手十二井穴刺络放血对急性一氧化碳中毒意识障碍大鼠促醒作用及其机制的研究*

岳　颖　金　军刘建卫　刘　亮　刘文淑　冯　宇　郭　义*

手十二井穴刺络放血对急性一氧化碳中毒意识障碍大鼠促醒作用及其机制的研究*

岳颖①金军②刘建卫③刘亮④刘文淑④冯宇④郭义④*

目的：观察探讨手十二井穴刺络放血对急性一氧化碳中毒大鼠意识状态、静脉血中碳氧血红蛋白（COHb）浓度及脑组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性的影响。方法：选用成年雄性SD大鼠30只，将其随机分为正常组、模型组及治疗组3组，每组10只。于大鼠染毒前、染毒后即刻、染毒后1 h及4 h，观测大鼠意识状态，分别取大鼠尾静脉血检测COHb浓度，4 h后取脑组织，进行GSH-Px活性检测。结果：手十二井穴刺络放血可以改善急性一氧化碳中毒大鼠的意识状态，缩短昏迷时间；染毒后1 h和染毒后4 h，治疗组大鼠静脉血中COHb浓度明显低于模型组，三组比较均有差异（F=10.640，F=4.401；P＜0.05）。染毒后4 h，治疗组大鼠脑组织中GSH-Px活性明显高于模型组，三组比较均有差异（F=17.626，P＜0.05）。结论：手十二井穴刺络放血对急性一氧化碳中毒大鼠具有脑保护作用。

急性一氧化碳中毒；井穴放血；碳氧血红蛋白；谷胱甘肽过氧化物酶

［First-author’s address］ Department of Clinical and Practical Teaching， Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 300193， China.

一氧化碳（CO）为一种无色、无味的气体，是最常见的引起中毒性死亡的气体，可以引起多脏器损害［1］。约有50%的存活者在CO中毒后的3 d到4周内会发生急性一氧化碳中毒（acute carbon monoxide poisoning，ACOP）迟发性脑病。ACOP在许多国家引起意外生活性中毒及职业性中毒的疾病中，是发病率和病死人数最多的中毒，其病死人数在我国各种急性中毒中高居首位［2-3］。本研究在前期工作中发现，手十二井穴刺络放血可以改善ACOP患者的意识状态［4］。因此，本研究在前期工作的基础上，为进一步拓展研究范围，探讨和评价手十二井穴刺络放血的促醒作用及其部分机制。

1　材料与方法

1.1实验动物

选择30只健康成年雄性Wistar大鼠，3月龄，体重为180～220 g；自由饮水，在相对湿度50%～55%、温度20～22 ℃及自然照明的环境中饲养备用。大鼠于染毒前1 d禁食不禁水，观察7 d，大鼠健康情况良好，进行染毒实验。实验动物饲养和使用均符合国际动物伦理法案的要求。

1.2设备与试剂

（1）自制染毒装置。染毒装制为一有机玻璃舱，其容积约90 L，染毒前用CO标准气体（4000 ppm）吹扫，下端一侧有出气口，其对侧上端有一进气口，尾气以氨性氯化钙回收。罐底预先放置碱石灰以吸收大鼠呼出的二氧化碳气体。

（2）仪器与试剂。采用722分光光度计（上海仪器有限公司），CO标准气体气相色谱分析（天津盛唐特种气体责任有限公司），谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒（南京建成）。

1.3实验动物分组及建模

参照Ishchiropoulos的方法［5］将实验动物随机编号分为：正常组（10只）、模型组（10只）、治疗组（10只）。正常组：大鼠在罐内静式吸入空气60 min；模型组：大鼠在罐内静式吸入含CO浓度为4000 ppm的空气60 min；治疗组：同模型组。

1.4静脉血COHb浓度及GSH-Px活性检测

1.4.1静脉血中COHb浓度检测

检测方法：①制备CO饱和液，分别吸取20倍稀释的患者血液各0.5 ml于2只试管中，1支试管加饱和一氧化碳液4.5 ml，另1支试管加双蒸水4.5 ml，室温放置10 min，用722分光光度计，波长419 nm，1 cm比色杯比色，根据吸光度计算出血液COHb含量；②选穴，位于大鼠的双侧前肢趾端的十二井穴，每侧刺六个井穴（井穴定位方法采用比较解剖学方法选取）。

