超临界萃取多穗柯黄酮及其抗运动氧化功能研究

单思聪，孙爽

（吉林工程职业学院，吉林四平136001）

超临界萃取多穗柯黄酮及其抗运动氧化功能研究

单思聪，孙爽

（吉林工程职业学院，吉林四平136001）

采用单因素及正交试验优化超临界CO2萃取多穗柯黄酮工艺，并研究多穗柯黄酮对大鼠超氧化物歧化酶活力（SOD）、谷胱甘肽活力（GSH）及丙二醛（MDA）水平的影响。结果表明：最佳工艺参数为夹带剂添加量3.0 mL/g、萃取压力25 MPa、萃取温度30℃、萃取时间180 min，此工艺参数下所得黄酮含量为10.95%，与普通提取法相比黄酮含量提高1.51%。大鼠试验表明，与正常对照组相比，多穗柯黄酮组SOD、GSH明显升高，MDA水平明显下降，说明多穗柯黄酮可有效提高大鼠抗氧化能力，并且具有清除自由基的作用。

多穗柯；黄酮；超临界萃取；抗氧化

多穗柯（Lithocarpus polystarch）俗称甜茶，是壳斗科栎属作物，属于药食同源物质［1-2］，同时兼茶、药、糖三种功效，在我国属于传统民间药材，具有保健功能。多穗柯叶中具有大量的黄酮类成分［3-5］。近几年，黄酮类物质研究相对较多，究其原因可能是此类物质有降血糖、降血脂以及消除体内自由基、抗氧化等多重功效，提取多穗柯黄酮对开发运动员食用的保健品具有重要意义［6-7］。

目前有多种方法可用来提取多穗柯黄酮，如水提法、乙醇法、微波法、超声波法等，超临界CO2萃取多穗柯黄酮的研究还未见报道。与常规的提取法相比，超临界CO2萃取属于高新技术［8-10］，具有分离效率高、无污染、天然成分不易被破坏等优点［11-12］。为进一步提高多穗柯黄酮提取物中黄酮含量，本试验采用超临界CO2萃取多穗柯黄酮，并用正交试验优化萃取工艺，优化出最佳工艺参数。并研究多穗柯黄酮的抗运动氧化功能，为开发多穗柯黄酮类保健食品提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

多穗柯：陕西浩洋生物科技有限公司。

NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、无水乙醇：汇普试剂有限公司；芦丁（纯度＞95%）：西安贝拉生物科技有限公司。

Wistar大鼠：体质量130 g～150 g，雄性，动物质量合格证编号：SCXK-（吉）2008-0005，吉林大学实验中心提供。

1.2仪器与设备

Speed SFE型超临界二氧化碳萃取仪：美国Applied Separations公司；754N型紫外可见分光光度计：上海圣科仪器设备有限公司；JS-30S电子计数秤：深圳市盛美仪器有限公司；SHA-CA往复数显水浴振荡器：常州赛普实验仪器厂；HS-DZG-6050SA型真空干燥箱：上海和晟仪器科技有限公司；I-Ce100型离心机：上海永创医疗器械有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒（批号：20100322）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测试盒（批号：20100324）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）测定试剂盒（批号：20100325）：上海纪宁生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1超临界萃取多穗柯黄酮工艺流程

取一定量的多穗柯，将其洗净，然后放入烘箱中烘干，取出后粉碎至100目，得多穗柯粉，加入超临界设备萃取釜中，根据单因素及正交试验预设的压力、温度、时间等条件进行超临界萃取，在分离釜中得黄酮，进行测定。

1.3.2多穗柯黄酮含量测定

利用紫外可见分光光度计对芦丁标准溶液于510 nm处进行扫描，能够得出芦丁标准曲线回归方程为A=8.621 3C+0.002 8（R2=0.999 8），其中C为黄酮浓度（g/L），A为吸光度值。1 mL待测液体，利用无水乙醇将其稀释为5 mL，混合后再加入0.3 mL 5%NaNO2溶液，静置5 min，再加0.3 mL 10%Al（NO3）3溶液，静放6 min，再加4 mL 1 mol/LNaOH溶液及0.4 mL 30%乙醇溶液，混匀后静置10 min，于510 nm下测定其吸光度，根据吸光度可得出黄酮的浓度。

