丹参多酚氧化酶基因的克隆及表达分析

时王珂，孙奕玥，舒志明，张跃进，梁宗锁，郭宏波

(旱区作物逆境生物学国家重点实验室，中药指纹图谱与天然产物国家地方联合工程研究中心，西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨陵 712100)



丹参多酚氧化酶基因的克隆及表达分析

时王珂，孙奕玥，舒志明，张跃进，梁宗锁，郭宏波*

(旱区作物逆境生物学国家重点实验室，中药指纹图谱与天然产物国家地方联合工程研究中心，西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨陵 712100)

前期研究发现多酚氧化酶(PPO)能正向调控丹酚酸B合成，该研究运用RACE技术，从丹参毛状根中克隆到多酚氧化酶基因(SmPPO，GenBank登录号为KF712274)全长序列，其cDNA全长1 930 bp，开放阅读框为1 770 bp，编码589个氨基酸。将SmPPO与管状花目其它4个物种进行氨基酸序列比对，在N端类囊体转移结构域中发现都存在2个N-豆蔻酰化位点。在丹参毛状根培养液中加入不同诱导因子，利用实时荧光定量PCR检测，发现该基因在酵母提取物处理中表达量显著上调，但在银离子、抗坏血酸和L-半胱氨酸处理中表达受到明显抑制。运用HPLC技术同步检测毛状根中丹酚酸B含量，显示出与基因表达相同的变化趋势。研究表明，丹参中多酚氧化酶基因(SmPPO)对丹酚酸B的合成具有正向调控作用。

丹参；多酚氧化酶；基因克隆；序列全长；基因表达

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是由核基因编码的含铜金属酶，广泛存在于植物、真菌和昆虫中。它们能氧化多酚类化合物生成不稳定的醌类物质，醌发生聚合并与氨基酸发生反应，生成黑色素或褐色素，导致果蔬褐变、营养品质和商品性下降。醌类物质具有毒性，并通过共价调节与氨基酸发生反应形成抗营养机制，是植物抵御病虫害的重要手段。而酚类化合物在抗氧化、缺血再灌注和抗血栓形成等方面具有显著药理学作用[1-2]。但有关PPO调控植物次生代谢物，特别是酚酸类物质合成的机理还未见报道。

丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)根茎是中国用量最大的中药材之一，在治疗心脑血管疾病和抗氧化等方面具有显著疗效。酚酸类物质是丹参水溶性有效成分的主要组分，丹酚酸B在丹参酚酸类物质中含量最高(80%左右)。丹参植物因具有基因组小、染色体数目少、组织培养和转基因技术成熟等优点，被认为是中药研究的理想模式植物[3]。因此研究其合成调控机理对深入理解酚酸类物质合成的次生代谢途径及药材质量控制具有重要意义。

尽管迄今未见PPO或其基因调控酚酸类物质合成的报道，但已有证据表明它们在一些相关过程中发挥了重要作用，如在活性氧调节[4]、抗逆信号分子响应[5-7]和苯丙烷次生代谢[8]方面。课题组前期已发现，作为活性氧的主要种类，H2O2能增强苯丙氨酸解氨酶(PAL)和酪氨酸氨基转移酶(TAT)活性，促进丹酚酸B积累[9-10]。在干旱胁迫下PPO基因的过表达会使番茄中多酚含量增加，同时产生高强度活性氧胁迫[11-12]，抗性番茄品系的总酚含量和PPO活性均比敏感品系高，在病虫害侵袭后，抗性番茄的PPO活性升高速率比敏感品系快[13]。这些结果表明，PPO基因在酚酸类物质的合成中发挥了重要作用。

前期课题组从莲藕(NelumbonuciferaGaertn.)地下茎茎尖中克隆出PPO基因全长序列[14]。本研究以丹参毛状根为试材，利用该基因在铜(Cu)结合区的保守性，运用RACE方法对其cDNA全长进行克隆；在丹参毛状根培养液中分别添加前期预试验确定的PPO活性增强剂(酵母提取物)和抑制剂(半胱氨酸、抗坏血酸和银离子)，运用实时荧光定量PCR技术检测该基因的表达，为进一步揭示丹酚酸B等酚酸类物质合成的次生代谢途径奠定坚实基础。

