凝胶渗透色谱-高效液相色谱法测定食用菌中呋喃丹农药残留

冯晓青　汪　怡　王　芹　王　露　宋　鑫　徐　瑞　杭学宇

(淮安市疾病预防控制中心，淮安 223001)



仪器应用

凝胶渗透色谱-高效液相色谱法测定食用菌中呋喃丹农药残留

冯晓青汪怡王芹王露宋鑫徐瑞杭学宇*

(淮安市疾病预防控制中心，淮安 223001)

建立了凝胶渗透色谱净化高效液相色谱法检测食用菌类中呋喃丹农药残留量的方法。 样品经乙腈提取，氮气吹干，环己烷-乙酸乙酯(1∶1，V/V)溶液溶解后，凝胶渗透色谱进行净化，C18反相高效液相色谱柱分离后，采用液相色谱荧光检测器进行测定，外标法定量。 呋喃丹在0.2～5.0 ng/mL质量浓度范围内呈良好线性关系，相关系数r大于0.999，测定低限为0.01 mg/kg。对空白食用菌样品进行3个浓度水平0.5、1.0和2.0 mg/kg的加标回收试验，呋喃丹的加标回收率为78.3%～97.6%，相对标准偏差(RSD)为3.26%～11.69%。 本实验所建立的方法简单, 灵敏度高，适用于食用菌样品中的呋喃丹农药残留的分析检测。

高效液相色谱食用菌呋喃丹凝胶渗透色谱

1　引　言

呋哺丹属于氨基甲酸酯类农药( carbamates，NMCs)，是一类应用广泛的杀虫、杀螨、除草剂，由于其具有高效、残留期短的优点，在食用菌种植中广泛应用[1]。目前国内外对该类农药残留有很严格的要求，食用菌中最低为0.1 mg/kg[2]。因此，建立食用菌中快速、准确、简便、灵敏度高的呋喃丹残留检测方法十分必要。

在氨基甲酸酯类农药残留分析中，样品净化有GPC(gel permeation chromatography)净化[3-6]、SPE(Solid Phase extraction)净化[7-11]及传统的液-液分配[12-14]和柱层析法[15]。GPC净化具有结果重现性好、净化效率高等优点，为提高工作效率，节省人力，目前越来越多的检测机构选择采用GPC净化等新型净化方式取代传统的液-液分配和柱层析法。但目前各标准中的GPC净化均为离线GPC，即在样品萃取后，需要实验人员手动转移，净化、浓缩等一系列操作后，转移至GC/MS进行分析。采用全自动凝胶净化色谱及浓缩联用系统，实现 GPC和浓缩同时进行，自动化操作，简化操作步骤，避免有机污染[16]。

本实验选择8种有代表性的蔬菜为研究基质，建立了GPC净化、高效液相色谱(HPLC)检测的测定方法，方法简便快速、净化效果好，可满足食用菌中呋喃丹残留的检测要求。

2　 材料与方法

2.1仪器与试剂

HPLC-1260液相色谱仪(美国安捷伦公司)配荧光检测器(G1321B)；全自动凝胶净化色谱及浓缩联用系统(美国J2 Scientific公司)；氮吹仪(英国TECHENE公司)；旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)； 涡旋混匀器(美国Scientific Industries公司)；食品粉碎机(中国欧科电器公司)。

呋喃丹标准溶液：100μg/mL，购自农业部环境保护科研监测所。

乙腈、甲醇(色谱纯, Merck公司)；环己烷、乙酸乙酯(分析纯，国药集团)；无水硫酸钠(分析纯，上海久亿化学试剂有限公司)；0.22 μm有机系滤膜(天津东康科技有限公司)；实验室用水为Millipore超纯水。

2.2试验方法2.2.1溶液配制

呋喃丹标准溶液配制: 准确移取100 μL的呋喃丹农药标准品，用甲醇做溶剂，配制成10μg/mL储备液， -20 ℃保存。使用时根据呋喃丹对应响应值，吸取适量储备液，用甲醇配制成浓度为0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL的系列标准溶液，供高效液相色谱测定。

乙酸乙酯-环己烷(1∶1，V/V)：取500 mL乙酸乙酯，加入环己烷500 mL混匀。

2.2.2样品处理

①试样制备

采集有代表性的8种食用菌样品，取可食部分，经缩分后，切碎，充分混匀后放入食品粉碎机粉碎，制成待测样品。分装后置于-20 ℃下保存，待提取。

②提取

称取25.00 g(精确到0.01 g)粉碎的食用菌样品，加入50 mL乙腈，高速匀浆2 min后用滤纸过滤。滤液收集到装有5～7 g氯化钠的具塞量筒中，收集滤液40～50 mL，盖上塞子。剧烈振荡l min，在室温下静置10 min，使乙腈相和水相分层。吸取10mL乙腈溶液在80℃水浴中氮吹干。加10 mL已配好的乙酸乙酯-环己烷(50+50)溶解残渣，经无水硫酸钠脱水，待GPC净化。

③净化

GPC净化条件：流动相乙酸乙酯-环己烷(50+50，V/V)，流速为4.6 mL/min，选择性收集10～20 min流出液，经GPC在线浓缩，最后用2.0 mL甲醇-水(体积比5∶5)溶解残渣，收集至进样瓶，过0.22 μm有机滤膜，待测。

2.2.3色谱参考条件

色谱柱：C18(安捷伦，4.6 mm×25 cm，5μm)； C18预柱(4.6 mm×4.5 cm)。柱温：35℃。激发波长285 nm；发射波长320 nm。流动相：甲醇-水(1∶1，V/V)。

