3种锦鸡儿属植物过氧化物酶基因的克隆及表达分析

李宁宁, 齐　菲, 安满霞, 李　瑜, 张文波, 林晓飞*

(1 内蒙古大学 生命科学学院，呼和浩特 010021；2 内蒙古农业大学 林学院，呼和浩特 010019)



3种锦鸡儿属植物过氧化物酶基因的克隆及表达分析

李宁宁1, 齐菲1, 安满霞1, 李瑜1, 张文波2, 林晓飞1*

(1 内蒙古大学 生命科学学院，呼和浩特 010021；2 内蒙古农业大学 林学院，呼和浩特 010019)

采用同源克隆技术分离了3种锦鸡儿属植物柠条锦鸡儿(Caraganakorshinskii)、小叶锦鸡儿(C.microphylla)和中间锦鸡儿(C.intermedia)的过氧化物酶(POD)基因(分别命名为CkPOD、CmPOD和CiPOD)，并对它们在干旱胁迫条件下的表达特征进行了分析。CkPOD、CiPOD、CmPOD基因的cDNA序列均包含有1 074 bp的开放阅读框(ORF)，编码的蛋白质由357个氨基酸构成，分子量为38.7 kD。系统进化分析结果显示：3种锦鸡儿属植物的POD可以和鹰嘴豆等豆科植物的POD聚为一类，且CkPOD和CmPOD具有较近的亲缘关系，CiPOD与CkPOD和CmPOD的亲缘关系相对较远，这一结果与3种锦鸡儿属植物的进化地位一致，显示POD基因较为保守，可以为锦鸡儿属植物的系统分类提供参考。PEG模拟干旱胁迫能够强烈诱导CkPOD、CiPOD和CmPOD基因的表达，显示POD基因在锦鸡儿属植物抵御干旱胁迫过程中发挥着重要作用。研究结果可为解析锦鸡儿属植物的耐旱机理以及利用锦鸡儿属植物进行荒漠改良和生态修复提供理论和实验依据。

锦鸡儿；POD；基因克隆；基因表达；干旱胁迫；系统进化分析

过氧化物酶(Peroxidase，POD)是一种以血红素为辅基的氧化酶，广泛存在于动植物体中，可催化过氧化氢和有机过氧化物对各种有机物和无机物的氧化作用[1-2]。过氧化物酶家族可分为三类, 第一类是与细菌过氧化物酶相关的胞内过氧化物酶，例如抗坏血酸盐过氧化物酶或啤酒酵母的细胞色素c过氧化物酶等；第二类是真菌分泌的过氧化物酶，例如木质素过氧化物酶或锰过氧化物酶；第三类是具有信号肽并通过分泌途径起作用的植物过氧化物酶，该类过氧化酶在植物中广泛存在[3-4]。前人的研究结果表明，POD参与植物的形态建成，在植物生长发育过程中发挥重要作用，例如：植物细胞壁结构蛋白交联、木质素聚合、栓化作用、激素诱导、生长素的降解和异化以及衰老等[5-11]。另一方面，POD作为植物保护酶系统的重要成员之一参与植物抵御逆境反应。它通过与超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)相互协调配合，清除细胞内过剩的自由基，使体内自由基维持在正常的动态平衡，以减少逆境对植物体造成的氧化损伤。植物中的过氧化物酶既有组成型表达的，也有诱导型表达的。在病原菌侵染、冷冻、干旱、重金属离子、机械损伤等生物和非生物胁迫条件下，POD能够被诱导表达[12-21]。特别是在干旱胁迫条件下，植物体内的POD活性会明显升高，显示POD能够在植物抵御干旱胁迫中发挥作用[22-24]。目前，在植物抗逆品种的选育工作中，POD活性常常被作为苗期筛选抗性材料的生化指标[25]。

锦鸡儿属(CaraganaFabr.)植物是豆科多年生落叶灌木，广泛分布于中国西北地区的荒漠地带，具有较强的抗旱能力，是干旱、半干旱地区常见的防风固沙及沙地牧场改良的优良树种。在过去的100年里，由于人类的过度干预，中国西北地区黄土高原地带自然植被被大量破坏。在20世纪中叶，该地区实施了大规模的植被修复工程[26]。由于柠条锦鸡儿(C.korshinskii)、中间锦鸡儿(C.intermedia)和小叶锦鸡儿(C.microphylla)具有强大的根系和广泛的适应性，故而作为理想的植物材料被广泛用于生态修复工程。因此，比较研究这3种锦鸡儿属植物的耐旱机制，可为它们在生态修复工程中的合理利用提供依据。在前期研究中调查了干旱胁迫条件下这3种锦鸡儿属植物SOD基因的表达特征[27]，本工作克隆了该3种植物的POD基因，并比较分析了它们在干旱胁迫下的表达特性，以期为研究锦鸡儿属植物的抗旱分子机理及利用锦鸡儿属植物进行荒漠改良和生态修复提供理论和实验依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

