活化的大鼠肝星状细胞赖氨酸乙酰化蛋白质组学分析

翟颖真　丁　笛 　侯陈建 　陶丽丽 　刘秀萍 ,3 △

(1复旦大学基础医学院病理学系　上海　200032; 2复旦大学附属中山医院病理科　上海　200032;3复旦大学附属上海市第五人民医院病理科　上海　200240; 4北京大学深圳医院病理科　深圳　518000)



活化的大鼠肝星状细胞赖氨酸乙酰化蛋白质组学分析

翟颖真1丁笛2侯陈建1陶丽丽4刘秀萍1,3 △

(1复旦大学基础医学院病理学系上海200032;2复旦大学附属中山医院病理科上海200032;3复旦大学附属上海市第五人民医院病理科上海200240;4北京大学深圳医院病理科深圳518000)

目的对活化的大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)进行赖氨酸乙酰化(lysine acetylation,Kac)蛋白质组学分析。方法于清洁级雄性SD 大鼠中提取并培养原代HSCs,分为对照组(培养<2天)和活化组(培养≥10天)。对两组细胞进行裂解,iTRAQ/TMT标记后的成对肽段样品采用乙酰化抗体进行亲和富集,应用高分辨率LC-MS/MS技术进行质谱鉴定。最后对质谱鉴定的乙酰化蛋白质进行生物信息学分析。结果应用LC-MS/MS技术、GO注释和KEGG通路等生物信息学分析方法,共确定309种蛋白质中的470个Kac位点。对其中150个蛋白质的231个Kac位点进行肽段定量研究,与静息的HSCs相比,在活化的HSCs中有109个蛋白质的乙酰化肽段数目增加,18个蛋白质的乙酰化肽段数目减少,并涉及多种GO分类和KEGG通路。乙酰化蛋白质广泛定位于胞质(38.1%)和线粒体(30.2%)。基于GO富集的聚类分析显示Kac位点主要与能量代谢相关;基于KEGG通路的聚类分析显示这些蛋白质广泛参与三羧酸循环,与线粒体关系密切。结论首次对HSCs的Kac蛋白质进行质谱分析,并对发生乙酰化的蛋白质位点进行量化鉴定,为揭示蛋白质乙酰化在HSCs活化过程中的作用提供了一定的基础,并为抑制肝纤维化提供了潜在的分子靶标。

肝星状细胞;赖氨酸乙酰化;LC-MS/MS;翻译后修饰;大鼠

赖氨酸乙酰化(lysine acetylation,Kac)是一种蛋白质中普遍存在、可逆的翻译后修饰(posttranslational modification,PTM),首次于组蛋白中发现。之前对于Kac的研究主要集中于组蛋白,已经确定的多种乙酰化修饰功能同样源自于组蛋白研究。组蛋白在乙酰化转移酶和去乙酰基酶作用下,产生不同的乙酰化修饰并调节多种生物学功能[1],包括基因表达调节[2]、染色体重构[3-4]及细胞寿命[5]。目前,越来越多的研究已发现非组蛋白同样具有Kac现象,并调节多种重要的细胞生理功能[6-7]。肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)活化是肝纤维化发生的中心环节,经常作为潜在的治疗靶点[8-9]。最近的研究表明,蛋白质乙酰化修饰可能在HSCs活化过程中起到重要作用[10-12];不同类型的去乙酰基酶抑制剂(如曲古霉素A[11]、丙戊酸[10]及Givinostat[13])可以抑制稳定状态的HSCs向纤维母细胞的转化,并且可以抑制平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达。

目前蛋白质组学注释多通过生物信息学预测得出,对相关蛋白质的注释可能不全面或存在遗漏,而且尚未见HSCs乙酰化蛋白质组学的相关研究。本研究以HSCs为研究对象,应用同位素标记的相对和绝对定量/串联质谱标签(isobaric tag for relative absolute quantitation/tandem mass tags,iTRAQ/TMT)技术,结合液相二级质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)进行高通量Kac质谱分析。为进一步探析蛋白质乙酰化在HSCs激活过程中是否存在相关作用提供基础,同时也为进一步完善HSCs蛋白组学信息及挖掘潜在肝纤维化治疗靶点提供有价值的数据。

