马尾松松针提取物对根面牙本质脱矿影响的体外研究

唐成芳阮建平朱勇李子夏左艳萍徐红艳

1.西安医学院口腔医学系，西安 710021；2.西安交通大学口腔医院预防科，西安 710004；3.陕西省人民医院口腔科，西安 710076

马尾松松针提取物对根面牙本质脱矿影响的体外研究

唐成芳1阮建平2朱勇1李子夏1左艳萍1徐红艳3

1.西安医学院口腔医学系，西安 710021；2.西安交通大学口腔医院预防科，西安 710004；3.陕西省人民医院口腔科，西安 710076

目的 评价马尾松松针提取物（PMNE）抑制根面牙本质脱矿的效果。方法 将根面牙本质块根据pH循环中所用实验溶液随机分为去离子蒸馏水（DDW）组，氟化钠（NaF）组，4%、8%和12%PMNE组，试件进行为期8 d的pH循环。显微CT选区测定各组未脱矿牙本质和脱矿牙本质的牙本质矿物密度（DMD）及两者DMD差值（ΔDMD），扫描电镜下观察pH循环后牙本质表面形貌。结果 PMNE各组和NaF组ΔDMD均显著低于DDW组（P<0.05），且8% PMNE组和12%PMNE组ΔDMD组间差异无统计学意义（P>0.05），均显著低于4%PMNE组，高于NaF组（P<0.05）。扫描电镜见PMNE组牙本质小管不全暴露，小管开口程度明显小于DDW组，大于NaF组。结论 PMNE可抑制根面牙本质脱矿，减缓酸对DMD的降低，具有一定的抗龋活性。8%PMNE即可达到较好抑制脱矿的效果。

马尾松松针提取物； 根面龋； 牙本质； 脱矿； 矿物密度

根面龋是发生在牙颈部涉及牙骨质、牙本质的特殊龋坏。老年人因牙龈退缩以及牙颈部薄弱部位暴露，更易发生根面龋[1-2]。据第3次全国口腔健康流行病学调查报告，全国65～74岁老年人患龋率为98.4%，根龋患病率为63.6%，根面龋是老年人牙齿缺失的主要因素之一，严重危害着老年人的口腔健康[1,3]。因而，采用合理、安全有效的措施防治根面龋的发生和发展是非常必要的。研究[4-5]证实龋病的发生发展是牙体组织在细菌产酸作用下，发生的矿物质溶出和有机物的崩解。因而，控制菌斑，增强矿物牙体组织抵抗酸/耐脱矿能力，促进脱矿组织再矿化被认为是“应用微创理念”防治老年龋进展的重要措施[5-6]。

松针，又称松叶松毛，是松科松属植物的叶，性温味苦，自古记载其具有补益人体、祛风止痛、活血化淤、固齿驻颜等功效。研究证实松针提取物有抑菌/抗菌、抗衰老、抗肿瘤等多种生物学活性[7-9]，也被用于牙膏的研制[10]。本实验采用显微CT（micro computer tomography, Micro-CT）和场发射扫描电镜（field emission scanning electron microscopy，FESEM）分析了我国广泛分布的马尾松松针提取物（Pinus massoniana needle extract，PMNE）对根面牙本质抗酸/抑制脱矿能力的影响，探索PMNE抑制根面龋的潜能。

1 材料和方法

1.1 实验材料和器械

10∶1 PMNE（西安奥赛生物技术有限公司），氟化钠（NaF，分析纯）、磷酸二氢钾（KH2PO4，分析纯）、乙酸（CH3COOH，分析纯）（西安化学试剂厂），羟乙基哌嗪乙磺酸（Sigma公司，美国），抗酸指甲油（Revlon公司，美国）。

采用去离子蒸馏水（distilled deionized water，DDW）为溶剂配制如下溶液。4%、8%和12%PMNE溶液：将PMNE加入DDW中配制质量体积百分浓度为12%的澄明溶液，DDW稀释方式配制4%和8%的PMNE溶液，备用；用DDW溶解适量NaF配制成0.1% 的NaF溶液；中性缓冲液：20 mmol·L-1羟乙基哌嗪乙磺酸，1.5 mmol·L-1KH2PO4，pH为7.0[11]；酸性缓冲液：50 mmol·L-1CH3COOH，1.5 mmol·L-1KH2PO4，pH为5.0[11]。