本研究的初始材料为柠条锦鸡儿、中间锦鸡儿和小叶锦鸡儿的种子。柠条锦鸡儿种子采自巴彦淖尔狼山前冲积扇锦鸡儿灌丛，中间锦鸡儿种子采自准格尔黄上丘陵沟壑区中间锦鸡儿灌丛，小叶锦鸡儿采自锡林格勒锡林河流域小叶锦鸡儿灌丛。挑选饱满、均一无虫蛀的种子，经75%乙醇和0.1%升汞消毒后，置于铺有3层湿滤纸的培养皿内萌发。取长势一致的幼苗移栽于盛有石英砂的容器中，置于25℃、14 h/d光周期、光照强度36～40 μmol·m-2·s-1的光照培养箱中培养，并定时定量浇灌1/2 Hoagland营养液。生长7周左右的幼苗用于提取RNA。

主要试剂：TaKaRa RNA Extraction Kit(TaKaRa)、TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver 3.0、克隆载体pMD-19T(TaKaRa)、SMART RACE cDNA Ampliication Kit(Clontench)、DNA Gel Extraction Kit(AXYGEN)、Takara RT-PCR Kit(TaKaRa)、大肠杆菌感受态(Escherichiacoli)DH5a(TaKaRa)、TransScript All-in-One First-Strand cDNA synthesis SuperMix(TransGen)和TransStart Tip Green qPCR SuperMix(TransGen)等。其他生化及分子生物学试剂均为国产分析纯。本研究所有引物合成及测序工作均由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.2实验方法

1.2.13种锦鸡儿属植物POD基因的克隆利用ClustalW软件对GenBank已登录的亚麻(Linumusitatissimum，AAB47602.1)、紫花苜蓿(Medicagosativa，AAB41811.1)、拟南芥(Arabidopsisthaliana，AAA32842.1)、野生萝卜(Armoraciarusticana，CAA40796.1)和大豆(Glycinemax，AAL40127.1)过氧化物酶的氨基酸序列进行多重同源比对，在保守区域设计1对兼并引物Deg-POD-F(5′-CAYTTYCAYGAYTGYTTYGT-3′)和Deg-POD-R(5′-GTRTTNARNGTNGGRTCNGG-3′)。

利用TaKaRa RNA Extraction Kit提取3种锦鸡儿属植物的总RNA，并采用TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver 3.0反转录合成cDNA第一链。以柠条锦鸡儿cDNA为模版，利用Deg-POD-F和Deg-POD-R兼并引物，经PCR扩增CkPOD基因片段。PCR反应体系为：10×PCR buffer 2.5 μL、dNTPs(各2.5 mmol/L)2.0 μL、Deg-POD-F(50 μmol/L)1.0 μL、Deg-POD-R(50 μmol/L)1.0μL、TakararTaq(5 U/μL)0.2 μL，加去离子水至25 μL。反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，47.5 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。

根据已获得的CkPOD基因序列设计该基因的特异性引物POD-GSP-R(5′-GAGCAGCAAGGGCAA-GAATATCAGC-3′)；POD-GSP-F(5′-CTGCTCTTTAT-TCGTGGACCG-3′)，用于末端克隆。利用SMART RACE cDNA Ampliication Kit试剂盒合成cDNA第一链，利用POD-GSP-R和试剂盒提供的UPM引物扩增CkPOD的5′末端序列。PCR反应体系为：10×ExPCR buffer 2.5 μL、dNTPs(各2.5 mmol/L)2.0 μL、MgCl2(25 mmol/L)2.0 μL、POD-GSP-R(10 μmol/L)1.0 μL、UPM(10×)2.5 μL、TakaraExTaqHS(5 U/μL)0.2 μL，加去离子水至25 μL。反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 7 min。利用TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver 3.0试剂盒提供的Oligo(dT)引物，以柠条锦鸡儿总RNA为模版合成cDNA第一链，使用POD-GSP-F和M13M4引物扩增CkPOD3′末端序列。PCR反应体系为：10×ExPCR buffer 2.5 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)各2.0 μL、MgCl2(25 mmol/L)2.0 μL、POD-GSP-F(10 μmol/L)1.0 μL、M13M4(10 μmol/L)1.0 μL、TakaraExTaqHS(5 U/μL)0.2 μL，加去离子水至25 μL。反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 7 min。

