掌叶半夏提取物对宫颈癌荷瘤小鼠脾脏免疫的作用

黄海霞　张明星　张　萌　卢　冲　彭　靖　李桂玲

(复旦大学附属妇产科医院中西医结合科-上海市女性生殖内分泌相关疾病重点实验室　上海　200011)



掌叶半夏提取物对宫颈癌荷瘤小鼠脾脏免疫的作用

黄海霞张明星张萌卢冲彭靖李桂玲△

(复旦大学附属妇产科医院中西医结合科-上海市女性生殖内分泌相关疾病重点实验室上海200011)

目的观察掌叶半夏提取物(Pinellia extracts,PE)对HPV+TC-1荷瘤小鼠T细胞免疫应答的作用。方法宫颈癌荷瘤小鼠建模后随分成4组:机对照组(生理盐水,0.2 mL/d，灌胃)、PE低剂量组(10 mg/kg, 0.2 mL/d，灌胃)、PE高剂量组(20 mg/kg,0.2 mL/d，灌胃)、CDDP组(4 mg/kg,0.2 mL/3 d,腹腔注射)。给药期间测瘤、描绘肿瘤生长曲线，21天后处死小鼠并计算抑瘤率,流式细胞术检测脾脏CD4+和CD8+T细细胞以及Th1、Th2、Treg和Th17亚群的比例。结果抑瘤率:CDDP组(29.82%)>PE高剂量组(21.73%)>PE低剂量组(8.23%);PE高剂量组和CDDP组CD4+和CD8+T细胞比例较阴性对照组均显著增多(P<0.01);PE两组Th1比例显著升高、Th2和Th17比例显著下降(呈现剂量依赖性),Treg亚群分泌TGF-减少,而FOXP3水平增高。结论PE能通过诱导CD4+T细胞向Th1型分化,抑制Th1/Th2漂移,改善Treg和Th17的比例,发挥抗肿瘤免疫作用。

掌叶半夏提取物;宫颈癌;TC-1细胞株;细胞免疫

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤,且发病年龄逐渐年轻化,严重威胁女性的生命健康。研究表明高危型人乳头瘤状病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)是宫颈癌发生的最主要病因,其中大多数宫颈鳞癌与HPV16型感染有关。多数宫颈HPV感染可通过机体免疫应答而被清除,但HR-HPV能够通过不同方式逃避宿主的免疫识别,荷瘤机体出现免疫抑制和免疫耐受,主要表现为脾脏内CD4+和CD8+T淋巴细胞比值下降[1-2]。因此,如何激活和增强机体免疫系统,使其特异性地抑制肿瘤细胞的生长,是目前肿瘤领域研究者关注的重点和难点问题。本研究重点关注掌叶半夏脂溶性提取物(Pinellia extracts,PE)对宫颈癌荷瘤小鼠的免疫学影响。CD4+T细胞是效应T细胞的重要成分,根据所产生的细胞因子和效应细胞的生物功能特征,分为Th1、Th2、Treg和Th17亚群。本研究选用IFN-和T-bet代表Th1、IL-4,GATA3代表Th2、IL-17,RoRt代表Th17[3],TGF-和FOXP3代表调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)[4],通过流式细胞术分析PE治疗后荷瘤机体T细胞亚群的改变,推测PE能够通过增强有效的T细胞免疫应答来抑制宫颈癌的生长,为PE用于临床宫颈病变的防治提供实验依据。