慢速切割机（UNIPOL-830，沈阳科晶有限公司），恒温水浴箱（上海医疗器械厂），维氏显微硬度计（HXD-1000TM，上海泰明光学仪器有限公司），FE-SEM（FESEM S-4800，Hitachi公司，日本），Micro-CT（Explore Locus SP，通用医疗公司，美国），电感耦合等离子质谱仪（热电有限公司，美国）。

1.2 样本制备

取颈部平坦且完整无龋坏的新近拔除第三磨牙35颗，用慢速切割机在流水降温下去除冠方牙体组织，制备3 mm×4 mm×2 mm的根面牙体组织块。在流水降温下用2 000目碳化硅砂纸打磨牙体表面至牙本质层，并使牙本质表面光滑平整。按照文献[12]的方法，用显微硬度计挑选出牙本质表面硬度在35～50维氏硬度值之间的试件50个。在牙本质的光滑表面一端预留3 mm×2 mm大小的开窗区，其余部位均匀涂布抗酸指甲油，干透后涂布第二层。

1.3 实验分组及pH循环

按照所用实验溶液不同，将50个试件随机分为5组，分别为DDW、NaF、4%PMNE、8%PMNE和12%PMNE组，每组10个试件，其中DDW组和NaF组分别作为阴性和阳性对照组。

各组试件分别于37 ℃的恒温水浴箱中进行pH循环：2 mL4%PMNE、8%PMNE、12%PMNE溶液、DDW或0.1%NaF等实验溶液浸泡10 min，2 mL酸性缓冲液1 h，2 mL中性缓冲液缓冲5 min。每次浸泡后用DDW彻底冲洗1 min，滤纸吸去多余水分，其余时间各试件放入37 ℃中性缓冲液中，每天缓冲3次，共8 d。各实验液及中性缓冲液每日更换1次。

1.4 牙本质矿物密度（dentin mineral density，DMD）的测定

循环结束后DDW彻底冲洗，室温下用3%戊二醛溶液与0.1 mol·L-1PBS缓冲液（1∶1，pH=7.2）固定4 h，去除牙本质表面涂布的指甲油，DDW彻底冲洗。将试件置于Micro-CT中在80 kV、80 μA、14 μm层厚条件下进行扫描，三维重建。测定每个标本未脱矿侧约0.996 0 mm×0.996 0 mm大小面积（图1A中黄色区域），且自牙本质表面向内深0.220 4 mm的长方体形区域内（即0.996 0 mm×0.996 0 mm×0.220 4 mm选区，图1B中黄色所示区域）的DMD，作为该样本未脱矿牙本质的矿物密度（normal dentin mineral density，NDMD），每个标本测定4个区域，计算平均值。具体测定方法见图1。

按照未脱矿侧DMD同样测定的方法，将未脱矿侧分析选区框水平平移至同一牙本质块脱矿侧的对称位置，测定同样大小选区内的DMD，即作为pH循环后脱矿牙本质的矿物密度（demineralized dentin mineral density，DDMD），每个标本测定4个区域，求平均值。按照如下公式计算牙本质块NDMD与DDMD的差值（ΔDMD），ΔDMD=NDMD-DDMD。

1.5 表面微观形貌观察

试件经Micro-CT扫描完成后即刻用DDW冲洗，自然干燥，喷金，FE-SEM电镜观察各组脱矿侧牙本质表面微观形貌。

图 1 牙本质密度测定选区图Fig 1 Selected area analysis in determination of dentin density

1.6 PMNE中钙、钼和氟含量测定

取4%PMNE溶液稀释100倍，采用电感耦合等离子体质谱仪，测PMNE中钙、钼和氟元素的含量，共测定5个样。每个样品测定3次，求平均值。

1.7 统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件对NDMD、DDMD及ΔDMD进行单因素方差分析，采用组间LSD两两比较，检验水准为0.05。

2 结果

2.1 DMD测量结果

各组NDMD、DDMD和ΔDMD测量结果见表1。

表 1 各组NDMD、DDMD和ΔDMD的比较Tab 1 The comparison of NDMD， DDMD and ΔDMD in each groups mg·cm-3， n=10

表 1 各组NDMD、DDMD和ΔDMD的比较Tab 1 The comparison of NDMD， DDMD and ΔDMD in each groups mg·cm-3， n=10

注：不同小写字母代表NDMD、DDMD和ΔDMD等指标组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。