材 料 和 方 法

大鼠原代HSCs分离取成年雄性SD大鼠,体质量250～350 g,由复旦大学实验动物部提供。通过链蛋白酶、胶原酶两步体内门静脉灌注,消化大鼠肝脏组织,经Histodenz密度梯度离心分离HSCs。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活力,α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白、结蛋白免疫荧光细胞化学染色(Desmin染色)鉴定细胞纯度。HSCs得率为6.25×106个/g。细胞存活率在90%以上。光镜(×200)下观察,Desmin染色阳性细胞原代培养达90%以上,传代培养达95%以上。

TMT标记样本细胞经蛋白质提取及胰蛋白酶消化后,进行TMT(美国Thermo公司),最小肽段长度为7个氨基酸。在0.5 mol/L TEAB中,将来自于两份样本中的肽段与混合的TMT反应物重新组合(不同的标记物标记不同样本),室温孵育1 h。标记后合并两份肽段混合物样本,室温孵育2 h,最后用Strata X C18 SPE柱 (美国Phenomenex公司)萃取脱盐,采用真空离心法干燥。

HPLC分馏与亲和富集通过Agilent 300 Extend C18柱(颗粒直径5 μm,柱直径4.6 mm,长度250 mm)的高pH反相HPLC,将干燥的肽段分馏为不同的小片段。为了富集Kac肽段,将胰蛋白酶分解形成的肽段溶入NETM缓冲液(含100 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、50 mmol/L Tris-HCl和0.5% NP-40,pH=8.0),并用预洗抗体珠(美国PTM Biolabs公司)孵育,置于低速摇床,4 ℃过夜。将抗体珠用NETN缓冲液冲洗4次,ddH2O冲洗2次,用0.1%TFA将绑定的肽段从抗体珠上洗脱。洗脱的肽段进行组合,真空干燥。最终得到的多肽用C18 ZipTips(美国Millipore公司)进行清洗,经LC-MS/MS分析。

LC-MS/MS分析肽段溶解于0.1%甲酸,直接加样于反相前置柱(Acclaim PepMap 100,美国Thermo公司)。应用反相分析柱(Acclaim PepMap RSLC,美国Thermo公司)进行肽段分离。经溶剂B(0.1% 甲酸+98% 乙腈)在梯度6%～22%持续24 min,22%～36%持续8 min,之后4 min内攀升到80%,并在80%维持至少4 min。整个过程于EASY-nLC 1000 超高相液相色谱(UPLC)系统中进行,恒定流速为280 L/min(0 ℃,1个标准大气压)。

采用Q Exactive-TMplus hybrid quadrupole-Orbitrap质谱仪(美国Thermo公司)对分离出的肽段进行分析。

MS/MS数据分析MS/MS数据结果采用Max Quant分析软件与Andromeda 搜索引擎(v.1.4.1.2)联合分析。串联质谱结合反向诱饵数据库对大鼠数据进行搜索。胰蛋白酶/P规定为切断酵素最高丢失值为3,每个肽段具有4个修饰位点和5个电荷。蛋白质、肽段、修饰位点的错误发现率(false discovery rate,FDR)规定为1%。最小肽段长度设置为7。采用TMT-6-plex定量评值方法,Max Quant软件中的其他参数设为默认值,位点定位可能性设为>0.75。

生物信息学分析基因本体论(gene ontology,GO)注释应用于富集的蛋白质种类分析。主要从细胞组分、分子功能和生物学过程3个方面进行分类注释。对于已经确定而未被UniProt-GOA 数据库注释的蛋白质则应用Inter ProScan软件,基于蛋白质的氨基酸序列对齐方法进行GO注释。Kac蛋白质的京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路绘制应用KEGG线上服务工具KAAS进行。Fisher′s 修正P<0.05为有意义富集。采用亚细胞定位预测软件wolfpsort预测亚细胞结构定位。除此之外,在GO注释、KEGG通路与蛋白质结构域分析的基础上各自进行再次功能富集,最后在富集基础上进行聚类分析。