材 料 和 方 法

实验材料与试剂细胞株:TC-1细胞[HPV16 E6、E7和ras基因共转化的C57BL/C(H-2b)小鼠肺上皮细胞]由中国科学院上海细胞库提供。动物:6周龄雌性C57BL/6小鼠购自中科院上海实验动物中心,动物合格证号:SCXK(沪)2012-0002,饲养于复旦大学附属妇产科医院动物实验科学部(SPF级)。药物:PE由中科院上海药物所天然药化研究室赠送,用二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO,美国Sigma公司,D-2650)溶解后稀释于无菌生理盐水中,现配现用;顺铂[cis-diamineplatinum(II) dichloride,CDDP,美国Sigma-Aldrich公司,批号:479306],无菌生理盐水稀释后用。主要耗材及试剂:超净工作台(香港Heal Force公司,safe-1200),二氧化碳培养箱(香港Heal Force公司,90/HF240),全自动细胞计数仪(美国Bio-Rad公司,TC-10),微量电子天平(德国Sartorius公司,BSA224S),绝对原点游标卡尺(桂林广陆数字测控股份有限公司,型号:111-101-40),Beckman流式细胞仪。RPMI1640细胞培养液、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)、胎牛血清、胰蛋白酶、二抗(青-链霉素)均购于美国GIBCO公司。免疫荧光抗体:FITC鼠抗CD45,PerCP鼠抗CD4,APC鼠抗CD8,BV421鼠抗IFN-γ,APC鼠抗IL-4,PE鼠抗IL-17,BV421鼠抗TGF-β,PE-Texas鼠抗T-bet,Alexa Fluor®647鼠抗GATA3,PE 鼠抗RoR γt,BV421鼠抗FOXP3,Cell Activation Cocktail (含BFA),FOXP3 Fix/Perm 缓冲液(4x)均购于北京达科为生物技术有限公司。免疫组化抗体:鼠抗T-bet (ab91109)、兔抗GATA3 (ab199428)、兔抗RORgama (ab78007)和鼠抗Foxp3 (ab20034)均为英国Abcam公司产品。

细胞培养取出冻存于-80 ℃冰箱中的宫颈癌TC-1细胞,快速复苏后用RPMI 1640培养液(含10%胎牛血清+1%二抗)培养,置于5%CO2、37 ℃、饱和湿度孵箱常规培养,待细胞处于对数生长期,用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化细胞并常规传代。

荷瘤小鼠建模、分组及药物处理C57BL/6雌小鼠适应环境7天后右侧颈背部备皮,取对数生长期的TC-1细胞用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化后228×g离心3 min,用无血清RPMI 1640培养液配置成1×106个/mL单细胞悬液,消毒备皮区后用1 mL注射器每只皮下接种0.2 mL。接种后6天瘤体直径长到约6 mm,随机将其分成4组(8～10只/组)并药物处理21天。阴性对照组:生理盐水(NS)0.2 mL/d,灌胃;PE低剂量组:10 mg/kg,0.2 mL/d,灌胃;PE高剂量组:20 mg/kg,0.2 mL/d,灌胃;CDDP阳性对照组:4 mg/kg,0.2 mL,3天腹腔注射1次。

观测指标给药后每3天称重1次,用以评估药物毒性;每5天游标卡尺测量肿瘤大小,制绘肿瘤生长曲线。计算肿瘤体积(mm3)=长径(mm)×短径2(mm)/2。

给药结束后,颈椎脱臼法处死小鼠,75%酒精消毒皮肤毛发10 mim,无菌操作下获取小鼠完整的皮下移瘤和脾脏,冰上操作,肿瘤拍照、称重并记录,计算抑瘤率=(阴性对照组平均瘤重-用药组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重×100%。切取1/4瘤块放入4%甲醛溶液固定后石蜡包埋,HE染色,2 μm连续切片,备用。

制备单细胞悬液每只小鼠脾脏独立无菌操作,置于RPMI 1640培养液(含10%胎牛血清+1%二抗)中研碎,400目筛网过滤,细胞悬液329×g离心5 min后PBS洗涤2次,每份细胞调整浓度至6×106个/L后加入适量Cell Activation Cocktail,置于5%CO2、37 ℃、饱和湿度培养箱培养6 h。

