液相色谱-串联质谱法检测黄鱼鲞中硝基呋喃代谢物残留量

王兴进

(宁德市产品质量检验所， 宁德 352100)



液相色谱-串联质谱法检测黄鱼鲞中硝基呋喃代谢物残留量

王兴进

(宁德市产品质量检验所， 宁德 352100)

样品在酸性条件下通过加入邻硝基苯甲醛实现衍生化，乙酸乙酯萃取，浓缩，以乙腈∶水(20∶80)定容和正己烷除脂后，采用液相色谱-串联质谱法检测黄鱼鲞中硝基呋喃代谢物残留量。该方法中4种硝基呋喃代谢物在1～50μg/L浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数均大于0.9971，定量限均为0.5μg/kg。4个添加水平(1μg/kg、2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg)的平均回收率在89.3%～106%之间，相对偏差均小于7.03%。结果表明该方法满足黄鱼鲞中硝基呋喃代谢物的检测要求。

液相色谱-串联质谱法硝基呋喃代谢物黄鱼鲞

大黄鱼作为我国传统的食用鱼类，具有独特竞争优势，是我国八大优势出口养殖水产品品种之一。近年来由于活鱼运输困难以及大黄鱼制品(如黄鱼鲞等)等相对口味较好，加上传统饮食习惯以及产业发展的需求，现在黄鱼鲞等产品的销量不断增加。但是养殖过程中鱼药乃至禁药的滥用，导致了养殖海域的连片污染，严重影响了大黄鱼的质量安全，直接影响了大黄鱼及其制品(如黄鱼鲞等)的出口。

硝基呋喃类药物是一类人工合成的具有广效性的抗菌药物，目前较为广泛使用的硝基呋喃类药物有：:呋喃唑酮(FZD)、呋喃它酮(FTD)、呋喃西林(NFZ)和呋喃妥因(NFT), 其对应的代谢物分别为:3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)、5-甲基-吗啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)和1-氨基-2-内酰脲(A HD)。因这类药物价格低廉且疗效性强，因此常被用于畜禽及水产的养殖过程。当人类摄入了含有硝基呋喃类药物残留的食品后，代谢物在胃液的酸性条件下从蛋白质中释放出来被人体吸收，从而对人体造成一定的伤害，长期食入此类食品会对人体产生慢性毒性和致突变致癌的危险[1-4]。因此，世界各国均严禁在治疗和饲料中使用，美国FDA于2002年禁止了硝基呋喃类药物在食品动物中的使用，欧盟和日本也同样禁止在食品动物中使用，我国农业部也于2002年发布了第193号公告，将硝基呋喃类抗菌剂列入了《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》，明确禁止了硝基呋喃类药物在食用动物中的使用。

目前，硝基呋喃代谢产物残留检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[4-6]、酶联免疫法(ELISA)[3,4]、液相色谱-质谱法(HPLC-MS)[4,7]以及液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[2,4,8，9]检测。其中ELISA法一般用于药物残留的定性分析，实现药物残留的初步筛查，无法满足定量要求，而高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-质谱法(HPLC-MS)方法的灵敏度和选择性都较液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)差，无法满足欧盟EEC/657/2002标准和日本、美国等发达国家对我国出口动物源性食品检测要求。关于硝基呋喃代谢物的测定研究报道大多限于禽兽肉、鲜水产品等的检测[7-10]，对于黄鱼鲞中硝基呋喃代谢物检测的报道相对较少。本实验在酸性条件下通过加入2-硝基苯甲醛实现衍生化，乙酸乙酯两次萃取，正己烷除脂，液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测，同位素标记内标法定量，实现了对黄鱼鲞中硝基呋喃代谢物的检测分析。

1　实验部分

1.1仪器与试剂1.1.1仪器设备

液相色谱-串联质谱仪(Aglient 1290-6460)：配带Jet Stream的电喷雾离子源(ESI)；高速组织捣碎机(德国IKA公司)；旋转浓缩仪(上海亚荣)；Milli-Q超纯水设备(美国Millipore公司)；漩涡混合器(德国IKA公司)；，恒温振荡器(常州国华)；低温高速离心机(德国Sigma公司)；微孔滤膜为0.2μm。

1.1.2试剂与材料

甲醇、乙腈、乙酸乙酯均为色谱纯；甲酸：≥99%；盐酸、氢氧化钠、磷酸氢二钾(均为分析纯)；邻硝基苯甲醛：≥99%，邻硝基苯甲醛溶液用乙腈溶解，现用现配；配制溶液的水为超纯水。

标准品储备液均用甲醇配制，-18℃避光保存(有效期6个月)；工作液用时用储备液稀释，现配现用。

1.2样品前处理

准确称取2g(精确至0.01g)试样于50mL塑料离心管中，加入10mL 甲醇-水混合溶液(1+1，V+V)，超声5 min后，5000r/min离心，弃去上清液。残留物中加入10mL 的0.2mol/L盐酸溶液，均质1min，再用5mL盐酸溶液洗涤均质器刀，合并盐酸溶液，再加入0.2 mL的0.01mg/L的混合内标标准溶液，0.1 mL的0.1mol/L的邻硝基苯甲醛溶液，漩涡混匀器混匀，置于37℃恒温箱中避光反应16h。

取出衍生液，冷却至室温后，加入1.5mL0.3mol/L磷酸钾溶液，用1.0mol/L氢氧化钠调节pH至7.4左右，加入15mL乙酸乙酯涡旋混合1min后，涡旋提取1min后，离心，收集乙酸乙酯层。残留物再加入15mL乙酸乙酯，超声萃取10min，合并两次的提取液，于40℃下氮气吹干。用1.00mL乙腈∶水(20∶80)溶液定容，再加入3mL乙腈饱和的正己烷去除脂肪，下层水相过0.2μm滤膜供液相色谱-串联质谱测定[11]。