1　材料和方法

1.1丹参毛状根培养与诱导处理

1.1.1毛状根的获得以发状农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes，ATCC15834)侵染丹参叶片外植体，取0.3 g在250 mL摇瓶中加入50 mL不含激素的液体MS培养基。置于摇床中以110～120 r/min速度在25 ℃下培养3周[15]。培养液中加入诱导因子后再培养7 d，采集毛状根在液氮中速冻后保存于-80 ℃冰箱，用于PPO基因克隆和丹酚酸B含量检测。

1.1.2诱导处理实验室前期对3个已报道可抑制PPO活性的L-半胱氨酸、抗坏血酸和柠檬酸，以及可促进丹酚酸B积累的酵母提取物和促进丹参酮积累的Ag+等5个诱导因子，对丹参毛状根PPO活性的影响进行评估。结果发现除了柠檬酸抑制效果不显著，其余4个诱导因子作用均达到显著水平，因此在本研究中用于评估PPO基因表达。

精密称取50 g酵母提取物，溶于250 mL无菌水中，再加入1 L甲醇。把混合液置于4 ℃进行4 d沉淀后，将沉淀再次溶于250 mL无菌水中。在溶液中加入375 mL甲醇，4 ℃下再次沉淀。将沉淀再溶于200 mL无菌水中，在121 ℃灭菌30 min后保存于4 ℃备用。酵母提取物浓度以糖含量来衡量，以蔗糖浓度作对照，采用蒽酮比色法进行测定[16]。

将Ag+、L-半胱氨酸和抗坏血酸分别加入毛状根培养液中，最终体积摩尔浓度分别为30 μmol/L、0.5 mmol/L和0.5 mmol/L。其原液均用蒸馏水配制并通过0.22 μm滤膜过滤灭菌。每个处理重复3次，结果由平均值±标准差表示。

1.2PPO基因全长序列的克隆

1.2.1RNA提取与PCR扩增将以液氮速冻的毛状根研磨成粉末后，按照试剂盒RNAiso Plus(TaKaRa，日本)操作步骤提取RNA。RNA质量在核酸/蛋白测定仪上检测纯度，以1%凝胶电泳检测完整度。吸取2 μg RNA，采用RevertAid试剂盒(Thermo Scientific，美国)合成cDNA第一链。

采用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件，在已发表PPO基因的保守区设计并合成引物(表1)。25 μL总反应体系中含1 μL cDNA，12.5 μL 2×Taq Master Mix(TaKaRa，日本)，正向和反向引物各2 μL(表1中PPO1和PPO2)。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min，再94 ℃变性60 s，48 ℃退火90 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环，最后72 ℃延伸7 min。PCR扩增产物采用胶回收试剂盒(BioTeKe，北京)进行回收。回收产物与pMD18-T连接后转化大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞，转化后的大肠杆菌涂布于含有Amp的LB培养基上，于37 ℃培养过夜，挑取白色单克隆、阳性菌液送公司测序。

3′-RACE(快速扩增cDNA末端法)以PPO3和UPM为引物，根据Advantage 2 PCR试剂盒(Thermo Scientific，美国)指示进行操作。50 μL PCR反应体系中包含cDNA模板2.5 μL，50×Advantage 2混合酶液1 μL，UPM引物5 μL，PPO3引物1 μL，其余为无菌水。PCR反应程序为94 ℃变性30 s，72 ℃退火90 s，5个循环，再在94 ℃变性30 s,70 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s条件下5个循环；最后，94 ℃变性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，28个循环。5′-RACE以PPO4和UPM为引物，采用上述3′RACE方法进行扩增。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。对目的片段进行胶回收，回收方法及测序等方法同上。

1.2.2SmPPO基因序列分析及氨基酸序列比对采用NCBI中Blast程序对丹参毛状根SmPPO基因序列及推导氨基酸序列进行分析(http://balst.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。对核酸和氨基酸序列的开放阅读框采用ORF Finder(www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)预测。氨基酸功能结构域的分析在NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)上进行。

将包含丹参所在唇形科的管状花目中所有PPO基因的推导氨基酸序列进行比对。4个物种PPO基因分别来自芝麻SesamumindicumL.(GenBank登录号JQ658360)、甘薯Ipomoeabatatas(L.) Lam.(登录号AY822711)、马铃薯SolanumtuberosumL.(登录号U22921)、茄子叶绿体SolanummelongenaL. chloroplast(登录号GQ246219)和茄子SolanummelongenaL.(登录号GQ149349)。

