ARDS大鼠血小板MEK1磷酸化水平变化研究

刘 宏，范晓枝,2，田新强，李 冰

（1.山西大同大学呼吸病与职业病研究所，山西大同037009；2.临汾市第四人民医院呼吸科，山西临汾041000）

ARDS大鼠血小板MEK1磷酸化水平变化研究

刘 宏1，范晓枝1,2，田新强1，李 冰1

（1.山西大同大学呼吸病与职业病研究所，山西大同037009；2.临汾市第四人民医院呼吸科，山西临汾041000）

目的探讨急性呼吸窘迫综合征（ARDS）时血小板活化的信号通路。方法30只健康大鼠随机分为5组。实验组4组，尾静脉注射油酸（0.25ml/kg）制备ARDS模型；对照组1组，尾静脉注射等量生理盐水。注射油酸后2，6，24，72 h，注射生理盐水后2 h，从腹主动脉采血，分离血小板，提取血小板蛋白，用Western blotting技术检测血小板内丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号通路上的主要蛋白激酶之一丝裂原活化的细胞外信号调节激酶1（MEK1）的磷酸化水平变化，探讨ARDS时血小板MAPKs信号转导通路的改变及其与ARDS发病的关系。结果6～72 h实验组动物血小板内MEK1磷酸化水平明显增高，在72 h表达量最高（P＜0.05）。结论ARDS时血小板发生了活化；其活化过程与MEK1-ERK1/2信号转导通路启动有关。

急性呼吸窘迫综合症；血小板活化；丝裂原活化蛋白激酶；信号转导；丝裂原活化的细胞外信号调节激酶1

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种由多种致病因素引起的以呼吸窘迫、进展迅速、持续低氧血症、肺部大面积病变为特征的急性呼吸衰竭，是临床常见急危重病症，治疗困难，病死率较高。虽然近50年来医学界对之进行了大量研究，但其详细的发病机制仍不十分清楚。本课题组在既往研究中发现，ARDS时血液循环中存在高凝状态，血小板发生活化并可能在ARDS发病中起重要作用[1]。本研究在既往研究基础上，探讨ARDS时血小板活化的信号转导通路，进而探讨ARDS发病的分子机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备

健康SD大鼠30只，体质量250 g～400 g，随机分为5组，每组6只。实验组（OA组）4组，尾静脉注射油酸（分析纯，天津市风船化学试剂公司产品）0.25 mL/kg制备ARDS模型。对照组（NS组）1组，尾静脉注射等量生理盐水。注射油酸后2，6，24，72 h，注射生理盐水后2 h，处死动物，取样检测。

1.2 肺湿/干重比值测定和病理学检查

动物处死后，立即开胸取肺做大体观察，称肺质量并计算肺系数（肺系数=肺质量/体质量×100%）。左肺置10%福尔马林溶液中固定1周后，按常规病理学方法切片，HE染色，光镜观察。右肺称重后置80℃烤箱内烘干至恒重，计算肺湿/干重比值（R w/d）。

1.3 丝裂原活化的细胞外信号调节激酶1（MEK1）磷酸化水平测定

在注射油酸后2，6，24，72 h，注射生理盐水后2 h，从动物腹主动脉采血，分离血小板，提取血小板蛋白,采用Western blotting技术检测血小板内MEK1的磷酸化水平。

1.4 统计学处理

本文中实验数据均用均数±标准差表示，用Graphpad Prism统计学软件对各实验数据进行分析，各组间比较采用单因素方差分析，对差异显著者用Newman-Kuels q检验进行两两比较，同组数据不同时间点的比较采用配对t检验。检验水准α＝0.05，结果以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物一般状态

实验组大鼠在注射油酸后2～3 min即开始出现呼吸困难，呼吸幅度增大，瘫软无力，活动减少，行走时呈爬行步态，进饮食减少;24 h后动物一般状态好转；至72 h，活动基本恢复正常。对照组无异常变化。

2.2 动物肺系数和肺湿/干重比值变化

动物肺系数和肺湿/干重比值变化见表1。从表中可见，注射油酸后2～24 h，实验组动物体质量、肺系数和肺湿/干重比值均有不同程度增加，以2 h最严重。对照组上述各项均无异常变化。

表1 各组动物肺系数和肺湿/干重比值(±s)

表1 各组动物肺系数和肺湿/干重比值(±s)

注：①OA=Oleic Acid。②*为与对照组相比P≤0.05

NS OA 2 h OA 6 h OA 24 h OA 72 h 354.2±60.2 368.5±46.0 372.8±39.6 406.7±40.0 252.5±5.2 2.2±0.7 4.8±1.1*4.1±0.8*3.6±0.3*2.4±0.3*0.6±0.1 1.3±0.2*1.1±0.1*0.9±0.1*0.9±0.1*3.3±0.3 6.0±0.6*5.6±0.2*5.3±1.4*4.8±0.7*

2.3 肺组织病理学检查

肉眼观察可见，对照组大鼠肺脏呈粉红色，表面光滑，纹理清晰，大小正常；2～24 h实验组大鼠双肺明显肿胀，体积增大，重量增加，外观呈紫红色花斑状；72 h实验组，肺脏肿胀减轻，外观呈灰白色，弹性差。光镜下，对照组大鼠肺组织结构清晰，肺泡腔干净，肺泡壁无增厚；实验组2～24 h各组均有轻重不一的肺泡水肿和间质水肿，肺泡内可见有多量染色深红均一的蛋白渗出物，肺泡、肺间质出血，炎细胞浸润，小血管扩张、充血；72 h组，肺泡腔炎性渗出大部分吸收，肺泡腔缩小，肺泡间隔增厚，炎细胞浸润减轻，纤维组织增生，有微血栓形成。