根据RACE-PCR获得的CkPOD末端序列，在其上下游分别设计引物Full-POD-F(5′-ATGAAGTACTCCCTTCGTCTC-3′)和Full-POD-R(5′-TGTCATGGATGTGCC-3′)。分别以3种锦鸡儿属植物的cDNA为模版，利用Full-POD-F和Full-POD-R引物，扩增柠条锦鸡儿、中间锦鸡儿和小叶锦鸡儿POD cDNA全长序列。PCR反应体系为：10×ExPCR buffer 2.5 μL、dNTPs(各2.5 mmol/L)2.0 μL、MgCl2(25 mmol/L)2.0 μL、Full-POD-F(10 μmol/L)1.0 μL、Full-POD-R(10 μmol/L)1.0 μL、TakaraExTaqHS(5 U/μL)0.2 μL，加去离子水至25 μL。反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，49 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，用DNA Gel Extraction Kit回收目的片段，与克隆载体pMD-19T连接并转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，将PCR检测为阳性的重组菌进行扩大培养后送上海英骏生物技术有限生公司测序。

1.2.23种锦鸡儿POD基因的生物信息学分析将所克隆的3种锦鸡儿属植物PODcDNA序列进行BlastX同源性比对；利用NCBI的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)识别ORF，并将其翻译成相应氨基酸序列；利用 ExPASy数据库的PortParam软件(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)对编码的氨基酸序列的基本性质进行预测。在GenBank中搜索不同植物POD基因的氨基酸序列，与3种锦鸡儿属植物的POD氨基酸序列进行Clustal W多重比对，并利用MEGA5.0软件的邻接法(neighbor-joining，N-J法)构建系统进化树。

1.2.33种锦鸡儿属植物POD基因在干旱胁迫下的表达检测为了比较分析这3种锦鸡儿属植物POD基因在干旱胁迫下的表达特性，将生长7周左右的幼苗分别进行5%、15%和25% PEG模拟干旱胁迫，并分别在第1天、第3天、第5天和第7天提取胁迫处理的3种锦鸡儿属植物的总RNA，利用Roche LightCycler480 II系统进行实时荧光定量PCR对其表达量进行检测。根据已获得的3种锦鸡儿属植物POD基因序列设计特异性引物POD-RT-F(5′-TGATATTCTTGCCCTTGC-3′)和POD-RT-R(5′-GGCTTTGGTTGGCTGTTA-3′)，利用柠条锦鸡儿的肌动蛋白基因(CkActin，FJ485727.1 Ck-ACT-RT-F:5′-CAACCCTAAGGCTAATCG-3′, Ck-ACT-RT-R:5′-GCATAAAGGGAAAGGACA-3′)作为内参，使用TransScript All-in-One First-Strand cDNA synthesis SuperMix试剂盒合成cDNA；并使用TransStart Tip Green qPCR SuperMix(TransGen)试剂盒进行实时荧光定量PCR。反应体系为：2×TS Tip Super Mix 10 μL、Primer-F(POD-RT-F和 Ck-ACT-RT-F，10 μmol/L)0.4 μL、Primer-R(POD-RT-R和 Ck-ACT-RT-R，10 μmol/L)0.4 μL、cDNA 1.0 μL，加去离子水至20 μL。反应条件为：95 ℃ 10 s；95 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，48个循环；溶解曲线从65～97 ℃。所有实验均进行3次重复，实验数据经SPSS 19.0软件进行统计分析并绘图。

2　结果与分析

2.13种锦鸡儿属植物POD基因的克隆

2.1.1柠条锦鸡儿POD基因片段及末端序列的克隆以柠条锦鸡儿总RNA反转录所合成的cDNA第一链为模板，利用在POD保守区域设计的兼并引物Deg-POD-F和Deg-POD-R，通过RT-PCR扩增获得了500 bp的基因片段(图1，A)。Blast X分析显示，所获得的序列与其他高等植物POD基因序列具有高度同源性，可初步确定其为柠条锦鸡儿的POD基因片段，并将其命名为CkPOD。根据已获得的500 bp的CkPOD基因序列设计特异性引物POD-GSP-F和POD-GSP-R，采用RACE技术分离了CkPOD的3′末端序列570 bp(图1，B)和5′末端序列500 bp(图1，C)。