3　结果与分析

3.1色谱条件优化3.1.1流动相的选择

有实验研究采用乙腈-水作为流动相，但乙腈毒性较高，对色谱柱损伤大。本实验以甲醇-水为流动相，以甲醇与水混合溶液的体积比(分别为30∶70、40∶60、50∶50)为条件进行测试，甲醇比例较低时，保留时间延长，峰面积减小，结果表明甲醇-水体积比为50∶50时，样品的出峰时间、峰形、灵敏度较适宜，与文献报道一致。呋喃丹标准品色谱图见图1。

图1　呋喃丹标准品高效液相色谱图

3.1.2检测波长选择

取呋喃丹标准使用液在2.2.3条件下进样，在波长200～900范围内对呋喃丹进行多发射和多激发扫描，结果发现呋喃丹在激发波长320 nm和发射波长为285 nm处最强。故方法选定320 nm为发射波长，285 nm为激发波长。

3.1.3柱温的选择

研究中固定其他色谱条件，将色谱柱温度从20 ℃升至40 ℃，结果显示呋喃丹保留时间逐渐提前，为有效确保柱效及色谱柱使用寿命，方法采取柱温35 ℃。

3.2GPC条件优化

本实验研究应用GPC作为无损的半自动净化方法，选用Bio-Beads S-X3(300 mm×10 mm)作为填料。选用体积比为1∶1的乙酸乙酯-环己烷为流动相，设定流速为4.6 mL/min，分段采集。实验中，为确定呋喃丹收集步骤，采用加标样品通过GPC紫外检测器，紫外扫描数据显示目标化合物集中在9 min至13 min，故收集此段时间内提取液(图2)。

图2　呋喃丹GPC洗脱色谱图

实验中采用草菇样品加标样品经GPC净化，检测结果显示，经GPC净化后杂质干扰成分明显减少，目标化合物检测灵敏度提高，同样其他食用菌样品也能得到较好的净化效果。以草菇为例，见图3、图4。

3.3线性关系及检测限

呋喃丹标准工作液系列，按方法的实验条件进样，以所得峰面积A对浓度C(μg/mL)进行回归分析，结果表明在0.2～5.0 μg/mL的标准溶液浓度范围内，呋喃丹浓度与响应值有良好的线性关系(图4)，其回归方程为：Y=6.179X-0.2884；相关系数r=0.9993。根据色谱响应值S/N≥3标准计算，呋喃丹最低检出浓度为0.01 mg/kg。

图3　草菇呋喃丹色谱图a.未经GPC净化草菇呋喃丹加标色谱图；b.经GPC净化草菇呋喃丹加标色谱图

图4　呋喃丹标准工作曲线图

3.4精密度实验

以呋喃丹标准溶液5.0 μg/mL，连续进样6次，每次10 μL，测得呋喃丹平均峰面积为30.96，RSD为0.108% 。

3.5 稳定性实验

以标准溶液5.0 μg/mL，每隔2 h 进样，每次10 μL，测得呋喃丹平均峰面积为30.81，RSD为0.131%。结果表明：供试品溶液在12 h内所测得的结果基本一致。

3.6重复性实验

取同一加标食用菌样品6份，按2.2.2的方法制成供试溶液。在上述色谱条件下，测定呋喃丹平均含量为1.78 μg/kg，RSD为1.58%。

3.7方法回收率实验

精密称取阴性样品进行低浓度的加标回收实验，结果见表1。该阴性样品中加标0.50、1.00、2.00 μg/kg，回收率在78.3%～97.6%之间，RSD在3.26%～11.69%之间。

表1　空白样品中呋喃丹的添加回收率、精密度(n=3)

4　结论

采用全自动凝胶净化色谱及浓缩联用系统处理样品，可以有效去除大部分色素及干扰物，实验结果表明：本方法具有净化效果好、检测限低、操作简单、实用等特点，有效避免有机污染，可用于市场常见食用菌的呋喃丹农药残留量的测定研究，适用于基层单位开展呋喃丹的监测分析，具有广泛的应用前景。

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Determination of carbofuran in mushrooms by gel permeation chromatography-high performance liquid chromatography.

Feng Xiaoqing, Wang Yi, Wang Qin, Wang Lu, Song Xin, Xu Rui, Hang Xueyu

*(Huai’anCenterforDiseaseControlandPrevention,Huaian223001,China)

The samples were first extracted with acetonitrile, then dried by nitrogen. The remaining residues were dissolved with ethyl acetate-cyclohexane mixture (50:50，V/V) and followed with a GPC cleanup.The identification of carbofuran was performed by HPLC with an external standard method. The results showed that the correlation coefficients (r) of carbofuran were greater than 0.999 in the concentration range of 0.2-5.0 ng/mL. The limits of quantitation (LOQ) were 0.01 mg/kg. It was found that the average recoveries ranged from 78.3% to 97.6%, and the relative standard deviations (RSD) were in the range of 3.26% to 11.69% at three spiked levels 0.5, 1.0 and 2.0 mg/kg. The established method is sensitive and simple, and suitable for the determination of carbofuran in mushrooms.

high performance liquid chromatography; mushrooms; carbofuran; gel permeation chromatography

冯晓青，硕士，技师，主要从事食品分析工作，Email:fengxiaoqing-20@163.com。

杭学宇, 副主任技师, 主要研究方向为理化检验，E-mail:664686545@qq.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.05.002

2016-04-08