 mL注射器中，套上萃取柱，装至注射泵上，以0.15 mL/min的流速推动活化溶液通过萃取柱。

2）萃取：将2 mL的样品溶液以0.5 mL/min的流速推过萃取柱。

3）清洗：吸取0.2 mL的0.02 mol/L磷酸盐溶液（pH 7.0），以0.1 mL/min的流速推过萃取柱。

4）解吸：用干净的空注射器推出萃取柱中残余的溶液，然后准确吸取0.4 mL的甲醇以0.1 mL/min的流速推过萃取柱，并在萃取柱出口端收集解吸液，以N2浓缩至干，0.2 mL流动相溶解上机检测。

1.5仪器参数与测定条件

1.5.1液相色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（1.8 μm，3.0× 100 mm）；柱温：40℃，流速：0.3 mL/min，进样量：10 μL；流动相：A 0.1%甲酸水，B甲醇，梯度洗脱程序：0→4.0 min，由25%B→80%B；4.0→6.0 min，80%B；6.01 min，25%B，平衡2.5 min。

1.5.2质谱条件

电离方式：ESI+；扫描方式：多反应监测（MRM）；干燥气温度：350℃；干燥气流速：8.5 L/min；喷雾针压力：40 psi；电子倍增器电压：4 000 V；碰撞气：高纯氮，99.999%，四种化合物质谱参数见表1。

2　结果与讨论

2.1单体选用原则和聚合条件的确定

甲基丙烯酸生产的聚合物有优越的悬浮、流变和耐久特性，可以提高粘接强度及稳定性，但易聚合成水溶性聚合物。乙二醇二甲基丙烯酸酯微溶于水，其参与共聚的聚合物，硬度增加，耐热、耐候，耐溶剂和摩擦性提高。AIBN的特点是分解反应比较平稳，只产生1种自由基，基本上不发生诱导分解，其作为引发剂，把甲基丙烯酸与乙二醇二甲基丙烯酸酯聚合后，再将其接枝到丙基三甲氧基硅烷衍生后的毛细管中，得到的三元聚合物粘结力强、强度适中、弹性高、化学稳定。由于聚合物的结构特点，作为固相微萃取涂层，能够对芳香化合物，羰基化合物等具有很好的溶解吸附作用。在制备的过程中，交联剂及致孔剂的比例、致孔剂的组成、引发剂的用量等因素都会影响整体柱的孔结构，通过优化条件，制成了孔径和柱压力降都比较理想的整体柱。

表1　克伦特罗和莱克多巴胺的质谱参数Table 1Mass soectrometric acquisition parameters of clenbuterol and ractopamine

2.2P（MAA-EGDMA）毛细管整体柱的优化

2.2.1溶液pH值的优化

样品溶液pH值对克伦特罗和莱克多巴胺的存在状态和稳定性有一定的影响，萃取效率的影响见图1。

图1　不同pH值对克伦特罗和莱克多巴胺回收率的影响Fig.1The effect of pH on the recoveries of clenbuterol and ractopamine

当pH值过高时，两种化合物主要为离子状态，极性变大，与聚合物之间的作用力减少，不利于吸附而降低吸附效率。相反，pH太低也不利于莱克多巴胺的衍生，也会影响整体柱的吸附。本文研究了pH 3～10时整体柱对化合物回收率的影响。在pH 5左右时回收率最高，分析p（MAA-co-EGDMA）整体柱上的羧基离解，而克伦特罗和莱克多巴胺质子化，整体柱对其萃取过程中以离子交换作用为主。

2.2.2萃取容量的考察

添加克伦特罗和莱克多巴胺浓度为0.5、0.05 μg/L，逐渐增大样品交换体积，得到分析物的交换体积与回收率的关系曲线见图2。

图2　不同萃取体积对克伦特罗和莱克多巴胺回收率的影响Fig.2The effect of different extraction volume on the recoveries of clenbuterol and ractopamine

如图2所示，随着萃取体积的增加，回收率也在不断增大，当萃取体积达到2 mL时，回收率基本达到平衡。本试验选择了2 mL作为实际样品萃取体积。

2.3方法的评价

2.3.1洗脱溶解类型与体积的优化

不同溶剂对目标物的洗脱能力不同，本研究分别考察了0.4 mL的甲醇、乙腈、乙酸乙酯对目标物的洗脱效果。研究发现，甲醇和乙腈的洗脱能力相差不多，均高于乙酸乙酯，因甲醇价廉低毒，选为洗脱溶剂。以不同体积的甲醇来考察洗脱体积对洗脱效率的影响，结果如图3所示。