由表1可见，各组NDMD间差异无统计学意义（P>0.05）。DDW组DDMD最低，NaF组DDMD最高，两组间DDMD差异有统计学意义（P<0.05）；4%PMNE组DDMD明显高于DDW组，显著低于8%、12%PMNE组和NaF组（P<0.05）；8%PMNE组和12%PMNE组比较差异无统计学意义（P>0.05），均略低于NaF组，但差异无统计学意义（P>0.05）。DDW组ΔDMD最高，NaF组△DMD最低，两组间差异有统计学意义（P<0.05）；PMNE各组ΔDMD显著高于NaF组，显著低于DDW（P<0.05）；8%PMNE 组ΔDMD略低于12%PMNE组，但两组间差异无统计学意义（P>0.05），两者均显著低于4%PMNE组（P<0.05）。

2.2 表面微观形貌观察结果

各组pH循环后脱矿牙本质表面微观形貌见图2。由图2可见，DDW组牙本质表面牙本质小管完全暴露，小管开口呈圆形或类圆形，牙本质表面欠平整，未见明显胶原纤维，牙本质小管壁较疏松，可见胶原纤维。NaF组牙本质表面的玷污层完整，未见牙本质小管暴露，表面仅见3～5 μm长度的狭小微裂隙。低倍镜下各浓度PMNE组牙本质表面的玷污层完整性受到不同程度破坏，牙本质小管口部分堵塞，呈不同程度的点隙状开口；4%PMNE组牙本质表面点隙最大，分布最密集。高倍镜下见4%PMNE组牙本质表面牙本质小管口暴露不全，裂隙呈3～5 μm线状和多角形不规则开口，但牙本质小管开口程度较DDW组明显减小；8%和12%PMNE组牙本质表面的部分牙本质小管被堵塞，部分牙本质小管口不全暴露，呈3～5 μm长的梭形/小的不规则形开口，两组牙本质表面的点隙状开口基本相当，点隙大小和密集程度明显小于4%PMNE组。

2.3 PMNE中钙、钼和氟含量

本样品中钙元素含量为（12.46±0.23） μg·mg-1，钼元素含量为（3.31±0.12） μg·mg-1。本样品不含氟元素。

图 2 各组牙本质表面微观形貌 FE-SEMFig 2 Micro morphology of dentin surface in every group FE-SEM

3 讨论

口腔中的致病菌可利用食物产酸致使釉质、牙本质等牙体硬组织发生脱矿，继而脱矿裸露的胶原纤维等有机基质在酶和唾液环境中降解，导致龋病发生发展[4-5]。本实验在pH循环模式下，以NaF作为对照观察富含黄酮类化合物的PMNE抑制根面牙本质脱矿的作用，并分析PMNE浓度效应，为预防根面龋的发生及抑制其进展提供实验依据。此外，为避免缓冲液对实验结果的干扰，本实验pH循环所用的酸性和中性缓冲液均不含钙离子。

Micro-CT是采用X线成像原理进行超高分辨率三维成像的设备，可在不破坏样本的情况下，定量计算样品内部任意选定区域的体积、面积、孔隙率、矿物密度等[13]。矿物密度是根据体模和标准CT值计算得到并以单位体积的羟磷灰石含量来表示的矿物质含量，可反映单位组织内矿物质的含量[14]。牙本质等牙体组织是以无机物为主的硬组织，具有X线阻射，因而Micro-CT也被用于测定牙体组织的矿物含量和龋病动态过程及疗效观察[15]。本研究采用Micro-CT定量对比分析各组根面牙本质脱矿区、正常未脱矿等大选区内矿物密度值和两者矿物密度差，以评价PMNE抑制酸所致牙本质脱矿的效果。结果表明，NaF和PMNE均可有效抑制根面牙本质脱矿的进展。

由于能够促进牙体组织矿化和减弱酸对牙体组织的脱矿，故氟化物干预是当前减轻龋病进展的有效措施。本实验Micro-CT也证实NaF组牙本质脱矿区与未脱矿区的ΔDMD显著低于DDW组，提示0.1% NaF能有效地减弱酸对根面牙本质的脱矿作用。FESEM见NaF组牙本质表面玷污层完整而DDW组玷污层完全破坏，进一步证实了氟化物提高牙本质耐脱矿或抑制脱矿的能力。研究[12]表明，氟化物在牙本质/釉质表面可与钙离子或羟磷灰石结合形成氟化钙或氟磷灰石，增强根面牙本质抗酸蚀脱矿能力，促进再矿化。