1.3仪器条件1.3.1质谱条件

离子源：带鞘气电喷雾离子源(ESI)；毛细管电压：4.00kV；离子源温度：110℃；干燥气温度：300℃；干燥气流量：8L/min；鞘气温度：250℃；鞘气流速：12L/min；碰撞气：氮气；多反应监测扫描模式(MRM),其它质谱参数见表1。

1.3.2色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus(2.1mm×50mm，1.8μm)；流速：0.3mL/min；柱温：30℃；样品室温度：10℃；进样量：10μL；流动相：溶剂A为0.1%甲酸水，溶剂B为乙腈，流动性梯度洗脱程序见表2。

表1　硝基呋喃代谢物及其内标物的质谱参数

表2　液相色谱梯度洗脱程序

2　结果与讨论

2.1质谱条件的优化

硝基呋喃4种代谢物(AOZ、 AMOZ、 SEM、 AHD)分子结构中均含有氨基，在电离情况下容易获取正电荷，因此选择正离子模式进行扫描。在正离子检测方式下，先对各化合物进行全扫描，以确定四个化合物的母离子，再采用子离子扫描，得到碎片离子信息和二级质谱图。同时对碎裂电压和碰撞能量进行优化，使得母离子和特征子离子强度达到最大，确定的最佳质谱参数见表1。

由于基质效应的影响，在采用液相色谱-串联质谱法检测时，目标化合物会发生离子增强或抑制的作用。因此，本方法通过添加内标的方式来减弱离子化时的基质效应，分别采用D5-AMOZ、13C3-AHD、13C15N2-SEM、 D4-AOZ作为内标定量，从而使定量结果更加准确。

2.2色谱条件的优化

比较了两种不同流动相乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水对目标物的分离度和灵敏度的影响，实验结果表明，乙腈-0.1%甲酸水作为流动相进行梯度洗脱时，4种代谢物的衍生物可得到较好的分离和响应。确定的最佳的色谱参数见表2。

2.3方法验证2.3.1标准曲线及检出限

在确定的色谱和质谱条件下， 4 种硝基呋喃代谢物在 1.0 ng/mL～ 50 ng/mL(内标物浓度为4ng/mL)范围内线性良好，相关系数均大于0.9971，见表3。以3倍信噪比(S/N)计算4种硝基呋喃代谢物的检出限为0.2 μg/kg，以10倍信噪比确定其定量限为0.5μg/kg。4种硝基呋喃代谢物衍生物的MRM谱图见图1。

表3　种硝基呋喃代谢物的线性方程与相关系数

2.3.2回收率及精密度

选取咸香大黄鱼和醉香大黄鱼两种黄鱼鲞进行回收率及精密度实验，准确称取空白黄鱼鲞样品2.00g，分别添加1μ g/kg、2μ g/kg、5μ g/kg及10μ g/kg 4个浓度的硝基呋喃代谢物混合标准溶液及2μ g/kg的内标混合标准溶液，其中不同添加量的重复样品数为6。按照本实验建立的方法测定添加样品中硝基呋喃类代谢物的残留量。计算平均回收率和相对偏差,结果见表4。从表4中可以看出，4种硝基呋喃代谢产物的平均回收率在89.3%～106%之间，相对标准偏差RSD均小于7.1 %。表明该方法完全满足硝基呋喃类药物的检测要求。

表4　4种硝基呋喃代谢物的平均回收率和相对标准偏差(n=6)

2.4实际样品检测

采用已建立的方法对市场上采集的60份黄鱼鲞样品进行硝基呋喃代谢物残留量的检测分析，结果表明， 57份硝基呋喃代谢物均未检出，3份样品检出SEM，但是检出值均小于定量限(0.5μg/kg)。

3　结论

研究了采用高效液相色谱串联质谱法检测黄鱼鲞中的硝基呋喃代谢物产物的残留量，并进行了方法学评价，结果表明该方法的回收率为89.3%～106%，相对标准偏差均小于7.1% ，检出限均为0.5μg/kg。本方法可有效用于黄鱼鲞中硝基呋喃代谢物残留的检测。

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Determination of nitrofuran metabolites residues in dried salted yellow croakers by HPLC-MS/MS.

Wang Xingjin

(NingdeQualityInspectionInstituteofProduct,Ningde352100,China)

The samples were derived with 2-nitrobenzaldehyde in hydrochloric acid solution. After extracted with ethyl acetate and concentrated with rotary evaporator,the analytes were dissolved with acetonitrile solution (CH3CN:H2O=20:80), defatted with n-hexane and determined by LC-MS/MS. The results showed that the calibration curves for the analytes exhibited good linearity over the concentration range from 1 to 50 μg/L with the LOQ of 0.5μg/kg . Average recoveries for the spiked samples at 4 levels (1μg/kg, 2μg/kg, 5μg/kg, 10μg/kg) ranged from 89.3% to 106%, with a RSD less than 7.03%. The method is suitable for the determination of nitrofurans metabolites in dried salted yellow croakers.

HPLC-MS/MS; nitrofuran metabolites;dried salted yellow croakers

福建省质量技术监督局科技项目(FJQI2013112)

王兴进，男，1970年出生，学士，高级工程师，主要从事食品质量控制和卫生检测，E-mail: quikenter@163.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.05.004

2016-05-14