2.4 血小板内MEK1磷酸化水平变化

各组动物血小板MEK1磷酸化水平如图1所示。与对照组相比，6～72 h实验组动物血小板内蛋白激酶MEK1磷酸化水平明显增高，在72 h表达量最高（P＜0.05）。

图1 各组大鼠血小板MEK1磷酸化水平

3 讨论

ARDS是临床上比较常见的疾病，早期阶段或轻症曾被称为急性肺损伤(ALI)。在美国，每年发病约20万例，死亡率接近50%[2]。它可由多种病因引起，但详细发病机理尚未不清楚。

近年科学界对血小板的功能特性有了不少新的发现，使得人们对血小板在呼吸系统分子和细胞生物学中所起作用的看法发生了改变[3]。除参与止血及血栓形成外，血小板还参与免疫、炎症、动脉硬化、血管生成、淋巴管发育、肿瘤生长及转移等病理过程[4-8]。血小板能表达多免疫受体(例如CD14，TLRs,FcR，CD40等)，释放大量接近活化的细胞因子(如IL1β,MCP-1，TGFβ,CD40L，RANTES等)。这些受体、细胞因子共同使血小板吸引白细胞到血管损伤点，释放炎性因子，产生微颗粒物质，诱发凝血酶的生成。已证明这些过程对脓毒症、动脉粥样硬化、肝炎、急性肺损伤、血管再狭窄和移植排斥反应等疾患的发病过程至关重要[6]。

在生理状态和在ARDS时，血小板、血小板前体与肺有多个级别的交互活动,血小板在ARDS时发生活化并可能在ARDS发病中起重要作用[3,9-10]，但其时血小板活化的具体机制和信号传导通路仍不清楚。丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号通路是细胞跨膜信号转导过程中具有至关重要作用的信号转导系统，由一大群丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶组成。该信号通路存在于许多细胞内，在细胞外刺激信号向细胞及其核内转导并引起细胞发生生物学反应的过程中起重要作用。在高等哺乳类动物的细胞内主要有3条并行的三级联MAPKs信号通路：细胞外调节的蛋白激酶(ERKs)信号通路，c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNKs)信号通路和p38蛋白激酶(p38 kinase，p38 MAPK)信号通路。不同的细胞外刺激使用其中不同的通路，通过各条通路的相互调控而介导不同的细胞生物学反应。

MEK1是ERKs通路上第二级联的一个重要蛋白激酶[11]。它可使丝氨酸/苏氨酸发生磷酸化，选择性地激活ERK1和ERK2。目前有关ARDS时血液循环中血小板内MEK1-ERK1/2信号转导通路的研究报道还很少。本研究结果显示，6～72 h实验组动物血液循环中血小板内MEK1蛋白激酶磷酸化水平明显增高，在72 h表达量最高（P＜0.05）。实验结果说明，ARDS时血小板发生了活化并有MEK1-ERK1/2信号转导通路的启动；该信号转导通路的启动可能参与了血小板的活化过程。我们的研究只是对ARDS时血小板活化信号通路的初步探索，今后还需要大量的实验研究进行深入探讨。

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Study on the Changes of Platelet MEk1 Phosphorylation Levels in Acute Respiratory Distress Syndrome Rats

LIU Hong1，FAN Xiao-zhi1,2，TIAN Xin-qiang1，LI Bing1
（1.Research Institute of Respiratory and Occupational Diseases，Datong University,Datong Shanxi,037009;2.Department of Respiratory Medicine，The Fourth People's Hospital of Linfen,Linfen Shanxi,041000)

Objective To investigate the signal pathway of platelet activation in acute respiratory distress syndrome(ARDS).Methods 30 healthy rats were randomly divided into 5 groups.4 groups of them were as the experimental group,which were made AR⁃DS rat models by intravenous injection of oleic acid(OA,0.25ml/kg).1 of 5 groups was as control group,was injected normal saline(NS)in same dose by intravenous.After injection of oleic acid 2 h,6h,24h,72h,saline 2h,drawing off blood from the abdominal aorta;sepa⁃rating platelets;extractting platelet protein;detecting platelet mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase 1（MEK1）phos⁃phorylation levels by Western blotting method,which is one of major protein kinases in the mitogen-activated protein kinases(MAPKs)signal pathway,to explore the changes of platelet MAPKs signal transduction pathway in ARDS,and the relationship between the changes and the pathogenesis of ARDS.Results Platelet MEK1 phosphorylation levels were significantly increased in 6～72h experi⁃mental animals;the highest expression at 72h(P＜0.05).Conclusion Platelet activation occurs in ARDS;the activation process of plate⁃lets are related with MEK1-ERK1/2 signaling pathway.

acute respiratory distress syndrome（ARDS）;platelet activation;mitogen-activated protein kinases(MAPKs);signal transduction;mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase 1（MEK1）

R563.8

A

1674-0874(2016)05-0046-03

2016-06-16

山西省自然科学基金资助项目[2013011055-5];大同市基础研究项目[2014105-2]

刘宏(1957-)，男，山西大同人，博士，教授，研究方向：内科呼吸系统疾病和职业性肺病。

〔责任编辑 杨德兵〕