表1　丹参中多酚氧化酶基因克隆及实时定量 PCR所用引物Table 1　Primers used in gene cloning of polyphenol oxidase and real-time PCR

1.2.3实时荧光定量PCR将丹参毛状根cDNA第一条链模板稀释10倍，作为实时荧光定量PCR模板。PCR反应采用ABI 7300实时定量PCR仪。在八连管中依次加入20 μL体系，即cDNA模板5 μL，上下游引物各1 μL，避光加入2×Q-PCR Mix containing SYBR Green II 10 μL，RNase-Free Water 3 μL。用PCR仪器所用的软件来校准荧光数据和检测Ct值。扩增丹参PPO基因所用的引物见表1。每个样品做3个生物学重复，每个生物学重复做2个技术重复。反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，共45个循环。从65 ℃到95 ℃进行融解曲线测定。当所有循环完成时，qPCR样品溶解曲线被统计和检测，以确定每个PCR产物已被扩增。用2-ΔΔCt法计算SmPPO基因表达量[17]。

1.2.4丹酚酸B含量检测丹酚酸B(salvianolic acid B，SAB)样品准备及其检测方法主要参照Yang等[18]，并作少许修改。将干燥毛状根研磨成粉末后，取40 mg，加入8 mL甲醇与水的混合样(70∶30，v/v)，超声45 min后过0.45 mm滤膜。在12 000 r/min条件下将滤液离心10 min。取上清，过0.45 μm滤膜，保留滤液待用。

SAB含量检测采用高效液相色谱法(HPLC)，在Waters 1525液相色谱检测系统(Milford，美国)上进行。运用Waters 2996光电二极管检测器进行检测，在SunFire C18柱(250×4.6 mm，5 μm)上梯度洗脱，柱温30 ℃。流动A相为乙腈，B相为0.01%磷酸溶液(pH 2.6)，流速1.0 mL/min，进行梯度洗脱：5%～20% A(V/V)线性梯度0～10 min；20%～25% A(V/V)线性梯度10～15 min；25% A(V/V)线性梯度15～20 min；25%～20% A(V/V)线性梯度20～25 min；20%～30% A(V/V)线性梯度25～28 min；30% A(V/V)线性梯度28～40 min；30%～100% A(V/V)线性梯度40～45 min。检测波长设定为288 nm，由丹酚酸B标准品(批号115939-25-8，中国药品生物制品检定所)确定其质量。定量分析每个处理重复6次，结果用平均值±标准差来表示。

2　结果与分析

2.1丹参多酚氧化酶基因(SmPPO)和推导氨基酸序列特征

2.1.1SmPPO基因序列以丹参毛状根为试材，运用PPO1和PPO2引物扩增出一条500 bp条带(图1,A)。测序结果发现，该片段与其它物种PPO基因序列高度同源，表明它是PPO基因片段。根据该基因片段序列，再设计特异引物PPO3，并与UPM引物一起进行3′-RACE扩增，扩增出一条1 200 bp片段(图1，B)。运用另一特异引物PPO4与UPM引物组合在5′-RACE中扩增出一条700 bp片段。经拼接，SmPPO基因cDNA全长1 930 bp，含开放阅读框1 770 bp(从19 bp至1 788 bp)，编码589个氨基酸。在阅读框5′和3′端分别发现18 bp和142 bp非翻译区。

1. 获得cDNA的1/10质量浓度为模板；2. cDNA原液为模板；3. 没有加模板的空白对照；4. 5′-RACE； 5. 3′-RACE；M. Marker图1　丹参毛状根中克隆的PPO基因片段1. 1/10 concentration of harvest cDNA as template; 2. Harvest cDNA as template; 3. Blank control without template; 4.5′-RACE fragment; 5.3′-RACE fragment; M. DNA markerFig.1　The SmPPO gene cloned from Salvia miltiorrhiza hairy root

2.1.2SmPPO氨基酸序列SmPPO蛋白属于酪氨酸超家族，有PPO1_DWL和PPO1_FKDV等2个结构域(图2)。并含有2个铜离子结合区(CuA和CuB)，均富含组氨酸残基。CuA结合区为176(组氨酸)～206(组氨酸)；CuB结合区为328(组氨酸)～362(组氨酸)(图4)。