样本检测每个样本平分3管(A、B、C),每组8个样本,其余样本用于建立空白对照管和单色荧光素对照管。PBS洗涤2次(228×g,5 min),按说明书用量加入CD8/CD45/CD4抗体,混匀,4 ℃避光静置30 min。PBS洗涤2次(228×g,5 min),加入适量FOXP3 Fix/Perm缓冲液(1×),混匀,室温避光静置30 min。PBS洗涤2次(228×g,5 min)。A、B组按说明书用量分别加入IFN-γ/IL-17和IL-4/TGF-β抗体,4 ℃避光静置30 min。C组继续加入适量FOXP3 Fix/Perm缓冲液(1x),混匀,室温避光20 min,PBS洗涤2次(228×g,5 min),按说明书用量加入T-bet/GATA3/RoRγt/FOXP3抗体,混匀,4 ℃避光静置30 min。PBS洗涤2次(228×g,5 min),用Beckman流式细胞仪检测和Flowjo软件分析。

免疫组化SP法烤片:60 ℃烤片2 h。脱蜡及水化:二甲苯10 min×2次,梯度浓度乙醇水化(100%乙醇2次,95%乙醇2次,75%乙醇1次,各5 min),PBS洗3 min×3次。灭活内源性过氧化物酶:3%H2O2孵育10 min,PBS洗3 min×3次。抗原修复:电磁炉0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液(pH=6.0)进行抗原修复25 min。室温自然冷却,PBS洗3 min×3次。封闭:滴加封闭液室温孵育20 min,甩干,不洗。一抗按说明书稀释后滴加,4 ℃过夜,次日室温复温1 h,PBS洗3 min×3次。滴加二抗,室温孵育1h,PBS洗3 min×3次。光镜下DAB显色满意后,自来水冲洗。苏木精复染2 min,自来水冲洗1 min,1%盐酸乙醇分化10 s,自来水冲洗2 min,冰水返蓝2 min。封片:逆梯度浓度乙醇脱水后,二甲苯5 min×2次,中性树胶封片。

结　　　果

小鼠成瘤率、肿瘤生长情况及抑瘤率小鼠在接种TC-1细胞悬液后5～7天即可见明显皮下瘤结节,成瘤率97.5% (39/40),结果显示,用药结束后各组小鼠移植瘤体积和离体瘤重量变化为:阴性对照组>PE低剂量组>PE高剂量组>CDDP组(图1A、C),和阴性对照组比较,PE高剂量组和CDDP组抑瘤效果较好,差异有统计学意义(P<0.05。比较各组小鼠除瘤后净重(给药结束后小鼠体质量-离体瘤重量)发现,在统计学上CDDP组小鼠净重较其余3组均显著下降(P<0.01,图 1B),推测与其较强的细胞毒性有关。肿瘤抑制率比较(表1):CDDP组>PE高剂量组>PE低剂量组。

(1)vs.Control group, P <0.05;(2)vs.CDDP group, P <0.05.TIR:Tumor inhibitory rate.

各组小鼠脾脏T淋巴细胞的比例本实验小鼠接种TC-1细胞,药物处理21天后检测淋巴细胞数发现:阴性对照组

Th1、Th2、Treg和Th17的水平采用流式细胞术进一步检测T细胞亚群在各组中的变化。结果发现,相比于阴性对照组,PE两组Th1比例显著升高、Th2和Th17比例显著下降(呈现剂量依赖性),CDDP组Th1和Th2比例均显著下降(P<0.01,图 3、4)。但PE低剂量组和阴性对照组IFN-水平及PE低剂量组和PE高剂量组IL-4表达(图 3)差异无统计学意义。相比于阴性对照组,在流式分析Treg亚群时发现,细胞因子TGF-和转录因子FoxP3水平变化趋势不一致,提示该两类指标在抗肿瘤中的角色不同。各组间TGF-水平均数比较:CDDP组>阴性对照组>PE高剂量组>PE低剂量组,PE组和阴性对照组差异均无统计学意义,但PE低剂量组相比CDDP组显著低表达TGF-(P<0.05)。各组间FoxP3水平均数比较(图 4):PE高剂量组>PE低剂量组>阴性对照组>CDDP组,相比阴性对照组和CDDP组,PE低剂量组和PE高剂量组均显著高表达FoxP3 (P<0.01),呈现剂量依赖性。

A:Subcutaneous transplantation tumor growth curve;B:Weight challenge of the mice eliminated the tumor;C:Photograph of tumor node.vs.control group,(1)P <0.05,(2)P <0.01.

