红景天苷对宫颈癌Siha细胞增殖及IMP3表达的影响*

高　瑾，罗　伟，王　钦，徐伟翔，吴岢蔚，李　杰，章丽霞△

(1.兰州石化总医院妇产科,兰州 730060；2.川北医学院法医学系，四川南充 637000)



·经验交流·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.036

红景天苷对宫颈癌Siha细胞增殖及IMP3表达的影响*

高瑾1，罗伟2，王钦2，徐伟翔2，吴岢蔚2，李杰2，章丽霞2△

(1.兰州石化总医院妇产科,兰州 730060；2.川北医学院法医学系，四川南充 637000)

目的检测红景天苷对宫颈癌Siha细胞中胰岛素样生长因子Ⅱ mRNA 结合蛋白3(IMP3)表达情况的影响及其意义。方法采用CCK-8法检测不同浓度红景天苷作用Siha细胞24、48、72 h的细胞增殖抑制作用，采用Western blot和RT-PCR检测宫颈癌Siha细胞中IMP3的蛋白和mRNA的表达水平。结果红景天苷对宫颈癌Siha细胞的增殖抑制率具有时间和浓度双重依赖性(P<0.05)。IMP3在红景天苷组宫颈癌Siha细胞中的蛋白和mRNA表达均低于对照组(P<0.05)。结论红景天苷可抑制宫颈癌Siha细胞增殖，同时降低Siha细胞IMP3的表达。

红景天属；宫颈肿瘤；Siha细胞；胰岛素样生长因子Ⅱ mRNA结合蛋白

红景天是一种具有广泛药理作用的天然中草药植物，其主要有效成分是红景天苷。红景天苷对体外培养人胃腺癌细胞系SGC-7901细胞[1]、人乳腺癌MCF-7细胞[2]及肺腺癌SPC-A-1细胞[3]等有一定的抑制作用；动物实验研究也有报道，红景天苷具有抑制体内移植瘤如小鼠腹水型H22肝癌[4]和Lewis肺癌荷瘤小鼠移植瘤的生长、提高小鼠生存期的作用[5]。目前尚少见对红景天苷作用宫颈癌Siha细胞后检测其胰岛素样生长因子Ⅱ mRNA 结合蛋白3(IMP3)表达的报道。本研究通过不同浓度红景天分别作用宫颈癌Siha细胞24、48、72 h，观察红景天苷对宫颈癌Siha细胞增殖抑制作用，从而选取红景天苷作用宫颈癌Siha细胞的最佳干预浓度，检测并分析红景天苷作用宫颈癌Siha细胞后，细胞中IMP3的表达变化，为红景天苷应用于临床治疗宫颈癌进行初步研究。

1　材料与方法

1.1材料人宫颈鳞癌Siha细胞由川北医学院影像研究所惠赠，IMP3单克隆抗体购于ABCAM 公司(ab177477)，CCK-8试剂，增强型RIPA裂解液，苯甲基磺酰氟(PMSF)，超敏ECL化学发光即用型底物，二抗，CCK-8试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司；新生牛血清购于TBD 公司；高糖DMEM购于Gibco公司。红景天苷购于上海源叶生物科技有限公司，纯度：HHPLC=98%，规格：每支20 mg。

1.2方法

1.2.1细胞培养用DMEM 培养液(含10%胎牛血清、青霉素和链霉素各100 U/mL)在37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养。每2～3天换液1 次，取对数生长期细胞备用。

1.2.2CCK-8法检测红景天苷Siha细胞的毒性作用取对数生长期的宫颈癌Siha细胞，胰蛋白酶消化制成细胞悬液，以每孔4×103个细胞接种于96孔板中，每孔100 μL，培养24 h后，弃去原培养基，红景天苷处理组加入用含10%胎牛血清的DMEM培养液稀释的0、20、40、80、160、320 μg/mL的红景天苷；对照组加含10%胎牛血清的DMEM培养液100 μL培养细胞，空白对照组不加细胞仅加含10%胎牛血清的DMEM培养液100 μL，每组6个复孔继续分别培养至24、48、72 h后每孔分别加入10 μL CCK-8，置37 ℃，5% CO2培养箱中孵育3 h后，在酶标仪490 nm波长下测定各孔吸光度值(A)，抑制率(%)=1-(实验组A值-空白对照组A值)/(对照组A值-空白对照组A值)×100%。

