乌饭树叶多酚的超声辅助提取及其抗氧化活性

陈瑞娇

（韶关学院英东生命科学学院，广东韶关512005）

乌饭树叶多酚的超声辅助提取及其抗氧化活性

陈瑞娇

（韶关学院英东生命科学学院，广东韶关512005）

对乌饭树叶多酚的超声波辅助提取最佳工艺及其抗氧化活性进行研究。结果表明：乌饭树叶多酚超声波辅助提取最佳工艺条件为超声温度75℃、超声时间40min、料液比1∶30（g/mL），在此条件下乌饭树叶多酚提取量可达71.01 mg/g。乌饭树叶多酚粗提物具有一定的还原力，对DPPH自由基具有较好的清除能力，且呈现良好的剂量-效应关系。

乌饭树叶；多酚；超声波辅助提取；抗氧化活性

乌饭树（Vaccsnium bracreatum Thunb）属于杜鹃花科越桔属常绿灌木，又名南烛，是一种药食兼用的植物。全国各地均有分布，尤其以长江流域以南山区分布最多。《本草拾遗》中记载“南烛枝叶，味苦平，无毒，止泄除睡，坚筋益气力，久服轻身长年，令人不饥，变白去老”。乌饭树叶富含花青素和槲皮素为代表的植物多酚类化合物［1］，众多的研究表明，植物多酚类化合物具有广泛的生物活性，如抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抑制心血管疾病等等［2-3］。目前对乌饭树叶多酚类物质的提取及抗氧化活性研究报道不多，余青［4-5］研究了乌饭叶多酚的提取及抗氧化活性，其研究结果表明乌饭叶多酚含量较高并具有一定的抗氧化活性。蔡凌云［6］等认为乌饭树叶的醇提物的抗氧化活性强于VC。本试验以广东本地野生乌饭树叶为原料，对超声波辅助提取乌饭树叶多酚的工艺进行了优化，并进一步研究乌饭树叶多酚的体外抗氧化活性，以期为乌饭树叶资源的开发利用，同时，也为开发天然的抗氧化剂提供一定的理论参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

乌饭树叶：8月份采集于广东韶关南雄市全安镇，在55℃下烘干，粉碎，过35目筛备用。

没食子酸：百灵威科技有限公司；1，1-苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：日本东京化成工业株式会社；乙醇、钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、磷酸、无水碳酸钠、浓盐酸、过氧化氢、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、抗坏血酸（VC）等均为分析纯。

1.2仪器设备

FW177中草药粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；B61-Version型超声波清洗仪：英国Jencons-pls公司；Ultrospec 2000紫外可见光分光光度计：Amersham Pharmacia Biotech公司；BP221S电子分析天平：德国Sartorius公司；HH-S28S恒温水浴锅：金坛市大地自动化仪器厂。

1.3方法

1.3.1标准曲线的制备

采用Folin-Ciocalteu比色法［7］。精密称取10.0 mg没食子酸标准品，加蒸馏水适量，超声溶解，放冷，用蒸馏水定容至100 mL，摇匀，即得0.1 mg/mL的没食子酸标准品溶液。精密量取上述标准品溶液0、2、4、6、8、10 mL，分别置于10 mL容量瓶中，各加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，得到一系列不同浓度的标准品溶液。精密量取不同浓度的标准品溶液各1 mL，分别置10 mL容量瓶中，加蒸馏水3 mL，再加0.5 mL福林试剂，充分摇匀，加入0.75 mL 20%碳酸钠溶液，混匀，以蒸馏水定容至刻度。在40℃下水浴40 min，在760 nm处测定吸光度值，以标准品溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：y=108.77x+0.002 1，R=0.999 3，x指标准品的浓度，y指吸光度。