结　　　果

HSCs中Kac蛋白质的确定和分析质谱分析可快速确定并精确量化上千种蛋白质,并可分析HSCs激活过程中蛋白质修饰的动态变化。聚苯乙烯皿中培养的原代HSCs可自行活化,并出现纤维母细胞的一些生物学特征,可作为一种体外HSCs活化模型[14]。由于HSCs分离比较困难,且需要大量的蛋白质用以蛋白质组学对比分析,因此对于HSCs活化细胞蛋白质组学的研究还非常有限。

现有的静息与活化的HSCs对比性蛋白质质谱分析于2000年完成。Kristensen等[15]于活化的HSCs中确定了43种表达改变的蛋白质,并首次提供了HSCs蛋白质组学分析,包含150种蛋白质。随着稳定同位素标记和蛋白质鉴定技术的发展,JI等[16]于2014年对HSCs活化过程中蛋白质组学进行了研究,共测定2 417种蛋白质,并对其中2 322种蛋白质进行了量化。但至今仍缺乏HSCs活化过程中乙酰化蛋白质修饰研究。本研究通过乙酰化肽段的选择性富集、超高分辨质谱(Orbitrap)和生物信息学分析鉴定乙酰化蛋白质。蛋白质乙酰化分析的主要环节为(图1):(1) 由大鼠肝脏提取的原代HSCs制备一组活化与未活化HSCs对照细胞样本,并用胰蛋白酶进行消化,经iTTRAQ/TMT标记,应用抗乙酰化抗体进行肽段分离;(2) 将分离后的乙酰化肽段经HPLC-MS/MS进行质谱分析;(3) 乙酰化位点先通过序列对比,再根据蛋白质功能、所关联的通路及相互作用网络提示的蛋白质乙酰化特质来确定。

Whole-cell extracts were prepared from primary and activated HSCs.Then immune-affinity enrichment and high-sensitivity mass spectrometry were followed by bioinformatical analysis.

图1HSCs中Kac蛋白质肽段鉴定流程图

Fig 1Process chart of identifying Kac peptides in HSCs

本研究共确定了470个乙酰化位点,对应于309个不同蛋白质。并对其中的150种蛋白质进行了量化分析,最终确定109种蛋白质乙酰化肽段数目增多(活化/静息>1.3),18种蛋白质乙酰化肽段数目减少(活化/静息<0.77)。平均每个HSCs乙酰化蛋白质包含约1.5个乙酰化位点。乙酰化位点的数量分布显示(图2A):超过70%的蛋白质包含1个乙酰化位点,约30%的蛋白质在多个赖氨酸位点出现乙酰化修饰。另有34个存在高度乙酰化的蛋白质拥有3个以上的乙酰化位点,包括组蛋白 H2A,其乙酰化位点位于第4、7、11个赖氨酸位点(图2 B),且在两个结构域范围内。

图3 A选取了蛋白质乙酰化肽段数目显著增多或减少的部分乙酰化蛋白质,可见每个蛋白质的乙酰化位点个数及乙酰化肽段序列。图3B为HSCs蛋白质中新确定的具有代表性的乙酰化细丝蛋白(filamin-α)的MS/MS质谱图,包含2个乙酰化位点,分别为K299和K700。

我们同样对所确定的乙酰化蛋白质亚细胞结构定位进行了分析,结果显示,乙酰化肽段增多的蛋白质(图4 A)、乙酰化肽段减少的蛋白质(图4B)及乙酰化总蛋白质(图4C)都与胞质的联系最为密切,而且50%乙酰化肽段减少的蛋白质都位于胞质中。与乙酰化肽段减少蛋白质相比,乙酰化肽段增多的蛋白质更多集中于线粒体(33% vs.11%)。与对照组相比,部分乙酰化肽段增多的蛋白质位于质膜上,如Q5BJZ3、D3ZXD2和Q62638等;而乙酰化肽段减少的蛋白质则未出现在质膜上。

A:Number of Kac sites identified per protein;B:Annotation of Kac sites in Histone H2A.Z protein.