1.2.3Western blot法取对数生长期的宫颈癌Siha细胞，经胰酶消化后调整细胞密度为每毫升1×106个，接种于培养瓶中，每瓶4 mL。待细胞培养至对数期时吸弃旧液，PBS溶液洗涤3次后，分别加入含10%胎牛血清的DMEM培养液(共2瓶)、含10%胎牛血清的DMEM培养液稀释的终浓度为80 μg/mL(2瓶)并含5%FBS的红景天苷溶液。标记组别(对照组和红景天组)和时间后，继续培养48 h，对照组吸弃旧液，红景天苷组吸取旧液离心，PBS溶液洗涤3次后，每瓶加入500 μL蛋白裂解液，冰上裂解2～3 h，提取细胞总蛋白。用BCA法测定蛋白浓度。100 ℃变性5 min，每孔上样40 μg，10% SDS-PAGE凝胶电泳,恒压95 V 90 min分离样品；200 mA转膜35～50 min；以5%脱脂奶粉室温封闭1 h；加5%脱脂奶粉稀释的IMP3，4 ℃过夜。TBST洗膜5 min×3次，辣根过氧化物酶标记的二抗在室温孵育2～3 h，TBST洗膜5 min×3次，ECL发光。使用Image lab软件分析目的蛋白与内参的灰度值，通过目的蛋白IMP3与β-actin内参照灰度值对比，得出相对量。

1.2.4RT-PCR检测宫颈癌Siha细胞中IMP3的mRNA表达按Trizol总RNA 抽提试剂盒所附说明提取待测细胞中总RNA。紫外分光光度仪测定其浓度后， 取1 ng RNA，在离心管内加入Oligo(dT)15、dNTP、RNA 酶抑制剂、DEPC水,在逆转录酶MMLV 的催化下获得cDNA。所有的引物均由宝生物工程大连公司合成(表1)。以2%琼脂糖凝胶电泳显示PCR结果。用Image lab软件对结果进行光密度扫描分析，以相应目的条带IMP3吸光度值与β-actin条带吸光度值的比值进行半定量分析。

表1　IMP3、β-actin RT-PCR引物序列

2　结　果

2.1红景天苷对宫颈癌Siha细胞增殖的影响采用CCK-8检测红景天苷对Siha细胞生长增殖抑制的影响，在20～640 μg/mL浓度，不同浓度的红景天在不同的作用时间下(24、48、72 h)对Siha细胞均有抑制作用，且随红景天苷浓度的增高及作用时间的延长，宫颈癌Siha细胞增殖抑制率也逐渐增高(表2)。以红景天苷浓度在640 μg/mL，作用72 h时的抑制率最高，抑制率为97.46%±0.54%；不同浓度红景天苷作用Siha细胞48 h的抑制曲线较好，其中红景天苷80 μg/mL作用Siha细胞48 h的抑制率为49.80%±0.46%。不同药物浓度对宫颈癌Siha细胞增殖抑制率的单因素方差分析，24、48、72 h的F值分别为23.73、134.687、34.21，均P<0.01。提示红景天苷对宫颈癌Siha细胞的增殖抑制率具有时间和浓度双重依赖性。以80 μg/mL红景天苷浓度分别作用24、48、72 h进行单因素方差分析，F=70.56，P<0.01。故选取48 h IC50，80 μg/mL作为干预浓度，为红景天苷组。宫颈癌Siha细胞为对照组。

2.2Western blot检测红景天苷对宫颈癌Siha细胞IMP3蛋白表达的影响对照组与红景天苷组中宫颈癌Siha细胞IMP3可见特异性的蛋白条带(图1)，对照组IMP3蛋白表达量(0.306 6±0.220 8)高于红景天苷组(0.018 8±0.002 3)，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3RT-PCR检测红景天苷对宫颈癌Siha细胞IMP3 mRNA表达的影响对照组中IMP3 mRNA的表达量(0.621 1±0.498 8)高于红景天苷组(0.014 6±0.009 3)，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

表2　不同浓度红景天苷对Siha细胞增殖的抑制作用

图2　IMP3 mRNA在宫颈癌Siha细胞中的表达

3　讨　论

在我国，每年有约130 000例新增宫颈癌病例，占全球全年新增病例的1/3；每年有53 000例因宫颈癌死亡例数，占全球宫颈癌死亡例数的1/4[6]。目前，治疗宫颈癌的主要手段是放化疗作用配合手术切除，超过35%的局部晚期宫颈癌患者经过手术治疗或者放疗后，将发展为持续性/复发/转移性宫颈癌，铂类为基础的顺铂作用仍然是治疗的金标准[7]。但铂类药物由于不良反应影响，而使患者生活质量下降，预后较差。