1.3.2乌饭树叶多酚的的超声波辅助提取及多酚含量的测定

准确称取乌饭树叶粉末2.0 g置于锥形瓶中，按预设的液料比加入预设浓度的乙醇溶液，充分混合后，置于预设的提取条件下进行超声浸提，浸提结束后，真空抽滤，收集滤液，并用蒸馏水定容于50 mL容量瓶中，即得乌饭树叶多酚提取液。精密量取1 mL提取液定容至50 mL，再精密量取l mL置10 mL容量瓶中，按照1.3.1节方法测定提取液的吸光度，将所测得的吸光度代入上述回归方程求得其多酚质量浓度，然后再按下面公式（1）计算多酚提取量：

式中：C为提取液多酚质量浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；f为稀释倍数；m为用于提取的乌饭树叶粉末质量，g。

1.3.3超声辅助法提取乌饭树叶多酚的单因素试验和正交试验

分别以乙醇浓度（30%、40%、50%、60%、70%）、超声温度（25、35、45、55、65℃）、超声时间（10、20、30、40、50 min）、料液比［1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）］为影响因素，设置4个因素的不同水平，以确定相关因素对提取液中多酚含量的影响。

在单因素试验的基础上，以超声温度、超声时间、液料比作为考察的3个因素，每因素设3个水平，进行L9（34）正交试验来优化提取条件。试验因素与水平设计见表1。

表1　正交试验因素及水平Table 1Factors and levels for orthogonal experiment

1.3.4乌饭树叶多酚粗提物抗氧化活性的测定

称取乌饭树叶粉末样品30.0 g，按1.3.3中正交试验获得的最佳提取工艺进行提取，提取液减压浓缩后，置真空干燥箱减压干燥获得乌饭树叶多酚粗提物。将该粗提物配制成不同质量浓度样品溶液，以VC作为阳性对照，分别进行总还原力和DPPH自由基清除能力的测定。

1.3.4.1还原力的测定

取1 mL不同质量浓度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/ mL）的样品溶液，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L pH6.6磷酸缓冲溶液和2.5 mL 1%铁氰化钾（K3Fe（CN）6）溶液，混匀后于50℃水浴中保温20 min，迅速冷却至室温，再加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，以4 000 r/min离心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸馏水、0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，混合均匀，静置10 min后于700 nm波长处测吸光度。以VC（0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/mL）为阳性对照。

1.3.4.2DPPH自由基清除率的测定

精密量取2 mL不同质量浓度（2、4、6、8、10、12 μg/ mL）的样品溶液于10 mL试管中，加入2 mL浓度为1× 10-4mol/L的DPPH溶液，混匀，室温避光放置30 min后，于波长517 nm处测定吸光度为Ai；另取2 mL不同质量浓度的样品溶液与2 mL 95%乙醇混匀后测定吸光度为Aj；量取2 mL DPPH溶液加入2 mL 50%乙醇混匀后测定吸光度为A0。用同样浓度系列的VC溶液作阳性对照。根据下面公式（2）计算DPPH自由基清除率。

2　结果与分析

2.1超声波辅助提取乌饭树叶多酚的单因素试验

2.1.1乙醇浓度对乌饭树叶多酚提取量的影响

设定料液比1∶20（g/mL）、超声温度45℃、超声时间30 min、提取次数1次，研究乙醇浓度对乌饭树叶多酚提取量的影响，结果见图1。

图1　乙醇浓度对多酚提取量的影响Fig.1Effect of alcohol concentration on the extraction yield of polyphenols

由图1可知，随着乙醇浓度的增加，乌饭树叶多酚提取量呈先增加后减少的趋势，乙醇浓度在50%时多酚的提取量达到最大。这可能是由于50%乙醇溶液的极性与乌饭树叶中多酚类物质的极性最相近，此时多酚的溶解度最高，有利于多酚的提取。因此在后续试验中，以50%乙醇溶液来提取乌饭树叶多酚。