图1各组小鼠皮下移植瘤生长情况及体重变化

Fig 1Changes of tumor size and the weight of mice in different groups

Plot individual values indicated the total cellularity of T lymphocytes in mice′s sleepn from flow cytometer (A) and the proportions of CD4+ and CD8 +T cells,respectively (B,C)(n=8 for each group).(1)P <0.05,(2)P <0.01.

图2各组小鼠脾脏T淋巴细胞的比例

Fig 2Proportions of T lymphocytes in mice′s spleen of different groups

Flow cytometer analyzing the expression of cytokines as IFN-(represented Th1 subset),IL-4 (represented Th2 subset),TGF-β (represented Treg subset) and IL-17 (represented Th17 subset) in CD4+ T cell of the mice′s spleen in different groups.(1)P <0.05,(2)P <0.01.

图3给药后IFN-、IL-4、TGF-和 IL-17水平比较

Fig 3Comparison of IFN-γ,IL-4,TGF-β and IL-17 levels after administration

Flow cytometer analyzing the expression of cytokines as T-bet (represented Th1 subset),GATA3 (represented Th2 subset),RoRγt (represented Th17 subset) and Foxp3 (represented Treg subset) in CD4+ T cell of the mice′s spleen in different groups.(1)P <0.01.

图4给药后T-bet、GATA3、RoRγt和Foxp3水平比较

Fig 4Comparison of T-bet,GATA3,RoRγt and Foxp3 levels after administration

病理形态学变化HE染色显示(图5)小鼠荷瘤后脾脏形态破坏、白髓区淋巴小结结构不清，PE低剂量组、PE高剂量组和CDDP组脾脏形态逐渐恢复,白髓区淋巴结形态逐渐清楚。免疫组化结果进一步提示(图5),相比对照组,PE低剂量组和PE高剂量组T-bet表达显著升高而GATA3表达明显下降(均呈现剂量依赖性)，FoxP3和RORγt表达也显著下降(P<0.05)。但是组间RORγt表达差异无统计学意义。CDDP组T-bet表达与对照组比较无明显差异(P>0.05)，GATA3、FoxP3和RORγt变化趋势同PE组(P<0.01)。

(1)P<0.05,(2)P<0.01.

图5小鼠脾脏组织HE染色和免疫组化结果分析(×400)

Fig 5HE staining and immunohistochemical analysis of mice′s spleen (×400)

讨　　　论

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤,在发展中国家每年宫颈癌新增病例约10万,死亡人数约3万,发病率和死亡率在妇科恶性肿瘤中均占据首位,且发病年龄逐渐年轻化,严重威胁女性的生命与健康[5]。研究已明确HPV是宫颈癌发生的主要病因,宫颈鳞癌多与HPV16型相关。多数宫颈 HPV 感染可通过体液和细胞免疫应答而被清除,但免疫缺陷是高危型HPV感染持续存在的重要特点,在某些情况下,HPV(+)肿瘤能够通过多种机制逃避机体免疫系统的攻击,如肿瘤细胞免疫原性下降、产生血清封闭因子、CD4/CD8 倒置、Th1/Th2 漂移、分泌免疫抑制因子等[6]。以宫颈癌疫苗为代表的免疫治疗虽然正在进行临床前或临床试验,但现阶段疫苗的发展仍面临着一些挑战:肿瘤治疗性疫苗的作用机制不同于细胞毒药物,其特殊之处在于诱导特异性抗肿瘤免疫反应须经一定的时间,才能转化为临床效应;并且复发或转移的患者通常都接受了多轮治疗,可能影响免疫系统,降低疫苗疗效[7];其次,Treg产生的免疫抑制[8]也是目前宫颈癌免疫治疗面临的瓶颈,使得宫颈癌疫苗在最初临床试验中未获得预想结果。此外,如何提高疫苗的安全性和免疫原性等问题也是HPV 治疗性疫苗上市之前亟待解决的问题。