2.2PPO蛋白序列比较

典型的植物PPO包含3个结构域：N-末端叶绿体转运肽(cTP)、CuA和CuB(酪氨酸酶)结构域以及C-末端伸展区(图3)。管状花目植物的6条PPO蛋白中，前35个氨基酸均含有大量丝氨酸残基，这正是cTP中基质肽段的典型特征。距该序列不远处就是类囊体转移结构域DRRxxxxxxGGLY(M)G(图4黑框部分)和丙氨酸模体(AxA)。有趣的是，在管状花目全部6个PPO蛋白的N端类囊体转移结构域中都发现有2个N-豆蔻酰化位点(图4黑框中的2条蓝线)。Cu结合位点特征是有较多保守组氨酸残基。在CuA结构域中，第一条序列起始于HCAYCN(D)GA(G)Y模体，并终止于LQV(I)HNSWLFFPFH模体。而在CuB结构域中，第一条序列起始于HxxV(I)HxxxGD(T)模体，终止于N(H)FYSAG(A)R(L)DP(I)L(V)FY(F)C(A)HH模体。PPO1_DWL结构域和PPO1_KFDV结构域组成了PPO的C-末端。在PPO1_DWL结构域中，酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点与DWL模体紧密结合(图4)。

图2　SmPPO编码的氨基酸序列保守结构与分析Fig.2　Conserved domain analysis of SmPPO encoding sequence

图3　管状花目植物的多酚氧化酶氨基酸的功能型结构域及保守模体示意图Fig.3　Schematic diagram of functional domains and conserved motifs in Tubiflorae plant PPO amino acid sequences

2.3丹参SmPPO基因表达与丹酚酸B含量检测

在丹参毛状根培养液中分别加入酵母提取物(YE)、Ag+、抗坏血酸(Vc)和L-半胱氨酸4种诱导因子进行处理，运用实时荧光定量PCR技术分别检测不同处理下SmPPO基因的表达，同步运用HPLC技术检测丹酚酸B含量。结果显示，PPO基因表达在酵母提取物中显著增强，但在其余3种诱导子处理中被显著抑制(图5，A)。丹酚酸B含量的变化与SmPPO基因表达趋势一致(图5，B)，说明SmPPO基因对丹酚酸B的合成具有正向调控作用。

图4　SmPPO基因推导的氨基酸序列Fig.4　SmPPO gene sequence and its putative amino acid sequence

CT.对照；YE.酵母提取物；Vc.抗坏血酸；L-cys.L-半胱氨酸；不同小写字母代表处理间显著性差异(P<0.05)图5　不同诱导处理下丹参毛状根SmPPO基因表达(A)及丹酚酸B含量(B)CT. Contral; YE. Yeast extralt; Vc. Ascorbic acid; L-cys. L-cysteine; Columns with different letters represent significant difference under different trentments (P<0.05)Fig.5　SmPPO gene expression (A) and its effect on the accumulation of salvianolic acid B (B) in S. miltiorrhiza hairy root under different elicitor treatments

3　讨　论

本研究首次报道了PPO基因调控丹酚酸B等酚酸类次生代谢物合成。除采用直接调控PPO活性的诱导因子外，不少信号分子如乙烯、茉莉酸、水杨酸和其它胁迫如干旱等也可诱导植株特定组织或某一发育阶段PPO基因表达[6]。在干旱胁迫下，PPO基因过表达使番茄中活性氧大量生成，总酚含量增加[4-5]。因此，推测以H2O2为代表的活性氧在PPO基因调控酚酸类物质的合成中扮演了重要角色。课题组前期已发现，由水杨酸诱导产生的H2O2增强了苯丙氨酸解氨酶(PAL)和酪氨酸氨基转移酶(TAT)的活性，促进了丹酚酸B的积累[9-10]。

课题组还发现，在细胞层面上，外施水杨酸可使钙离子向丹参细胞内流动[10]，刺激NAD(P)H氧化酶活性，促进胞外H2O2释放，造成高强度氧胁迫[19-20]，PAL基因表达和酶活性升高，造成迷迭香酸和丹酚酸B大量积累[10,21]。与被诱发的内源H2O2一样，外源H2O2也可增强PAL和TAT的活性，促进丹酚酸B的积累[9]。

在钙离子向胞内流动的同时，因K+/H+交换，内流的H+会导致细胞质酸化，外流K+使胞外介质碱化[22]。通过糖基化等蛋白修饰，细胞质酸化会提高PPO活性[23-24]。胞外介质碱化使PAL活性升高，并持续合成迷迭香酸[21]、丹酚酸B[9]、异黄酮苷类[25]、木质素[26]和植物抗毒素[22]等。