2.1.2超声温度对乌饭树叶多酚提取量的影响

设定乙醇浓度50%、料液比1∶20（g/mL）、超声时间30 min、提取次数1次，研究超声温度对乌饭树叶多酚提取量的影响，结果见图2。

图2　超声温度对多酚提取量的影响Fig.2Effect of ultrasonic temperature on the extraction yield of polyphenols

由图2可知，当温度较低时，乌饭树叶多酚的提取量较低，随着温度的不断升高，多酚的提取量不断增加，当达到55℃时，提取量达最大值，继续升温，多酚提取量的变化不明显。所以超声温度选择55℃左右为宜。

2.1.3超声时间对乌饭树叶多酚提取量的影响

设定乙醇浓度50%、料液比1∶20（g/mL）、超声温度45℃、提取次数1次，研究超声时间对乌饭树叶多酚提取量的影响，结果见图3。

图3　超声时间对多酚提取量的影响Fig.3Effect of ultrasonic time on the extraction yield of polyphenols

从图3可见，在10 min～40 min范围内，随着超声提取时间的延长乌饭树叶多酚提取量不断增加，超过40 min后，多酚提取量反而呈下降趋势。说明在提取40 min时，提取液内多酚溶解已经达到平衡，继续增加提取时间，由于受氧化和其他杂质的干扰，导致提取量下降。因此超声时间控制在40 min较为合适。

2.1.4料液比对乌饭树叶多酚提取量的影响

设定乙醇浓度50%、超声温度45℃、超声30 min，提取次数1次，研究料液比对乌饭树叶多酚提取量的影响，结果见图4。

图4　料液比对多酚提取量的影响Fig.4Effect of solid to liquid ratio on the extraction yield of polyphenols

由图4可知，当料液比较低时，乌饭树叶多酚的提取量较低，随着料液比的不断增大，多酚提取量不断增加，当料液比达到1∶20时，即可达到较高的多酚提取量，继续提高溶剂用量，多酚提取量增加并不明显，且会增加后续的分离回收工作量，因此从经济成本上考虑，较适宜的料液比为1∶20（g/mL）。

2.2超声波辅助提取乌饭树叶多酚的正交试验结果

乌饭树叶多酚超声波辅助提取的正交试验结果见表2。

表2　正交试验设计与结果Table 2Design and results for orthogonal experiment

根据单因素试验结果，选定50%乙醇溶液作为提取溶剂，由表2正交试验结果分析可知，最佳提取工艺组合为A3B2C3，即超声温度75℃、超声时间40 min、料液比1∶30（g/mL）。由极差分析可知，各因素对乌饭树叶多酚提取量影响大小为料液比＞超声时间＞超声温度。在正交试验设计的9个试验中没有最佳提取工艺组合A3B2C3，按照此最佳提取工艺进行3次平行验证试验，结果乌饭树叶多酚的平均提取量为71.01 mg/g，表明该最佳提取工艺稳定、可靠。

2.3乌饭树叶多酚的抗氧化能力

2.3.1乌饭树叶多酚的还原力

乌饭树叶多酚还原力测定结果见图5。

图5　乌饭树叶多酚的还原力Fig.5Reducing power of polyphenols extracted from Vaccinium bracteatum Thunb leaves

还原力是评价物质抗氧化活性的一个重要指标，一般而言，还原力的强弱与抗氧化能力的大小呈正比。根据1.3.4.1中的方法，若样品在700 nm波长处的吸光度越大，其还原力则越强。因此通过测定样液的还原力来反映物质的抗氧化活性。由图5可知，随着乌饭树叶多酚浓度的增加，吸光度不断增大，也即表明其还原力不断增强。与阳性对照VC相比，在试验质量浓度范围内，乌饭树叶多酚的还原力低于同浓度的VC。当浓度为0.25 mg/mL时，其还原力是VC的52.2%。这说明乌饭树叶多酚粗提液具有一定的还原能力。