因此,寻找一种能安全有效防治女性宫颈病变的纯中药制剂,是现阶段国内中药领域的迫切任务。掌叶半夏,即虎掌(Pinellia pedatisecta Schot),天南星科半夏属植物,取块茎干燥入药,主要分布于河北和长江流域及西南各地。20世纪70年代,复旦大学附属妇产科医院率先开展掌叶半夏在宫颈癌治疗方面的临床研究,证实其抑瘤效果确切,且未发现毒性作用和不良反应[9]。随后,本课题组研究PE在体外抑制宫颈癌细胞株增加的作用及机制,证实PE可以通过抑制ERK磷酸化、抑制Bcl-2和PCNA的表达、抑制病毒癌基因E6的表达、上调抑癌基因P53的表达等途径来抑制宫颈癌细胞株CaSki和HeLa的增殖并促进细胞凋亡[10]。本课题组进一步证实PE能够抑制CaSki裸小鼠皮下移植瘤的生长,推荐灌胃途径作为体内试验最佳给药方式[11]。

本研究关注PE对正常免疫功能荷瘤小鼠体内免疫的影响。实验选用宫颈癌TC-1细胞株种植于野生型C57BL/6小鼠右侧颈背部皮下,建立正常免疫功能荷瘤小鼠模型,用于模拟正常机体患HPV(+)肿瘤后免疫功能状态的改变。由于中药的抗肿瘤或免疫作用与剂量有关,对不同动物不同瘤株的抗肿瘤作用也不同,只有在最佳剂量和最佳给药时间,才显示出明显活性。因此,本研究设立高低不同剂量的实验组,成瘤后给药21天。结果发现,与阴性对照组比较,PE高剂量组能够较好地延缓小鼠皮下移植瘤的生长,PE高剂量组抑瘤率仅次于CDDP组。CDDP组用药后小鼠体质量明显下降,这可能与其作用机制有关:CDDP属细胞周期非特异性药物,具有细胞毒性,可抑制癌细胞的DNA复制过程,并损伤其细胞膜上结构。本研究还发现PE能增强小鼠脾脏T辅助细胞和细胞毒性T细胞的浸润,提示PE能够增强机体细胞免疫在抗肿瘤中的关键作用。在宿主体内对肿瘤的免疫应答是细胞免疫和体液免疫的综合结果,但细胞免疫是抗肿瘤的主力。CD8+CTL介导的细胞免疫是肿瘤免疫的主力,CD4+T细胞主要通过Thl亚群辅助CD8+细胞毒性T细胞活化,也可通过分泌IL-4为主的Th2亚群介导抗胞外感染的体液免疫反应,在多种炎症性疾病、免疫性疾病、肿瘤性疾病等的发生发展中起到重要作用[12]。CD4-T细胞亚群新成员Th17,特征性分泌IL-17、表达特异性转录因子RoRγt,具有强大的促炎作用[13]。Treg分泌抑制性细胞因子——转化生长因子(TGF-),特征性表达转录因子Foxp3,有着强大的免疫调节作用,介导外周免疫耐受,在肿瘤的发生发展中也发挥着重要作用[14]。