2.1.23种锦鸡儿属植物POD基因全长序列的克隆由于柠条锦鸡儿、中间锦鸡儿和小叶锦鸡儿的亲缘关系较近，故而利用同源克隆的方法进行该3种植物POD基因序列的分离。在CkPOD的5′末端设计引物Full-POD-F、3′末端设计引物Full-POD-R，分别以3种锦鸡儿属植物总RNA反转录得到的cDNA第一链为模版，经PCR扩增获得了1 074 bp的基因序列(图2)。通过测序和分析后证它们是柠条锦鸡儿、中间锦鸡儿和小叶锦鸡儿POD基因的cDNA序列。

M. 100 bp Ladder Marker; 1. 兼并PCR产物；2. 3′-RACE；3. 5′-RACE图1　兼并PCR和RACE-PCR产物M. 100bp Ladder Marker; 1. Product of degenerate PCR；2. 3′-RACE；3. 5′- RACEFig.1　Products of degenerate PCR and RACE-PCR

2.23种锦鸡儿属植物POD基因序列分析CkPOD、CiPOD和CmPOD基因cDNA均包含1 074 bp的开放阅读框(ORF)，编码357个氨基酸。利用ExPASy数据库中的PortParam软件在线分析结果显示，CkPOD、CiPOD和CmPOD的蛋白分子量均为38.7 kD，理论等电点分别为6.98、6.09和6.59。利用在线软件TargetP进行分析结果显示，3种植物的POD均为分泌途径中的蛋白，且均具有28个氨基酸的信号肽 (图3)。跨膜结构域预测显示，3种植物的POD蛋白均具有3个跨膜结构域(7～26 aa，119～144 aa，182～201 aa，图3)。绝大多数植物Ⅲ型POD保守的8个半胱氨酸残基也被发现在所克隆的3个基因序列中(40～120、73～78、126～328和205～237位)，它们分别形成4个紧密相连的二硫键桥以维持酶结构的稳定性。另外，以Asp-72、Asp-79、Ser-81、Val-75和Gly-77为中心的Ca2+结合位点构成远端的氧供体结构域，而以Thr-199、Asp-250、Thr-253、Asp-258和Val-256为中心的Ca2+结合位点则构成了近端氧供体结构域。位于2个结构域中间的血红素则由Fe2+与His-71和His-198形成共价键，构成活性中心；His-198与Asp-275通过氢键形成咪唑环以协助维持血红素活性中心的稳定(图3)。

利用Clustal W软件对CkPOD、CiPOD和CmPODcDNA进行多重比对发现(图3)，3条序列中有23个核苷酸不同，其中CkPOD和CmPOD间有11个核苷酸不同，CiPOD和CmPOD间有16个核苷酸不同，而CkPOD和CiPOD间则有19个核苷酸不同。对CkPOD、CiPOD和CmPOD的氨基酸序列进行比对结果显示，3种POD之间只有5个氨基酸不同，其中CkPOD和CmPOD有3个不同的氨基酸(145、182和243 aa)，CiPOD和CmPOD也有3个不同的氨基酸(38、42和243 aa)，而CkPOD和CiPOD有4个不同的氨基酸(38、42、145和182 aa，图3)。基于21种植物POD蛋白的氨基酸序列构建的系统进化树显示，3种锦鸡儿属植物的POD与鹰嘴豆等豆科植物POD蛋白聚为一类。柠条锦鸡儿和小叶锦鸡儿的POD具有较近的亲缘关系，而中间锦鸡儿则与柠条锦鸡儿和小叶锦鸡儿POD的亲缘关系相对较远(图4)。

M. DL2000; 1. 柠条锦鸡儿；2. 中间锦鸡儿；3. 小叶锦鸡儿图2　cDNA全长序列扩增M. DL2000; 1. CkPOD cDNA；2. CiPOD cDNA；3. CmPOD cDNAFig.2　Amplification of full-length cDNA