图2HSCs中蛋白质的乙酰化位点分析

Fig 2Acetylation sites analysis of the proteins in HSCs

乙酰化蛋白质的功能富集分析基于GO注释,我们从细胞组分、分子功能和生物学过程对309种乙酰化蛋白质进行了分类分析。结果显示,乙酰化蛋白质主要分布于细胞亚级(16.2%)、细胞部分亚级(16.2%)及细胞器亚级(15.2%)(图5)。分子功能注释显示,38.5%的蛋白质与绑定功能相关,26.9%的蛋白质与催化活性相关,还有15.4%的蛋白质与结构分子活性相关。生物学过程分析显示,18.3%的乙酰化蛋白质参与细胞学过程,16.7%的蛋白质与单个细胞器过程相关,13.3%的蛋白质与代谢过程相关。GO富集分析表明HSCs中乙酰化蛋白质分布广泛。

根据乙酰化肽段数目变化高低对量化的乙酰化蛋白进行分类:Q1～Q4。GO富集基础上的聚类包括之前进行的细胞组分、生物学过程和分子功能分析(图6)。我们发现大部分乙酰化蛋白质定位于线粒体,如GO富集的线粒体,线粒体膜、线粒体内膜,线粒体基质和线粒体被膜,而这些都是高度富集于Q4的乙酰化肽段数目显著增高的蛋白。线粒体是细胞代谢和能量产生过程中具有中心作用的一个细胞器[17],具有氧化糖类、脂肪酸和氨基酸的能力,并可以通过内膜形成H+梯度来产生ATP。线粒体同时在许多重要的细胞学过程中具有中心作用,包括合成代谢过程中前体的提供及协调核-线粒体交流。此外,乙酰化特异性位点足以改变依赖ATP的核小体的动力学以及染色体重组[18-19]。现今许多对于线粒体的研究已经将蛋白质赖氨酸N-端的乙酰化作为其修饰蛋白质功能的主要调节机制[20]。

A:Identification of the modification sites of HSCs;B:MS/MS spectra of acetylpeptides from filamin-α (C0JPT7).Acetylpeptide AYGPGIEPTGNMVK(ac)K with a Kac site at K299.Acetylpeptide TGVAINKPAEFTVDAK(ac)HAGK with a Kac site at K700.

图3HSCs中蛋白质的乙酰化信息及MS/MS质谱分析

Fig 3Acetylation information and MS/MS spectra of proteins in HSCs

细胞中蛋白质以代谢蛋白质为主,而这些蛋白质多属于线粒体蛋白质[21-22]。这一结果提示线粒体中的乙酰化蛋白质在HSCs活化过程中可能具有相关作用。与乙酰化肽段增多的蛋白质相反,乙酰化肽段减少的蛋白质集中定位于细胞核。乙酰化蛋白质所涉及的生物学过程如图6所示。乙酰化肽段增多的蛋白质(Q3)高度富集于各种代谢生物学过程,包括二羧酸代谢、单个有机体代谢、酮酸代谢、三羧酸代谢及有机酸代谢等,这或许可以揭示激活和代谢调节之间的相互作用。另一方面,乙酰化肽段减少的蛋白质也涉及多种调节过程,如细胞增殖的正向调节、蛋白质磷酸化调节及磷酸化代谢调节过程等。乙酰化肽段增多的蛋白质(Q4)分子功能GO富集聚类比较集中,主要是肽酶活性。

代谢信号通路中的乙酰化作用KEGG通路富集显示乙酰化蛋白质涉及多种信号通路(图7)。许多参与中心性能量代谢通路和氨基酸代谢通路的蛋白质存在乙酰化修饰。具体来说,使用KEGG通路将这些蛋白质富集于相关的信号通路(图7),可见乙酰化蛋白质存在于多种蛋白质和氨基酸的生物合成、三羧酸循环、碳代谢、亨廷顿病、酒精性中毒及黏着斑信号通路。

A:Proteins whose acetylpeptides were increased;B:Proteins whose acetylpeptides were reduced;C:All acetylated proteins.

图4乙酰化蛋白质的亚细胞结构定位

Fig 4Subcellular location classification of acetylated proteins

The cellular components,molecular functions and biological processes of the acetylated proteins in HSCs were analyzed by gene ontology analysis.The column number means acetylated proteins (the ratio of acetylated proteins).