（1）正常组。不通入一氧化碳气体，进气口和出气口与外界空气相通，大鼠置于空的染毒罐中，于1 h、4 h取大鼠尾静脉血检测。

（2）治疗组。从染毒罐取出后，立刻用刺血针在以上各井穴进行点刺放血，出血量每穴一滴为宜。于1 h、4 h取大鼠尾静脉血检测。

（3）模型组。从染毒罐取出后，置于空气中，于1 h、4 h取大鼠尾静脉血检测。

1.4.2脑组织中GSH-Px活性检测

从染毒罐中取出4 h后，对各组实验动物进行固定并取脑。大鼠采取俯卧位，从枕后部沿颅顶正中线直至鼻尖部位，切开大鼠的头皮，使大鼠颅骨暴露。然后沿正中线向前剪开至后囟，再沿正中线剪开至前囟，慢慢打开颅腔，暴露大鼠的脑组织，然后将脑膜、血管剪除。取出鼠脑，将其分别放置于低温下，取冰生理盐水按1∶4（W∶V）制备成20%匀浆，于-78℃低温保存。测定时选取2500 r/min，离心10 min，取上清液按试剂盒操作说明操作。

1.5观察指标

（1）观察大鼠昏迷状态。将大鼠意识状态分为6级，其Ⅴ、Ⅵ级被认为是昏迷状态。死亡的大鼠即予弃去［6］。

（2）检测大鼠静脉血中碳氧血红蛋白（carboxyhemoglobin，COHb）浓度和脑组织中GSH-Px活性。1.6 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行分析，计数资料以均数±标准差（x-±s）表示，采用one-way ANOVA统计方法，组间比较选用LCD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　实验结果

（1）治疗组大鼠意识状态得到明显改善，昏迷时间极大缩短，且治疗组明显低于模型组，差异有统计学意义（t=4.422，P＜0.05），见表1。

表1　模型组与治疗组大鼠促醒时间（x-±s）

（2）3组大鼠染毒后1 h、染毒后4 h，治疗组大鼠尾静脉血中COHb浓度均明显低于模型组，3组比较差异有统计学意义（F=10.640，F=4.401；P＜0.05）见表2。

（3）3组大鼠染毒后4 h，治疗组大鼠脑组织中GSH-Px活性明显高于模型组，3组比较差异有统计学意义（F=17.626，P＜0.05），见表3。

表3　各组大鼠脑组织内GSH-Px活性（μmol/mg Pr·min， x-±s）

3　讨论

3.1COHb浓度测定

进入人体的CO大量与血红蛋白结合而形成难以解离的COHb，其不仅妨碍氧与Hb的结合，而且抑制了氧的解离，从而造成全身组织严重缺氧，进而造成低氧血症的出现［7-8］。由于中枢神经系统对缺氧最为敏感，故脑部最先受累，患者出现昏迷状态。此外，有临床研究报道［9］：COHb水平越高预示着一氧化碳中毒病情越重。所以COHb浓度的降低，有助于O2Hb含量的增加，有助于解决组织缺血缺氧，从而保护机体重要器官。

本研究实验结果显示，染毒后即刻，模型组、治疗组COHb浓度明显高于正常组，且模型组和治疗组染毒后即刻COHb浓度无明显差异，表明染毒成功，模型组和治疗组大鼠中毒程度无明显差异。染毒后1 h、4 h模型组COHb浓度仍然明显高于正常组。染毒后1 h、4 h治疗组COHb浓度明显低于模型组，且染毒后4 h其COHb浓度与正常组无明显差异，治疗组COHb已经趋于正常水平。可见手十二井穴刺络放血可尽快缓解组织缺氧情况，以有效预防和减轻脑水肿及脑细胞损伤，从而起到脑保护作用。

3.2GSH-Px活性测定

ACOP后再灌注过程中产生大量的自由基，是造成脑组织损伤的主因之一［10］。有研究证实，CO中毒后脑中过氧化物、氧自由基明显增加，而GSH-Px等抗氧化酶类明显减少，会导致神经系统损伤，以致细胞严重受损或死亡［11］。有研究证实，GSH-Px在ACOP脑损伤中发挥重要作用，是至今在CO引起诸多效应指标中，早期最为敏感的指标之一［12］。

本研究结果表明，染毒后模型组和治疗组脑组织中GSH-Px活性比正常组显著增高，这符合ACOP早期，大鼠脑组织GSH-Px活性增高这一结论。因此，在ACOP后即刻给予手十二井穴刺络放血治疗可以提高脑组织GSH-Px活性，对氧自由基的清除能力增强，减少脑组织中过氧化物代谢产物的形成，从而起到脑保护作用。因此，在ACOP早期，予以手十二井穴刺络放血法，可以减轻自由基氧化损伤，从而保护脑细胞。

3.3意识状态改变

中医认为“诸阳之会”和“脑为髓海”，ACOP后必损元阳，针刺可起到促醒作用，故采用疏通经络、开窍醒神及行气活血的治则。本研究观察到，治疗组大鼠的促醒时间明显低于模型组，表明手十二井穴进行刺络放血治疗能改善大脑的血液循环，提升含氧量，提高脑细胞活性，起到促醒作用。

4　结语

本研究发现，在ACOP早期，予以手十二井穴刺络放血法，可尽快改善中毒后意识障碍大鼠的意识状态，起到促醒作用，可使大鼠静脉血中COHb浓度迅速下降，从而尽快缓解组织缺氧情况，以有效预防和减轻脑水肿及脑细胞损伤，可以减轻自由基氧化损伤，从而起到脑保护作用。手十二井穴刺络放血疗法是一种简单、方便、有效且经济的院前急救ACOP措施，此法可为院前急救的应用提供科学依据。

［1］Lindell K，Weaver MD.Carbon Monoxide Poisoning［J］.N Engl J Med，2009，360：1217-25.