虽然Ag+已被证实可以提高红豆杉悬浮细胞中的紫杉醇含量[27]，曼陀罗毛状根中的生物碱含量[28]，以及丹参毛状根中的丹参酮含量[29]，但其调控酚类物质积累的作用不清楚。本研究发现Ag+显著抑制了PPO活性和丹酚酸B积累。Beyer 等[30]发现Ag+可抑制植物中乙烯活性，因为其受体结合区Cu2+可被Ag+替换，Ag+还可通过受体传输信号来阻止受体发生变化[31]。另一方面，Ag+与组氨酸残基中的咪唑基团[32]及色氨酸[33]、亮氨酸[34]均有络合作用。这可能是与银离子有较大体积以及更亲和特性有关，所以比铜离子具备更强的结合能力[34]。

L-半胱氨酸对PPO的抑制机理仍存在争议[41]。一种观点认为，抑制的发生是因为奎宁和半胱氨酸形成共轭结构[42]；另一种观点认为，半胱氨酸通过与铜离子在活性位点发生不可逆结合，从而直接抑制PPO的活性[14]。本研究发现，PPO基因表达被半胱氨酸显著抑制，证实了第二种观点，因为半胱氨酸的SH基团与铜离子有很强的结合力，从而在PPO蛋白的铜离子结合区取代组氨酸配体，和/或从酶中将铜离子完全移除[41]。

研究已发现，酵母提取物可促进丹参毛状根中丹参酮的积累[29]，但它对酚类物质积累的调控还不清楚。对成分和结构的分析显示，酵母提取物是一种能促进大豆子叶与胚轴中大豆抗毒素积累的葡聚糖[43]。多糖结构和对多糖连接位点的识别对决定糖蛋白的结构和作用非常重要。另一方面，一些苯丙酯类被证实能与糖、细胞壁的碳水化合物或有机酸发生共轭作用，这对诱导苯丙胺新陈代谢非常重要[44]。课题组前期研究发现酵母提取物显著增强PPO活性，本研究进一步发现了其促进PPO基因表达和丹酚酸B积累的作用。

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(编辑:宋亚珍)

Cloning of Polyphenol Oxidase Gene fromSalviamiltiorrhizaHairy Roots and Its Expression Analysis

SHI Wangke, SUN Yiyue, SHU Zhiming, ZHANG Yuejin, LIANG Zongsuo, GUO Hongbo*

(State Key Laborotary of Stress Biology in Arid Areas, State and Local Joint Research Center of TCM Fingerprint and Natural Products, College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling，Shaanxi 712100, China)

The polyphenol oxidase (PPO) was found to positively regulate the accumulation of salvianolic acid B (SAB). This investigation further clone its cDNA sequence from hairy roots ofSalviamiltiorrhizaby using RACE technique (named asSmPPO, GenBank accession No. KF712274). The full length cDNA ofSmPPOwas 1 930 bp with a 1 770 bp open reading frame, encoding a protein of 589 amino acids. Two N-glycosylation sites were found in N-terminus thylakoid transfer domain, when comparing the amino acid sequences ofSmPPOto other PPOs in Tubiflorae. Expression analysis of real-time PCR indicated that PPO transcript levels significantly increased in yeast extract (YE)-elicited hairy roots, whereas it significantly decreased in the Ag+, ascorbic acid and cysteine treatments. Correspondingly, the accumulation of SAB was significantly increased in YE-treatment hairy roots, and was inhibited by the three elicitor treatments. These results suggest thatSmPPOgene positively regulates the accumulation of SAB.

Salviamiltiorrhiza; polyphenol oxidase; gene clone; cDNA sequence; gene expression

1000-4025(2016)09-1735-08doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.09.1735

2016-06-12;修改稿收到日期:2016-08-04

国家自然科学基金(81373908);陕西省自然科学基金(2015JM3092; 2016JM8108);中央高校基本科研业务费 (2452016003)

时王珂(1993-)，女，在读硕士研究生，主要从事逆境对药用植物育性影响方面的研究。E-mail: lyshiwangke@gmail.com

郭宏波，博士，副教授，主要从事丹参雄性不育的分子机制的研究。E-mail: hbguo@nwsuaf.edu.cn

Q785; Q789

A