红景天苷是红景天属植物的主要活性成分，具有抗衰老、抗疲劳以及抗缺氧作用，对心脏、脑、神经、肾具有保护作用，以及抗癌和抗细胞凋亡等多种作用[8]。红景天苷通过调节细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶4(cyclin-dependent kinases 4，CDK4) - 细胞周期蛋白 D1(cyclin D1)途径而抑制G1期，或者通过调节细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶2(cyclin-dependent kinases 2，CDK2)-细胞周期蛋白 B1(cyclin B1)途径抑制G2期来发挥细胞毒活性[9]。已有研究显示，经红景天苷处理的肝癌细胞在G0/G1期百分数明显增加，S期和G2/M期细胞减少，表明肿瘤生长在G0/G1期被阻断。提示红景天苷可在此期抑制肿瘤DNA的合成和复制。本实验采用CCK-8检测不同浓度红景天苷对Siha细胞增殖的影响，结果表明红景天苷对Siha细胞的增殖抑制率具有时间和浓度双重依赖性。

IMP3又名KOC或L523S，在人类早期胚胎中发挥重要作用，在成人正常组织中很少或无表达[10-11]。但在人乳腺癌、非小细胞肺癌、胃肿瘤、膀胱癌、宫颈腺癌等各种恶性肿瘤中IMP3高表达，在恶性肿瘤周围的良性组织中不表达[12-16]。IMP3属于IGF-Ⅱ的mRNA结合蛋白(IMP)家族，由IMP1、IMP2和IMP3组成。IMP3与IGF-Ⅱ Leader3 mRNA的5′-UTR结合，通过促进IGF-Ⅱ Leader3 mRNA的翻译使IGF-Ⅱ蛋白的表达上调而发挥致癌作用[17]。IGF-Ⅱ与IGF-ⅠR结合后，使其内在的酪氨酸酶活化，活化的酪氨酸酶介导PI3K/AKT和RAF/MAPK信号传导通路，从而促进肿瘤细胞增殖分化，抑制凋亡[18]。刘纪昀等[19]采用免疫组化及原位杂交方法检测20例正常宫颈上皮，35例宫颈上皮内瘤变，50例宫颈鳞状细胞癌组织中的IMP3蛋白表达情况，发现IMP3蛋白阳性表达率随着宫颈病变程度的增高而增加，提示IMP3在鉴别宫颈良恶性病变方面具有参考意义。同时有研究证实，IMP3的过表达与宫颈病变的程度有关，IMP3主要是在宫颈鳞状细胞癌患者中表达，并能预测肿瘤侵袭性的FIGO分期、淋巴结转移、血管浸润密切相关。因此，IMP3被认为与肿瘤侵袭性相关[20]。本研究显示，经80 μg/mL红景天苷作用的宫颈癌Siha细胞中IMP3蛋白和mRNA表达均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。结合已有研究推测，在未经任何治疗的宫颈癌患者组织中IMP3表达，可以预测宫颈癌侵袭性肿瘤的行为，也可以作为预后不良的预测因子之一。本次实验表明，红景天苷可降低宫颈癌Siha细胞中IMP3的表达，提示红景天可能通过阻断IMP3与IGF-Ⅱ Leader3 mRNA的5′-UTR结合，负性调节PI3K/AKT和RAF/MAPK信号传导通路，抑制Siha细胞生长。梁颖等[21]用红景天注射液辅助化疗治疗非小细胞肺癌晚期对患者血清VEGF表达的影响发现，红景天对非小细胞肺癌组织中VEGF的阳性表达具有良好的抑制作用，它可以有效作用于肿瘤组织，推测红景天苷可以用于临床治疗宫颈癌。

本实验以宫颈癌Siha细胞为研究对象，初步探讨红景天苷抑制宫颈癌Siha细胞增殖的作用机制，后续将建立动物模型进一步研究红景天苷对小鼠宫颈癌移植瘤的影响情况，以及利用PD98059(MAPK信号通路特异性阻断剂)、LY294002 (PI3K信号通路特异性阻断剂)分别阻断MAPK、PI3K信号通路，进一步探讨红景天苷在宫颈癌中的作用机制。

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四川省教育厅项目(12ZB225)；川北医学院发展基金项目(CBY-A-QN02)；川北医学院学生科创基金(15263)。作者简介：高瑾(1979-)，主治医师，本科，主要从事肿瘤病理的研究。△

，E-mail:zlx0624@qq.com。

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1671-8348(2016)27-3849-03

2016-02-11

2016-04-17)