［2］Lee SJ，Kang JH，Kim NY，et al.A case report of carbon monoxide poisoning induced cardiomyopathy comolicated with left ventricular thrombus［J］.Cardiovasc Ultrasound，2011，19（2）：83-86.

［3］乔丽娟.急性一氧化碳中毒的治疗进展［J］.医学理论与实践，2014，27（12）：1571-1572.

［4］金军，张赛，李洪艳，等.手十二井穴刺络放血对急性一氧化碳中毒意识障碍患者意识状态的影响［J］.中国中医急症，2012，21（2）：175-176.

［5］Ishiropoulo SH，Beers MF，Tohno shI S，et al. Nitric oxide production and perivascular tyrosine nitration in brain after carbon monoxide poisoning in rats［J］.J Clin Invest，1996，97（10）：2260-2267.

［6］Jeffrey RS，Rene HL.Effects of valproate and citrulline on ammonium-induced encephalopathy［J］.Epilepsia，1994，35：164-171.

［7］Ernst A，Zibrak JD.Carbon monoxide poisoning［J］.New Engl J Med，1998，339（22）：1603-1608.

［8］Lane TR，Williamson WJ，Brostoff JM.Carbon monoxide poisoning in a patient with carbon dioxide retention：a therapeutic challenge［J］. Cases J，2008，1（1）：102.

［9］刘鹏，何跃忠，张锡刚，等.碳氧血红蛋白与一氧化碳中毒的相关性研究［J］.军事医学，2011，35（2）：134-135.

［10］Centers for Disease Control and Prevention（CDC）. Unintentional poisoning deaths-United States1999-2004［J］.MMWR Morb Mortal Wkly Rep，2007，56（5）：93-96.

［11］Emst A，Zibrak JD.Carbon monoxide poisoning［J］.New Eng J Med，1998；339（22）：1603-1608.

［12］Seleye-Fubara D，Etebu EN，Athanasius B. Pathology of deaths from carbon monoxide poisoning in Port Harcourt：an autopsy study of 75 cases［J］.Niger J Med，2011，20（3）：337-340.

Study on the mechanism of promoting awakening of twelve well points of the hand pricking blood therapy on acute carbon monoxide poisoning consciousness disorder rats

YUE Ying，JIN Jun， LIU Jian-wei， et al// China Medical Equipment，2016，13（10）:125-127.

Objective: To observe the effect of needling hand twelve wells phlebotomy poisoning glutathione peroxidase activity of rat consciousness， venous blood carboxyhemoglobin concentration and brain tissue of acute carbon monoxide. Methods: A total of 30 adult male SD rats were randomly divided into normal group， model group and treatment group， with 10 rats in each group. In rats exposed before and immediately exposed after 1 hour and 4 hours， we observed the state of consciousness of rats and tested venous blood carboxyhemoglobin contents. The brain tissue was taken out after 4 hours， to detect glutathione peroxidase activity. Results: Twelve well points of the hand pricking blood in rats with acute carbon monoxide poisoning can improve the state of consciousness and shorten the duration of coma. After exposed for 1 hour and 4 hours， carboxyhemoglobin concentration in rat tail vein blood in the treatment group was significantly higher than that in the model group. The glutathione peroxidase activity in the brain tissue of the treatment group was significantly higher than that of the model group after exposed for 4 hours. Conclusion: Twelve well points of the hand bloodletting has protective effect on brain of rats with acute carbon monoxide poisoning coma.

Acute carbon monoxide poisoning； Blood-letting puncture at Jing-points； Carboxyhemoglobin； Glutathione peroxidase

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.10.037

1672-8270（2016）10-0125-03

R246

A

2016-08-09

国家自然科学基金（81303023）“基于p38信号通路的井穴放血法对急性一氧化碳中毒的脑保护作用机制研究”；天津市科学技术委员会自然科学基金资助项目（08JCYBJC27700）“手十二井穴刺络放血急救煤气中毒的临床与实验研究”

①天津中医药大学临床实训教学部 天津 300193

③天津中医药大学中西医结合学院 天津 300193

②天津中医药大学国际教育学院 天津 300193

④天津中医药大学针灸推拿学院 天津 300193

guoyi_168@163.com

岳颖，女，（1980- ），博士研究生。天津中医药大学临床实训教学部，研究方向：井穴刺络放血。