1.3.3超临界萃取多穗柯黄酮单因素试验

根据预试验，取夹带剂添加量［2.5、3.0、3.5、4.0、4.5（mL/g）］、萃取压力（20、25、30、35、40 MPa）、萃取温度（25、30、35、40、45℃）、萃取时间（120、150、180、210、240 min）作为因素，每个因素取5个水平，测定各因素对多穗柯总黄酮含量的影响。

1.3.4正交试验对多穗柯黄酮超临界萃取工艺的优化

根据单因素试验结果，应用正交试验优化工艺参数。试验因素与水平见表1。

表1　因素与水平Table 1Factors and levels

1.3.5动物实验

取雄性Wistar大鼠30只，喂养8 d后，随机分为正常对照组（Z组），高脂饲料组（G组），多穗柯黄酮组30 mg/（kg·d）组（HT组），每组10只大鼠，正常对照组给予普通饲料喂养，高脂饲料组给予高脂饲料喂养，多穗柯黄酮组给普通饲料喂养后还需按规定剂量注射多穗柯黄酮喂养，Z组和G组注射同体积生理盐水，每日1次，持续8周，待测，末次训练和喂食后，禁食12 h，麻醉处理，腹主动脉进行取血，分离血清，检测SOD活力、GSH活力以及MDA水平［13-16］。

1.4统计学处理

统计分析采用PASW Statistics 17.0版统计分析软件，多组之间采用单因素方差分析比较，组间比较采用t检验，结果以x±s表示［17］。

2　结果与分析

2.1超临界萃取多穗柯黄酮单因素试验

2.1.1夹带剂添加量对多穗柯黄酮提取效果的影响

夹带剂添加量对多穗柯黄酮提取效果的影响见图1。

图1　夹带剂添加量对黄酮含量的影响Fig.1Effect of amount of entrainer on flavonoids yield

由图1可知，当夹带剂添加量为2.5 mL/g时，黄酮含量较小，随着夹带剂添加量的增大，黄酮含量逐渐提高，原因可能是随着夹带剂添加量的提高，能够进一步提出黄酮，而夹带剂达到3.5 mL/g时，黄酮含量不再继续增大，说明夹带剂对黄酮含量提高有效果，但有极限溶解度，所以选择夹带剂添加量3、3.5、4 mL/g为多因素研究水平。

2.1.2萃取压力对多穗柯黄酮提取效果的影响

萃取压力对多穗柯黄酮提取效果的影响见图2。

由图2可知，随着萃取压力的增大，黄酮含量逐渐提高，当萃取压力为30 MPa时，黄酮含量最高，继续增大萃取压力，黄酮得率下降。原因可能是萃取压力过大，超临界流体破坏了黄酮分子结构，导致黄酮含量减小。因此选择25、30、35 MPa为多因素研究水平。

图2　萃取压力对黄酮含量的影响Fig.2Effect of extraction pressure on flavonoids yield

2.1.3萃取温度对多穗柯黄酮提取效果的影响

萃取温度对多穗柯黄酮提取效果的影响见图3。

图3　萃取温度对黄酮含量的影响Fig.3Effect of extraction temperature on flavonoids yield

由图3可知，多穗柯黄酮含量随着萃取温度的升高而增大，当萃取温度达到35℃时，黄酮含量最大，继续升高温度，黄酮含量下降，原因可能是温度过高后破坏了黄酮分子的结构致使黄酮含量减少。因此选择30、35、40℃为多因素研究水平。