图3　洗脱剂体积对克伦特罗和莱克多巴胺回收率的影响Fig.3Effect of eluent volume on the recoveries of clenbuterol and ractopamine

由图3可知，随着甲醇体积的增加，目标物的回收率逐渐增加，当甲醇用量为0.4 mL时达到最高，继续增加甲醇体积无明显变化，本文选择0.4 mL甲醇洗脱。

2.3.2线性范围与检出线

配制标准曲线（其中克伦特罗为0.015、0.050、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/L，莱克多巴胺为0.15、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L）进行测定，得到线性回归方程（克伦特罗为Y=1.436 6X-0.248 7，相关系数r=0.999 1；莱克多巴胺为Y=4.706 1X-0.855 8，相关系数r=0.999 7；其中X为目标物的相对浓度，Y为相对响应值）。在阴性猪肉中添加回收，按1.4节进行样品的前处理，以色谱峰的信噪比（S/N）的3倍和10倍分别计算检测限和定量限，克伦特罗检出线为0.015 μg/kg，定量线为0.05 μg/kg；莱克多巴胺检出线为0.15 μg/kg，定量线为0.5 μg/kg。

2.3.3回收率与精密度

以阴性样品为空白基质，分别添加信噪比1、2、10倍3个浓度的混标溶液，每个添加浓度水平进行6次测定，连续3天重复操作，其日内和日间的平均回收率和相对标准偏差（RSD）见表2。

表2　阴性猪肉样品中添加克伦特罗和莱克多巴胺的回收率和精密度Table 3Revoveries and ard deviations（RSDs）of clenbuterol and rectopamine in meat

2.4PMME整体柱和其它萃取柱的比较

阴性样品添加回收，我们使用PMME整体柱，以本试验优化的方法处理样品，和市场上Oasis MCX、Agela PCX小柱（提取方法参考文献［16］）进行比较。对比了3个浓度的添加回收（其中克伦特罗为0.05、0.10、0.50 μg/L，莱克多巴胺为0.5、1.0、5.0 μg/L），通过比较仪器检测结果与回收率，发现Oasis MCX小柱净化效果最好，但与另两种小柱差距不明显，见图4、图5，PMME整体柱和PCX小柱相差不大，但PMME整体柱有机溶剂用量少，操作更方便，快速。

2.5实际样品分析

对市场上出售的15份猪肉样品（各5份）进行了分析检测，其中有1份检出克伦特罗，含量为0.07μg/kg，超过了欧盟和日本的出口标准（限值0.05 μg/kg），图6为该阳性样品的色谱图。

图4　不同提取柱对克伦特罗回收率的影响Fig.4Effects of different Extraction columns on the recoveries of clenbuterol

图5　不同提取柱对莱克多巴胺回收率的影响Fig.5Effects of different Extraction columns on the recoveries of ractopamine

图6　克伦特罗和莱克多巴胺的混合标准溶液（a）和一个阳性样品（b）的HPLC-MS谱图Fig.6HPLC-MS chromatograms of（a）a mixed solution and（b）a real sample containing a primary clenbuterol

3　结语

建立了基于聚合物微萃取柱测定猪肉中克伦特罗和莱克多巴胺的HPLC-MS/MS方法。试验表明该方法具有检测限低、重现性好、回收率高、样品用量少等特点，已经成功应用于猪肉中克伦特罗和莱克多巴胺的检测，为猪肉样品中克伦特罗和莱克多巴胺的痕量检测提供技术支持。

［1］Whaites L X，Murby E J.Determination of clenbuterol in bovine urine using gas chromatography-mass spectrometry following cleanup on an ion-exchange resin［J］.J Chromatogr B，1999，728（1）：67-73

［2］管恩平，梦广校.猪体内瘦肉精代谢分析与安全控制［M］.北京：中国农业科学技术出版社，2013：2-3

［3］Boyd D，O’Keeffe M，Smyth M R.Matrix solid-phase dispersion as a multiresidue extraction technique for β-agonists in bovine liver tissue［J］.Anal，1994，119：1467-1470

［4］Haasnoot W，Stouten P，Lommen A，et al.Determination of fenoterol and ractopamine in urine by enzyme immunoassay［J］.Anal，1994，119：2675-2680

［5］Lin L A，Tomlinson J A，Satzger R D.Detection of clenbuterol in bovine retinal tissue by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection［J］.J Chromagr A，1997，762（1/2）：275-280