2.3.2乌饭树叶多酚对DPPH自由基的清除能力

乌饭树叶多酚对DPPH自由基的清除能力见图6。

图6　乌饭树叶多酚对DPPH自由基的清除作用Fig.6DPPH free radical scavenging effects of polyphenols extracted from Vaccinium bracteatum Thunb leaves

由图6可知，乌饭树叶多酚粗提物对DPPH自由基具有较好的清除作用，随着浓度的增加，其对DPPH自由基的清除能力逐渐增强，说明乌饭树叶多酚粗提物对DPPH自由基的清除能力与其浓度存在着一定的量效关系。与阳性对照VC相比，乌饭树叶多酚粗提物对DPPH自由基的清除能力稍低于同质量浓度的VC，在最大试验质量浓度（12 μg/mL）时，VC对DPPH自由基的清除率为57.53%，而乌饭树叶多酚粗提物的清除率为45.8%，即乌饭树叶多酚粗提物对DPPH自由基的清除率是VC的80%，表明乌饭树叶多酚粗提物对DPPH自由基具有较好的清除能力。

3　结论

本研究得到了乌饭树叶多酚超声波辅助提取的最佳工艺：超声温度75℃、超声时间40 min，料液比1∶30（g/mL），在此条件下乌饭树叶多酚提取量为71.01 mg/g。极差分析表明，料液比这一因素对多酚提取量的影响较大。体外抗氧化试验表明，乌饭树叶多酚粗提物具有一定的抗氧化能力，且呈现良好的剂量-效应关系，与同浓度的VC相比，其还原力是VC的 52.2%，对DPPH自由基的清除率是VC的80%。由于本试验样品为乌饭树叶多酚粗提物，如果进一步对多酚粗提物进行纯化，提高多酚物质的纯度，其抗氧化活性会得到加强。因此乌饭树叶多酚是潜在的天然抗氧化剂资源，具有较高的研究开发价值。

［1］陈重明，张宁，王鸣.乌饭树的民族植物学［J］.植物资源与环境，1998，7（1）：45-48

［2］尹志娜.植物多酚分离提取方法和生物功能研究进展［J］.生命科学仪器，2010，8（6）：43-49

［3］刘运荣，胡健华.植物多酚的研究进展［J］.武汉工业学院学报，2005，24（4）：63-65

［4］余清.乌饭叶多酚提取工艺的研究［J］.福建轻纺，2011（6）：27-31

［5］余清.乌饭叶多酚提取物抗氧化能力初探［J］.食品研究与开发，2012，33（3）：10-11

［6］蔡凌云，石敏，夏薛梅，等.乌饭树叶醇提物体外抗氧化活性［J］.食品科技，2011，36（6）：222-225

［7］周媛，喻玲玲，李新兰，等.苎麻叶中总多酚的含量测定［J］.食品科技，2009，34（4）：193-197

Ultrasonic-assisted Extraction and Antioxidant Activity of Polyphenols from Vaccinium bracteatum Thunb Leaves

CHEN Rui-jiao
（Yingdong College of Biological Sciences，Shaoguan University，Shaoguan 512005，Guangdong，China）

The purpose of this study was to investigate the optimum ultrasonic-assisted extraction process and antioxidant activity of polyphenols from Vaccinium bracteatum Thunb leaves.The results showed that the optimum conditions for ultrasonic-assisted extraction were determined，such as ultrasonic temperature for 75℃，ultrasonic time for 40 min，solid to liquid ratio for 1∶30（g/mL）.Under these conditions，the maximum yield of polyphenols was 71.01 mg/g.Crude extract of polyphenols from vaccinium bracteatum Thunb leaves had certain reducing power and good scavenging ability to DPPH free radical.Reducing power and scavenging ability to DPPH free radical were in apparent dose-effect relationship with the concentration of the sample.

Vaccinium bracteatum Thunb leaves；polyphenols；ultrasonic-assisted extraction；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.015

陈瑞娇（1968—），女（汉），副教授，硕士，研究方向：食品生物技术。

2015-12-14