2.1.4萃取时间对多穗柯黄酮提取效果的影响

萃取时间对多穗柯黄酮提取效果的影响见图4。

图4　萃取时间对黄酮含量的影响Fig.4Effect of extraction time on flavonoids yield

根据图4，当萃取时间为120 min时，黄酮含量最低，随着萃取时间的延长，黄酮含量上升，当萃取时间达到180 min后，继续延长时间，黄酮含量几乎不变，原因可能是通过超临界萃取，黄酮已几乎完全被提出，故继续延长萃取时间不会提高黄酮含量，因此选择萃取时间150、180、210 min为多因素研究水平。

2.2超临界萃取多穗柯黄酮正交试验结果与分析

利用软件SPSS16.0对本试验进行分析，结果见表2和表3。

表2　正交试验结果Table 2Orthogonal test results

表3　正交试验结果方差分析Table 3Variance analysis of orthogonal array design experimental results

由表3可以看出，夹带剂添加量、萃取压力、萃取温度、萃取时间对超临界萃取多穗柯黄酮含量的影响均极显著。各因素对多穗柯黄酮含量影响大小依次为是萃取压力＞萃取温度＞夹带剂添加量＞萃取时间，根据表2可知，最优试验方案是A1B1C1D2，也即工艺条件为夹带剂添加量3.0 mL/g、萃取压力25 MPa、萃取温度30℃、萃取时间180 min。由于A1B1C1D2不在9组试验中，对A1B1C1D2进行3次平行验证试验，其黄酮含量平均为10.95 mg/g，为最高，故A1B1C1D2为最优组合。

2.3多穗柯黄酮对大鼠SOD、GSH活性及MDA含量的影响

多穗柯黄酮对大鼠SOD、GSH活性及MDA含量的影响如表4所示。

表4　多穗柯黄酮对大鼠SOD、GSH活性及MDA含量的影响（±s，n=10）Table 4Effect of Lithocarpus flavonoids on SOD，MDA and GSH in rats（x±s，n=10）

表4　多穗柯黄酮对大鼠SOD、GSH活性及MDA含量的影响（±s，n=10）Table 4Effect of Lithocarpus flavonoids on SOD，MDA and GSH in rats（x±s，n=10）

GSH活力/（U/mL）Z组89.57±3.145.86±0.394.21±0.54 G组64.76±3.727.59±0.573.65±0.76 HT组3098.93±5.345.24±0.404.95±0.41组别剂量/［mg/（kg·d）］SOD活力/（U/mL）MDA含量/（nmol/L）

由表4可知，与Z组比较，G组大鼠MDA含量明显升高（P＜0.001），SOD活力、GSH活力明显降低（P＜0.001）。HT组大鼠MDA含量明显下降（P＜0.001），SOD活力、GSH活力明显升高（P＜0.001）。与G组比较，HT组大鼠MDA含量明显下降（P＜0.001），SOD活力、GSH活力明显升高（P＜0.001）。SOD作为体内极其重要的抗氧化酶和氧自由基清除剂，对机体氧化平衡至关重要，其活性的高低能够反映机体抗氧化能力；MDA是脂质过氧化的最终产物，它能阻碍细胞膜的流动性以及通透性，使细胞功能遭到破坏，能反映出机体过氧化物水平。GSH也能清除体内自由基，抗氧化，并能与体内毒物结合，加速代谢。通过本试验数据，能够得出，与Z组比较，HT组SOD活力及GSH活力明显升高，MDA水平明显下降，说明多穗柯黄酮可有效提高大鼠抗氧化能力，并且具有清除自由基的作用。综上所述，多穗柯黄酮具有一定的抗氧化作用。

3　结论

1）通过单因素和正交试验能够优化超临界法提取多穗柯黄酮工艺，最佳工艺条件为夹带剂添加量3.0 mL/g、萃取压力25 MPa、萃取温度30℃、萃取时间180 min，此工艺参数下黄酮含量为10.95%，与普通提取法相比提取率提高1.51%。各因素对多穗柯黄酮提取率的影响由大到小为萃取压力＞萃取温度＞夹带剂添加量＞萃取时间。

2）通过大鼠试验表明，与正常对照组相比，多穗柯黄酮组SOD活力、GSH活力明显升高，MDA水平明显下降，说明多穗柯黄酮可有效提高大鼠抗氧化能力，并且具有清除自由基的作用。