［6］Whaites L X，Murby E J.Determination of clenbuterol in bovine urine using gas chromatography-mass spectrometry following cleanup on an ion-exchange resin［J］.J Chromatogr B Biomed Sci Appl，1999，728（1）：67-73

［7］Wasch K D，Brabander H D，Courtheyn D.LC-MS-MS to detect and identify four beta-agonists and quantify clenbuterol in liver［J］. Anal，1998，123：2701-2705

［8］Hogendoorn E A，Zoonen P V，Polettini A，et al.Hyphenation of coupled-column liquid chromatography and thermospray tandem mass spectrometry for the rapid determination of beta 2-agonist residues in bovine urine using direct large-volume sample injection. Set-up of single-residue methods for clenbuterol and salbutamol［J］. J Mass Spectrom，1996，31（4）：418-426

［9］Hassnoot w，Stouten P，Schilt R，et al.A fast immunoassay for the screening of beta-agonists in hair［J］.Analyst，1998，123（12）：2707-2710

［10］Hahnau S，Jülicher B.Evaluation of commercially available ELISA test kits for the detection of clenbuterol and other beta 2-agonists［J］. Food Addit Contam，1996，13（3）：259-274

［11］Belardi R P，Pawliszyn J.The application of chemically modified fused silica fibers in extraction of organics from water matrix sam－ples and their raped transfer to capillary columns［J］.J Water Pollut Res，1989，24：179-191

［12］Norberg J，Thordarson E，Mathiasson L，et al.Microporous membrane liquid-liquid extraction coupled on-line with normal-phase liquid chromatography for the determination of cationic surfactants inriverandwastewater［J］.JChromatogrA，2000，869（1/2）：523-529

［13］Kataoka H，Lord H L，Pawliszyn J.Applications of solid-phase microextraction in food analysis［J］.J Chromatogr A，2000，880（1/2）：35-62

［14］Wang Y，O’Reilly J，Chen J，et al.Equilibrium in-fibre standardisation technique for solid-phase microextraction［J］.J Chromatogr A， 2005，1072（1）：13-17

［15］Fan Y，Feng Y Q，Da S L，et al.Poly（methacrylic acid-ethylene glycol dimethacrylate）monolithic capillary for in-tube solid phase microextraction coupled to high performance liquid chromatography and its application to determination of basic drugs in human serum［J］.Anal Chim Acta，2004，523（2）：251-258

［16］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.SN/T 1924-2011进出口动物源食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林残留量的测定液相色谱-质谱［S］.北京：中国标准出版社，2011：2-4

Determination of Clenbuterol and Ractopamine in Pork by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

SUN Qing-rong1，LI Nan1，GUO Li-qiang2，WANG Hong-tao2
（1.Shandong Vocational College of Science and Technology，Weifang 261053，Shandong，China；2.Weifang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Weifang 261041，Shandong，China）

A method was established for the determination of clenbuterol and ractopamine in pork based on Polymer monolith microextraction coupled with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）.The samples was extracted by ammonium acetate buffer and further purified by an PMME，which was eluted by methanol.The target compounds were assayed by HPLC-MS/MS with gradient elution using methanol and 0.1%of formic acid aqueous solution as mobile phases.The mass spectrometric acquisitions were carried out by means of multiple reaction monitoring（MRM）in electrospray positive ionization mode.The clenbuterol linearities（R2＞0.99）were achieved over the range of 0.015 μg/L-1.00 μg/L based on the internal standard calibration of clenbuterol-D9，the quantification limits of the method were 0.05 μg/kg.The mean recoveries of the clenbuterol（spiked at three concentration levels）ranged from 88.9%to 105.0%，with the relative standard deviations（RSDs）no more than 10%.The ractopamine linearities（R2＞0.99）were achieved over the range of 0.15 μg/L-10.0 μg/L based on the internal standard calibration of ractopamine-D3，the quantification limits of the method were 0.50 μg/kg.The mean recoveries of the clenbuterol（spiked at three concentration levels）ranged from 89.9%to 105.0%，with the relative standard deviations（RSDs）no more than 10%.This proposed method is simple，sensitive，reproducible，and complied with the regulations for the determination of trace contaminants residues in pork matrices.

solid-phase microextraction；high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；meat；clenbuterol；ractopamine

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.036

孙清荣（1970—），女（汉），副教授，硕士，研究方向：分析检测。

2015-11-24