在HPV感染阶段,Th1/Th2、Th17/Treg比值保持动态平衡;在子宫颈上皮内瘤变阶段,开始出现Th1/Th2、Th17/Treg的平衡失调,并随着疾病进展,失衡加重;在浸润性宫颈癌阶段,机体内存在显著的免疫失衡,具体表现为:宫颈癌患者外周血中Th1水平明显降低,Th2比率上升,Th17、Treg比例上调,并随着疾病进展逐步积聚[15-16]。而本研究发现,PE可诱导小鼠脾脏CD4+T细胞向分泌IFN-的Th1型分化,降低分泌特征性IL-4的Th1型细胞比例,改善Th1/Th2之间的平衡,同时改善Treg和Th17比例,使Th17细胞分泌IL-17减少、下调特异性转录因子RoRt;抑制Treg分泌细胞因子TGF-、下调转录因子Foxp3。而流式细胞术检测结果提示PE上调小鼠脾脏细胞内Foxp3水平。众所周知,Foxp3是外周血CD4+CD25+Treg的特异性标志,其在Treg的分化发育及其介导的肿瘤免疫逃逸中发挥关键作用。但近年来发现,肿瘤内浸润的Foxp3+T细胞在不同种类的癌症中表现不同,有研究表明其与肝细胞癌预后不良有关,但能提示结直肠癌良好预后[17]。在神经胶质瘤中,Foxp3还表达于肿瘤细胞及部分正常组织细胞中,并发挥抑制肿瘤作用[18]。因此,对于在移植瘤体内Foxp3表达变化趋势对宫颈癌预后的影响,还有待进一步的研究证实。综上所述,本研究证实PE能够通过诱导CD4+T细胞向Th1型分化,抑制Th2型分化,在一定程度上改善Treg和Th17的比例,使其在抗肿瘤免疫中更好的发挥应答反应,为掌叶半夏在宫颈癌的临床应用奠定理论基础。

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E-mail:fckzxy@126.com

Effects of Pinellia extracts on immune responds of spleen in cervical cancer-bearing mice

HUANG Hai-xia, ZHANG Ming-xing, ZHANG Meng, LU Chong, PENG Jing, LI Gui-ling△

(Department of Integrated Traditional and Western Medicine,Obstetrics and Gynecology Hospital,Fudan University- Shanghai Key Laboratory of Female Reproductive Endocrine Related Diseases,Shanghai 200011,China)

ObjectiveTo observe the role of Pinellia extracts (PE) in T cells immune response of the C57BL/6 mice bearing HPV+TC-1 tumor.MethodsAfter randomization and administration in cervical cancer-bearing mice,tumor volume was calculated and the growth of tumor was completed.After transplanting subcutaneous tumor,the mice were randomly divided into 4 groups: control group (normal saline,0.2 mL/d, gavage), PE-low group (10 mg/kg,0.2 mL/d,gavage),PE-high group (20 mg/kg,0.2 mL/d,gavage),and CDDP group (4 mg/kg,0.2 mL/3d,peritoneal injection).Besides,the jobs of calculating the volume of the tumors and drawing tumor growth curve were done.The tumor inhibitory rate was calculated after continuous dosing for 21 days,and the percentages of CD4+,CD8+ T cells and Th1,Th2,Treg and Th17 subgroup in the spleen was detected by flow cytometry.ResultsThe order of tumor inhibitory rate was:CDDP group (29.82%)>PE high dose group (21.73%)>PE low dose group (8.23%).Compared with control group,the percentage of CD4+ and CD8+ T cells of PE high dose group and CDDP group were significantly increased (P< 0.01).In both PE groups,the proportions of Th1 and Th17 were significantly increased,while Th2 significantly decreased (in dose-dependent manner).Treg subsets secreted less TGF-β,while FoxP3 level increased.ConclusionsThrough inducing the differentiation of CD4 + T cells to Th1 model,inhibiting the drift of Th1/Th2 and regulating the proportion of Treg and Th17,PE could play an important role in anti-tumor immunity.

pinellia extract fraction;cervical cancer;TC-1 cell line;cellular immunity

R711.74, R737.33

Adoi: 10.3969/j.issn.1672-8467.2016.05.005

2016-03-29;编辑:王蔚)

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (8137386) and the Key Project of Shanghai Municipal Health Bureau (2013).

国家自然科学基金(8137386);上海市卫生局重点项目(2013)