C.k.柠条锦鸡儿；C.i.中间锦鸡儿；C.m.小叶锦鸡儿；波浪线为信号肽序列，下划线为跨膜结构域，方框为活性中心构成序列，●表示与Ca2+结合的氨基酸残基;▲表示形成二硫键的半胱氨酸残基，◆表示活性作用位点的氨基酸残基序列，★表示与血红素结合相关的氨基酸残基图3　CkPOD、CiPOD和CmPOD的cDNA及氨基酸序列比对C.k. C. korshinskii；C.i. C. intermedia；C.m. C. microphylla； Wavy lines indicated the putative signal peptide, underline indicated the transmembrane domains, the boxes represent the putative catalytic domain, ● indicated the Ca2+ site hydrogen bonded to the residues, ▲ indicated the cysteine residues involved in disulfide bridges, ◆ indicated the active site residues and ★ indicated the residues bonding to heme iron atomFig.3　Alignment of cDNAs and amino acids of CkPOD, CiPOD and CmPOD

图4　由邻位相接法构建的21种植物POD蛋白的系统进化树Fig.4　Neighbor joining phylogenetic tree of POD proteins from 21 plant species

图5　CkPOD、CiPOD和CmPOD基因在PEG模拟干旱胁迫下的表达量Fig.5　Expression levels of the CkPOD, CiPOD and CmPOD under PEG-simulated drought stress conditions

2.33种锦鸡儿属植物POD基因在干旱胁迫下的表达

为了进一步调查CkPOD、CiPOD和CmPOD基因在干旱胁迫下的表达特性，生长7周的幼苗分别用于5%，15%和25% PEG-模拟干旱胁迫，并比较分析在胁迫第1天、第3天、第5天和第7天时3种锦鸡儿属植物POD基因的表达量变化。实时荧光定量PCR结果显示，PEG模拟干旱能够强烈地诱导CkPOD、CiPOD和CmPOD基因的表达(图5)。在正常生长条件下，CkPOD、CiPOD和CmPOD的表达量都比较低；特别是CiPOD基因的表达量与CkPOD和CmPOD相比最低(图5)，然而在干旱胁迫条件下它们的表达量均迅速升高。CiPOD和CmPOD基因的表达模式较为相似，在25% PEG胁迫第5天时它们的表达量达到峰值；而CkPOD基因则是在15% PEG胁迫第7天时表达量达到峰值(图5)。

3　讨　论

植物POD是一个非常庞大的基因家族，拟南芥基因组中含有73个POD基因[28]，水稻基因组中含有138个POD基因[29]，故而推测锦鸡儿属植物中也存在多个POD基因，本研究所克隆的CkPOD、CiPOD和CmPOD基因也仅仅是POD基因家族中的一个成员。生物信息学分析显示，所克隆基因包含了植物过氧化物酶所特有的活性残基[30]，与Ca2+结合的保守氨基酸残基，形成二硫键桥的8个半胱氨酸残基以及与血红素结合相关的天冬氨酸和组氨酸残基[31]，可进一步说明CkPOD、CiPOD和CmPOD基因编码的蛋白具有过氧化物酶活性。另外，所克隆的3种锦鸡儿属植物POD蛋白均含有信号肽序列，显示它们可能为第三类过氧化物酶基因[32]。

目前国内外学者对同属小叶系的小叶锦鸡儿、中间锦鸡儿和柠条锦鸡儿的种间亲缘关系，特别是对于中间锦鸡儿是否是一个独立的物种存有较大的争议。Sanczir[33]、富象乾[34]、刘媖心[35]和赵一之[36]等认为中间锦鸡儿是一个独立的物种；Yakovlev[37]认为中间锦鸡儿与柠条锦鸡儿为同一物种；张明理等[38]认为中间锦鸡儿是柠条锦鸡儿的一个变种；而徐朗然和郝秀英[39]则认为中间锦鸡儿是小叶锦鸡儿的一个变种。侯鑫等通过分析该3种植物ITS和叶绿体trnL-F基因序列否定了中间锦鸡儿的杂交起源假说，认为小叶锦鸡儿、中间锦鸡儿和柠条锦鸡儿是一个连续的地理渐变群[40]。本研究利用POD基因序列进行系统进化分析结果显示，柠条锦鸡儿和小叶锦鸡儿的POD具有较近的亲缘关系，而中间锦鸡儿则与柠条锦鸡儿和小叶锦鸡儿POD的亲缘关系相对较远；这一结果支持侯鑫等关于该3种植物进化关系的推论。该结果也在一定程度上说明POD基因的起源非常古老且较为保守，可作为分子标记为植物的分类提供参考。