本实验也证实PMNE可抑制酸所致牙本质脱矿，其机制推测主要可能与PMNE保存脱矿牙本质有机基质有关。牙本质是含有约30%有机基质的钙化硬组织，已有研究[16]表明保留脱矿牙本质内的有机基质可为再矿化提供支架，并形成一个机械屏障从而阻止酸的扩散和矿物离子释出。PMNE是从马尾松叶中提取的天然物质，其主要分子结构具有多个酚羟基的原花青素、黄酮类等生物活性成分[8-9]。原花青素、五倍子等含多酚结构的物质可通过共价键、离子键、氢键等与蛋白质反应，增加交联度，增强胶原基质，使非胶原蛋白凝固，抑制金属基质蛋白酶活性，减轻脱矿牙本质的降解[8,11-12,16]。据此推测，PMNE抑制根面牙本质脱矿的可能机制是PMNE通过原花青素、黄酮类等有效成分的多酚结构与胶原基质的相互作用，增强了胶原基质的交联，抑制其降解，从而保存了脱矿牙本质有机基质并形成屏障。该屏障可一定程度阻碍pH循环过程中的H+扩散从而减轻脱矿。另外，由于原花青素的交联作用以及其B环上酚羟基的螯合作用[8,12]，交联于脱矿牙本质胶原基质的原花青素还可以通过B环上酚羟基螯合因脱矿释出的部分钙离子，从而阻碍钙离子释出。因而，虽经pH循环，PMNE组牙本质玷污层未完全被酸去除，表现为牙本质小管仍部分堵塞，而阴性对照DDW组玷污层完全被去掉，牙本质小管完全暴露，且PMNE组ΔDMD显著低于DDW组。

此外，PMNE抑制根面组织脱矿的作用可能还与PMNE中含有的钙元素和钼元素相关。松针提取物中还含有钙、磷、钼等多种元素。本研究采用质谱仪也证实本实验所用PMNE中含有（3.31±0.12） μg·mg-1钼元素，（12.46±0.23） μg·mg-1钙元素。据此推测，一方面PMNE溶液中所含钙可沉积在脱矿牙本质表面，能促进表面的残余羟磷灰晶体生长；另一方面PMNE处理后，其内钼元素沉积于脱矿牙体表面，还可能增加牙本质抵抗pH循环中酸的侵蚀。据报道，增加摄入钼元素可增强牙齿的硬度和牢固度，预防龋齿，还可提高氟再矿化表层下釉质的功效。然而钼元素是如何发挥作用的机制还有待进一步研究。

本实验中8%PMNE组和12%PMNE组抑制牙本质脱矿效果优于4%PMNE。结果提示，8%PMNE即可达到良好的抑制牙本质脱矿的效果。结果可能与单位体积高浓度PMNE溶液中多酚含量、钼元素等有效成分相对较多有关，到8%浓度时PMNE即含有能与脱矿牙本质反应的最适量有效成分。然而，PMNE是混合物，其有效成分除原花青素和钼元素外，是否还有其他抑制牙本质脱矿的成分还有待进一步研究。

[1] Gregory D, Hyde S. Root caries in older adults[J]. J Calif Dent Assoc, 2015, 43(8):439-445.

[2] Bignozzi I, Crea A, Capri D, et al. Root caries: a periodontal perspective[J]. J Periodont Res, 2014, 49(2):143-163.

[3] 齐小秋. 第三次全国口腔健康流行病学调查报告[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2008:92-111.

Qi XQ. The third national oral health epidemiological survey[M]. Beijing: People’s Medical Publishing House, 2008: 92-111.

[4] Zambon JJ, Kasprzak SA. The microbiology and histopathology of human root caries[J]. Am J Dent, 1995, 8(6):323-328.

[5] Chalmers JM. Minimal intervention dentistry: part 1. Strategies for addressing the new caries challenge in older patients[J]. J Can Dent Assoc, 2006, 72(5):427-433.

[6] 储冰峰, 张鹰, 刘洪臣. 应用微创理念构建老年龋病防治方案（一）[J]. 华西口腔医学杂志, 2009, 27(6):583-587.

Chu BF, Zhang Y, Liu HC. Minimal intervention dentistry: a vision of caries management for older patients.Ⅰ[J]. West Chin J Stomatol, 2009, 27(6):583-587.

[7] Zeng WC, Zhang Z, Jia LR. Antioxidant activity and characterization of antioxidant polysaccharides from pine needle (Cedrus deodara)[J]. Carbohydr Polym, 2014, 108:58-64.

[8] Wang C, He L, Yan M, et al. Effects of polyprenols from pine needles of Pinus massoniana on ameliorating cognitive impairment in a D-galactose-induced mouse model[J]. Age (Dordr), 2014, 36(4):9676.