图5乙酰化蛋白的GO富集分析

Fig 5GO enrichment analysis of acetylated proteins

HSCs激活时需要大量的能量来维持其细胞增殖、细胞外基质分泌和细胞收缩等生物学行为[23]。三羧酸循环途径是发生在线粒体中的细胞氧化供能的最终途径,也是糖、脂肪和氨基酸代谢的重要途径[24]。包括三羧酸循环在内的新陈代谢途径的改变是许多疾病发展的重要特点。基因组学研究表明:三羧酸循环中的重要酶——延胡索酸水化酶[25]和异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)[26]及其代谢产物与肿瘤发生相关。

乙酰化肽段水平上调的多种酶参与了三羧酸循环(图8)。包括IDH、丙酮酸脱氢酶、乌头酸水合酶、柠檬酸合酶(citrate synthase,CS)等,共13个。IDH是TCA循环中第2个调节酶,IDH1在线粒体和胞质中都存在,本研究发现其发生了乙酰化并且乙酰化肽段数目明显升高(FDR:2.63735E-8,Fold:4.40),而IDH2只存在于线粒体中,乙酰化肽段数目增高(FDR:2.65831E-20,Fold:2.15)。IDH1和IDH2发生乙酰化且乙酰化肽段数目增加,说明乙酰化的IDH可能参与了HSCs的激活。

有研究表明CS在卵巢癌细胞中高度表达,而CS基因沉默能够抑制细胞增殖并降低细胞侵袭和迁移能力,CS可能是卵巢癌发生发展的潜在调控因素[27]。CS发生了显著的乙酰化肽段数目增加(图8),进而可能影响下一步的脂肪酸代谢及氨基酸代谢。

Kac sites belong to Q1 (0

图6量化的Kac位点的GO富集聚类分析

Fig 6GO enrichment-based clustering analysis for quantified Kac sites

图7KEGG通路富集注释

Fig 7KEGG pathway analysis

经KEGG通路富集结果可见,在发生乙酰化的蛋白中,乙酰化肽段增多的多种蛋白质,如超氧化物歧化酶、连接蛋白3、连接蛋白5和线粒体通透性转换孔,同样参与了多种代谢信号通路,包括氧自由基信号通路、P53信号通路及细胞凋亡等。

讨　　　　论

本研究首次报道了HSCs活化过程中乙酰化蛋白的质信息数据。Kac是一种重要的PTM,可以影响多种代谢通路。本研究结果采用高灵敏度蛋白组学方法确定了HSCs激活过程中发生乙酰化的蛋白质Kac位点,最终于309种蛋白质中确定了470个Kac位点,每种蛋白质所对应的Kac位点数目不同;并对其中的150种蛋白质进行了量化分析。结果显示有109种蛋白质的乙酰化肽段数目显著增多,18种蛋白质的乙酰化肽段数目减少;进一步的功能分析显示乙酰化蛋白质涉及多种特定的功能和生物学过程。在细胞组分富集方面,多种乙酰化蛋白质与线粒体相关;结合生物学过程分析,乙酰化蛋白质涉及大部分能量代谢,提示乙酰化修饰在其他蛋白质生成和氨基酸生成过程中可能也有调节作用。研究显示,主要代谢通路中的蛋白质都存在乙酰化修饰,这些通路包括糖酵解、脂肪酸氧化、三羧酸循环和氨基酸生成,都是HSCs能量代谢网络中非常重要的组分。

本研究是在前期CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT enhancer binding protein,C/EBP)-α乙酰化作用的研究基础上开展的。C/EBP-α对脂肪细胞的分化具有重要的调节作用,经乙酰化抑制剂处理后的HSCs中C/EBP-α蛋白质水平升高,HSCs凋亡增加,平滑肌肌动蛋白与Ⅰ 型胶原蛋白水平降低。干扰C/EBP-α乙酰化位点,经TSA处理后,C/EBP-α蛋白质水平增加现象消失。提示蛋白质乙酰化在HSCs中具有一定的调节作用,进而对HSCs激活过程中的乙酰化作用进行了质谱鉴定分析。

The identified lysine-acetylated proteins that acetyl-peptides increased significantly were shown in red,and the proteins in light turquoise were background.