POD作为植物保护酶系统的成员之一，与SOD和CAT协同作用参与植物抵御生物和非生物胁迫。在胁迫条件下植物体内的POD活性升高，以清除植物体内过剩的自由基[41-45]，避免氧化损伤。在PEG模拟干旱胁迫条件下CkPOD、CiPOD和CmPOD表达量均明显升高，显示该基因在锦鸡儿属植物抵御干旱胁迫中发挥重要作用。该结果亦与拟南芥(A.thaliana)[41]、杨树(Populusperoxisoma)[42]、番茄(Solanumlycopersicum)[43]、三叶胶(Grimmiapilifera)[44]和甘蔗(Saccharumofficinarum)[45]等植物POD表达特性的报道一致。柠条锦鸡儿、中间锦鸡儿和小叶锦鸡儿在地理分布上是随着水分梯度自西向东呈替代分布[40]，其中柠条锦鸡儿的抗旱性最强，小叶锦鸡儿的抗旱性最弱[46]。李凤玲等[47]的研究表明，在干旱胁迫条件下该3种锦鸡儿属植物的POD活性明显提高，其中柠条锦鸡儿POD的活性明显高于中间锦鸡儿和小叶锦鸡儿，该结果与本研究中3种锦鸡儿属植物POD基因表达量的分析结果有所差异。在胁迫初期小叶锦鸡儿的CmPOD表达量最高，其次是柠条锦鸡儿CkPOD，而中间锦鸡儿CiPOD的表达量最低。植物的POD是一个庞大的基因家族，其成员数量众多，每一个成员可能有不同的表达模式，对总POD活性的贡献也有所不同。另一方面，转录水平上基因表达量的微弱差异并不能够反映其在翻译水平上表达量的差异。因此，分离该3种锦鸡儿属植物其它POD成员并比较分析它们的表达模式对于深入研究其耐旱机理是非常必要的。

干旱作为一个重要的非生物胁迫因子严重制约农作物及牧草的生产，因此，研究植物的抗旱分子机理、采用分子生物学技术手段进行作物的抗旱性遗传改良、或者筛选具有应用价值的抗旱作物品种非常必要。本研究为深入研究锦鸡儿属植物的抗旱分子机理及利用锦鸡儿属植物进行荒漠改良和生态修复提供了一定的理论和实验依据。

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(编辑:宋亚珍)

Isolation and Expression Feature of Peroxidase Genes from ThreeCaraganaSpecies

LI Ningning1, QI Fei1, AN Manxia1, LI Yu1, ZHANG Wenbo2, LIN Xiaofei1*

(1 College of Life Sciences, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China; 2 College of Forestry, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019, China)

Peroxidase (POD) genes were isolated from threeCaraganaspecies,C.korshinskii,C.microphyllaandC.intermedia(designated asCkPOD,CmPODandCiPOD, respectively) using homology-based cloning techniques, and their expression profiles under drought stress conditions were investigated. All of the cDNAs ofCkPOD,CiPODandCmPODcontain an open reading frame (ORF) of 1 074 bp, encoding a protein of 357 amino acids with a theoretical molecular weight of 38.7 kD. Phylogenetic analysis showed that these threeCaraganaPODs could be clustered into one clade with their isoforms from leguminosae, includingCicerarietinum. The PODs ofC.korshinskiiandC.microphyllashowed a closer relationship compared toC.intermediaPOD, corresponding to evolutionary history of the threeCaraganaplants. Real time RT-PCR revealed that the expression of theCaraganaPODgenes was strongly induced by PEG-simulated drought stress, showing that theCaraganaPODgenes play an important role in resisting drought-tolerance. These results may provide theoretical and experimental basis for understanding the drought-tolerance mechanism of theCaraganaplants and for their utilization in desert improvement and vegetation restoration programs.

Caragana; peroxidase; gene cloning; gene expression; drought stress; phylogenetic analysis

1000-4025(2016)09-1743-09doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.09.1743

2016-06-14;修改稿收到日期:2016-08-18

国家自然科学基金(31260168);内蒙古自然科学基金(2015MS0355)

李宁宁 (1986-)，男，在读博士研究生，主要从事植物逆境分子生物学研究。E-mail: lining86@outlook.com

林晓飞，副教授，主要从事植物逆境分子生物学研究。E-mail:linxiaofei04@hotmail.com

Q785; Q786

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