［1］李胜华，伍贤进，郁建平，等.多穗柯总黄酮提取工艺及其含量动态变化研究［J］.食品科学，2008，29（6）：139-141

［2］李胜华，伍贤进，牛友芽.HPLC测定多穗柯中二氢查耳酮含量研究［J］.食品科技，2010，35（6）：281-283

［3］张毅，宁正祥，董华强.多穗柯三叶苷的抑制糖尿病关键酶活性和抗氧化性［J］.食品科学，2011，32（5）：32-35

［4］张毅.多穗柯黄酮异戊烯改性及性质研究［D］.广州：华南理工大学，2011

［5］Hou Shao-Zhen，Chen Shu-Xian，Huang Song，et al.The hypoglycemic activity of Lithocarpus polystachyus Rehd.leaves in the experimental hyperglycemic rats.［J］.Journal of Ethnopharmacology，2011，24（2）：120-124

［6］Qian-Wen Wang，Jia-Jia Liu，Xiong.Purification of phloridzin from Lithocarpus polystachyus Rehd leaves using polymeric adsorbents functionalized with glucosamine and β-cyclodextrin［J］.Chemical Papers，2014，11（7）：32-35

［7］Huaqiang Dong，Zhengxiang Ning，Lijing Yu.Preparative Separation and Identification of the Flavonoid Phlorhizin from the Crude Extract of Lithocarpus Polystachyus Rehd［J］.Molecules，2007，123（32）：65-69

［8］樊红秀，刘婷婷，刘鸿铖，等.超临界萃取人参皂苷及HPLC分析［J］.食品科学，2013，34（20）：121-126

［9］任飞，韩发，石丽娜，等.超临界CO2萃取技术在植物油脂提取中的应用［J］.中国油脂，2010，35（5）：14-19

［10］万楚筠，胡双喜，李文林，等.超临界CO2萃取脱皮菜籽饼粕油脂的可行性［J］.农业工程学报，2014，30（9）：272-278

［11］高荫榆，游海，陈芩，等.蜂胶黄酮类化合物超临界萃取工艺研究［J］.食品科学，2002，23（8）：154-157

［12］樊文乐，武文洁.超临界萃取中夹带剂的概述［J］.食品科技，2005，13（2）：39-42

［13］杨娜，王鸿飞，许凤，等.蕨麻多糖提取及抗氧化活性研究［J］.中国食品学报，2014，14（2）：60-66

［14］李洋，马文平，倪志婧.宁夏枸杞体外抗氧化机理研究［J］.食品科学，2014，35（1）：79-84

［15］王晓宇，杜国荣，李华.抗氧化能力的体外测定方法研究进展［J］.食品与生物技术学报，2012，31（3）：247-252

［16］陈洁，胡晓赟.蛋白水解物的抗氧化性研究与展望［J］.中国食品学报，2011，11（9）：111-119

［17］张莲婷.麦冬药材资源品质评价［D］.南京：南京农业大学，2009

Study on the Supercritical Extraction Flavonoids from Lithocarpus and Its Anti-oxidation Effect

SHAN Si-cong，SUN Shuang
（Jilin Engineering Vocational College，Siping 136001，Jilin，China）

Single factor and orthogonal experiment of supercritical CO2extraction of flavonoids from Lithocarpus and study on effect of flavonoids on rats SOD，GSH，MDA levels.The result showed：the optimum parameters as entraineramountof3.0mL/g，extractionpressure25MPa，extractiontemperature30℃，extractiontime180 min，Under this parameter Flavonoids was 10.95%，compared with ordinary extraction flavonoid content increased 1.51%.Rat test showed that，compared with normal control group，Lithocarpus flavonoid group SOD，GSH increased significantly，MDA levels were significantly decreased，indicating Lithocarpus flavonoids could improve the antioxidant capacity in rats，and had the effect of free radical scavenging.

lithocarpus；flavonoids；supercritical extraction；antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.017

单思聪（1980—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：体育教育研究。

2016-03-07