图8三羧酸循环中涉及的乙酰化酶类及相关通路

Fig 8Acetylate metabolicenzymes and related pathways in TCA cycle

Kac是一种保守的PTM,可以连接Ac-CoA代谢和细胞信号传导[28-30]。线粒体中的乙酰辅酶A合成酶2(Acs2)是一种催化乙酸盐转化成为Ac-CoA的酶类,参与调节脂肪酸代谢过程,Ac-CoA水平能够根据代谢状态的变化而波动[31]。本研究证实了激活的HSCs中Acs2存在乙酰化修饰并伴有乙酰化肽段水平的升高,而同时Acs2的酶活性也受到赖氨酸琥珀酰化的调节[32]。乙酰化修饰是与赖氨酸琥珀酰化修饰相互竞争的,这说明在蛋白质的乙酰化与琥珀酰化之间存在着串扰现象,两者相互作用对细胞的蛋白质活性与代谢通路进行调节

在本研究中,黏着斑的几个组成分子(filamin-α、ILK和actin)同样发生了乙酰化,这可能与活化HSCs产生ECM增多并沉积相关。多个研究表明抑制某些蛋白质的去乙酰化作用可以抑制活化HSCs的增殖,并促进其凋亡[11,13,33]。本研究只是对乙酰化位点和乙酰化肽段数目变化进行了测定,而乙酰化水平的变化还需要参考蛋白质水平的变化。本研究首次在HSCs中探测了蛋白质组学的乙酰化位点修饰,结果提示Kac修饰或许在HSCs活化过程中具有重要的调节作用。

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E-mail:xpliu1228@fudan.edu.cn

Proteomics analysis on lysine acetylation of proteins in actived hepatic stellate cells of rats

ZHAI Ying-zhen1, DING Di2, HOU Chen-jian1, TAO Li-li4, LIU Xiu-ping1,3△

(1Department of Pathology,School of Basic Medical Sciences,Fudan University,Shanghai 200032,China;2Department of Pathology,Zhongshan Hospital,Fudan University,Shanghai 200032,China;3Department of Pathology,The Fifth People's Hospital of Shanghai,Fudan University,Shanghai 200240,China;4Department of Pathology,Perking University Shenzhen Hospital,Shenzhen 518000,Guangdong Province,China)

ObjectiveTo investigate the lysine acetylation (Kac) of proteins in activated hepatic stellate cells (HSCs) of rats.MethodsPathogen-free male SD rats were used for the isolation of HSCs,and the primary cells were divided into control group (< 2 days of culture) and active group (≥10 days of culture).In the two groups,iTRAQ/TMT labeling were performed on the samples,and then the labelled proteins were followed by immune-affinity isolation of acetyl-peptides through anti-acetyl lysine antibodies.2D nano-LC-MS/MS was used to identify acetyl-proteome of HSCs.Finally,the quantitative analysis of acetylation sites and bioinformatics analysis were carried out.Results A total of 309 acetylated proteins with 470 Kac sites were identified in HSCs,of which 150 proteins with 231 Kac sites were quantified.Compared with quiescent HSCs,acetyl-peptides of 109 proteins showed significant increase in activated HSCs,and acetyl-peptides of 18 proteins showed significant reduce in activated HSCs.Bioinformatics and physiological analyses of detected proteins suggested that these acetylated proteins were widely located in cytosol and mitochondria,which contain 38.1% and 30%,respectively.GO enrichment-based clustering analysis indicated that Kac of these proteins may strictly regulate energy metabolism.In addition,KEGG pathway enrichment-based clustering analysis suggested that these protein significantly up-regulated in TCA cycle,which have intense relationship with mitochondria.ConclusionsKac of proteins in HSCs were investigated for the first time,and quantitative comparison of acetyl-proteome before and after HSCs activation were extensively studied in order to reveal the relationship between acetylation and HSCs activation,and to provide the potential target spots to inhibit the fibrosis of liver.

hepatic stellate cell;lysine acetylation;LC-MS/MS;post-translational modifications;rat

R364.2,R34

Adoi: 10.3969/j.issn.1672-8467.2016.05.002

2016-02-22;编辑:段佳)

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81272387,81470857),the Natural Science Foundation of Shanghai,China (134119b1100),the PhD Start-up Fund of Natural Science Foundation of Guangdong Province,China (2015A030310031) and the Research Project of Health and Family Planning Commission of Shenzhen Municipality (201401048).

国家自然科学基金(81272387,81470857);上海市自然科学基金(134119b1100);广东省自然科学基金博士科研启动项目(2015A030310031);深圳市卫计委课题(201401048)