[9] Karapandzova M, Stefkov G, Cvetkovikj I, et al. Flavonoids and other phenolic compounds in needles of Pinus peuce and other pine species from the Macedonian Flora[J]. Nat Prod Commun, 2015, 10(6):987-990.

[10] 徐春生. 天然松针提取物在牙膏中的应用[J]. 牙膏工业, 2006(2):23-25.

Xu CS. The application of natural pine needle extract in tooth paste[J]. Toothpaste Industry, 2006(2):23-25.

[11] Huang X, Cheng L, Exterkate RA, et al. Effect of pH on Galla chinensis extract’s stability and anti-caries properties in vitro[J]. Arch Oral Biol, 2012, 57(8):1093-1099.

[12] Tang CF, Fang M, Liu RR, et al. The role of grape seed extract in the remineralization of demineralized dentine: micromorphological and physical analyses[J]. Arch Oral Biol, 2013, 58(12):1769-1776.

[13] Clark DP, Badea CT. Micro-CT of rodents: state-of-the-art and future perspectives[J]. Phys Med, 2014, 30(6):619-634.

[14] Zou W, Hunter N, Swain MV. Application of polychromatic µCT for mineral density determination[J]. J Dent Res, 2011, 90(1):18-30.

[15] 张舫, 吴红崑. 微焦点计算机断层扫描在龋病研究中的应用[J]. 国际口腔医学杂志, 2000, 37(2):196-202.

Zhang F, Wu HK. Application of Micro-computed tomography in caries reaserch[J]. Int J Oral Sci, 2000, 37(2):196-202.

[16] Pavan S, Xie Q, Hara AT, et al. Biomimetic approach for root caries prevention using a proanthocyanidin-rich agent [J]. Caries Res, 2011, 45(5):443-447.

（本文编辑 杜冰）

Effect of Pinus massoniana needle extract on root dentin demineralization in vitro

Tang Chengfang1, Ruan Jianping2, Zhu Yong1, Li Zixia1, Zuo Yanping1, Xu Hongyan3.
(1. Dept. of Stomatology, Xi’an Medical University, Xi’an 710021, China; 2. Dept. of Preventive, School of Stomatology, Xi’an Jiao Tong University, Xi’an 710004, China; 3. Dept. of Stomatology, Shanxi Provincal People’s Hospital, Xi’an 710076, China)

Supported by: Tackling Project of Scientific and Technological Social Development from Science and Technology Department of Shanxi Province(2015SF242); Scientific Research Project from Education Department of Shanxi Province (15JK1625); Doctor Start Fund Project from Xi’an Medical University (2015DOC20); Key Discipline from Xi’an Medical University. Correspondence: Tang Chengfang, E-mail: tangchengfang@sohu.com.

Objective This study aims to evaluate the effects of Pinus massoniana needle extract (PMNE) on inhibiting demineralization of root dentin. Methods Root dentin blocks were randomly divided into distilled deionized water (DDW) group, fluoride sodium (NaF) group, and 4%, 8% and 12% PMNE groups according to the experimental solution used in the process of pH cycling in each group. All specimens in each group experienced pH cycling for 8 d. The dentin mineral density （DMD） of the normal dentin and demineralized dentin and their D-value （ΔDMD） were determined using micro computed tomography. The morphology of dentin surface after pH cycling was also observed using a scanning electron microscope. Results The ΔDMD values in all PMNE groups and the NaF group were considerably lower than the ΔDMD in the DDW group (P＜0.05）. The ΔDMD values of the 8% and 12% PMNE groups had no difference （P>0.05), both of which were lower than the ΔDMD in the 4% PMNE group and higher than that in the NaF group （P<0.05). The dentin tubules were partly opened in the PMNE groups. The opening degrees of the dentin tubule in PMNE groups were significantly less and smaller than the opening degree in the DDW group and were larger than that in the NaF group. Conclusion PMNE can inhibit the demineralization of root dentin and can slow down the reduction in DMD. PMNE has the potential to prevent caries, and 8% PMNE can effectively inhibit dentin demineralization.

Pinus massoniana needle extract; root caries; dentin; demineralization; mineral density

R 781.1

A [doi] 10.7518/hxkq.2016.05.018

2016-03-15；

2016-06-22

陕西省科技厅社会发展项目（2015SF242）；陕西省教育厅科研课题（15JK1625）；西安医学院博士启动基金（2015DOC-20）；西安医学院重点学科资助

唐成芳，副教授，博士，E-mail：tangchengfang@sohu.com

唐成芳，副教授，博士，E-mail：tangchengfang@sohu.com