牛肌酸激酶同功酶CK-BB的全基因合成及其原核表达

杨 鼎，吴江鸿，祁云霞，赵世华

（1.中国科学院内蒙古草业研究中心，内蒙古 呼和浩特 010031；2.内蒙古农牧业科学院兽医研究所，内蒙古 呼和浩特010031）

牛肌酸激酶同功酶CK-BB的全基因合成及其原核表达

杨 鼎1，吴江鸿1，祁云霞1，赵世华2

（1.中国科学院内蒙古草业研究中心，内蒙古 呼和浩特 010031；2.内蒙古农牧业科学院兽医研究所，内蒙古 呼和浩特010031）

牛肌酸激酶是重要的能量代谢酶，尤其是在机体发生炎症时，会在局部存在特异性升高，具有潜在的疾病标志物作用。根据牛肌酸激酶同功酶CK-BB的氨基酸序列及大肠杆菌（BL21）密码子的偏爱性，设计合成54条互相重叠的引物，通过组装PCR分别合成CK-BB的6个片段CK-BB1、CK-BB2、CK-BB3、CK-BB4、CK-BB5和CK-BB6；再以基因头ck-1和基因尾ck-54为引物，以CK-BB1、CKBB2、CK-BB3、CK-BB4、CK-BB5和CK-BB6混合物为模板进行第2轮扩增；将得到的产物连接到pET28b载体上，挑取重组子测序。通过PCR扩增对人工合成的基因进行校正，得到完全正确的CK-BB基因，为重组牛肌酸激酶同功酶CK-BB的规模化制备奠定了基础。

牛肌酸激酶同功酶；密码子优化；全基因合成

肌酸激酶 （Creatine Kinase，CK，EC.2.7.3.2）又称磷酸肌酸激酶（Creatine PhosphoKinase，CPK），分子量为81～82 KDa，是由2个亚基（M和B）组成的二聚体，可逆催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应（见图1）［1］。该反应所产生的能量用于动物体多种生理活动，在动物细胞代谢中起到关键作用。其中在机体组织受到损伤时，如心肌梗死，细胞内的CK会被释放入血，造成血液中CK浓度急剧升高，从而使CK成为诊断该病的指示物质，通过检测血清中CK值即可对心肌梗死做出早期诊断［2］。在奶牛养殖业中，困扰养殖户的常见疾病如奶牛关节滑膜炎、子宫内膜炎等疾病被发现时，病情已经发展严重，很难治愈。而在这些疾病的发生发展过程中，CK都会有不同程度的升高，对于这些疾病的早期诊断具有重要意义［3-4］。

该研究采用大肠杆菌原核表达系统，将牛肌酸激酶同功酶基因CK-BB按大肠杆菌密码子的偏爱性进行改造，并克隆到分泌型表达载体pET28b，构建大肠杆菌分泌型重组表达载体pET28b-CK-BB，转化大肠杆菌BL21（E.coli BL21），获得高效表达CK-BB的大肠杆菌工程菌株，为大规模制备牛肌酸激酶同功酶CK-BB奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 E.coli BL21（DE3）由内蒙古农牧业科学院兽医研究所实验室保存，pET28b质粒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。限制性内切酶、T4 DNA连接酶等购自宝生物工程（大连）有限公司。质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒等购自天根生化科技（北京）有限公司。引物合成和测序委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

图1 由肌酸激酶逆催化的肌酸与ATP之间的转磷酰基反应

1.2 试验方法

1.2.1 CK-BB基因遗传密码子改造及引物的设计与人工合成：根据牛肌酸激酶同功酶CK-BB的氨基酸序列 （GenBank登录号：AAX08725.1），在Bioedit软件的辅助下推导出该基因的核苷酸序列，将起始密码子ATG和终止密码子TAA分别添加于CK-BB序列的5′端和3′端；使用DNAworks软件［5］以大肠杆菌密码子使用频率为基准，对该基因的密码子进行优化，设计合成54条互相重叠的40 bp引物（见表1），在引物CK-1和CK-54分别引入NdeⅠ和 XhoⅠ酶切位点。引物合成后经脱盐、PAGE纯化，备用。

1.2.2 全基因序列的合成及校正：将相互重叠的引物分为6组，分别进行PCR反应，其PCR产物分别命名为CK-BB1、CK-BB2、CK-BB3、CK-BB4、CKBB5和CK-BB6。再以CK-BB1、CK-BB2、CK-BB3、CK-BB4、CK-BB5和CK-BB6为模板，以ck-1和ck-54为引物进行PCR扩增，合成牛肌酸激酶同功酶CK-BB′。对合成后的全基因片段经测序分析，发现合成的片段有碱基缺失、增加、突变的错误。以合成的基因CK-BB′为模板，利用PCR法对合成基因进行校正，校正后的牛肌酸激酶同功酶全基因CKBB直接送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列分析。

1.2.3 重组大肠杆菌表达质粒pET28b-CK-BB的构建：以CK-1（5′-GCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGCCTTTCAGCAA-3′，下划线处为NdeⅠ酶切位点）和CK-54（5′-CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCTGC-3′，下划线处为XhoⅠ酶切位点）为引物扩增全长牛肌酸激酶同功酶基因。PCR产物经过NdeⅠ和XhoⅠ酶切后，插入相同酶切的pET28b载体，构建重组质粒pET28b-CK-BB载体。具体方法参照参考文献［6］进行。

1.2.4 重组大肠杆菌工程菌的构建及高拷贝转化子的筛选：采用质粒制备试剂盒提取pET28b-CKBB约5 μg，并用NdeⅠ将其线性化。酶切产物经沉淀、洗涤、干燥后，用10 μL水溶解备用。取1 μL重组的pET28b-CK-BB质粒转化E.coli BL21（DE3）菌株，42℃热击90 s，冰上静置2 min后涂LB平板（含30 μg/mL卡那霉素），37℃培养过夜［7］。

图2 牛肌酸激酶同功酶CK-BB的人工合成过程

1.2.5 pET28b-CK-BB融合蛋白的诱导表达：挑取表达菌株E.coli BL21（DE3）的单菌落于试管中（4 mL LB培养基，含30 μg/mL卡那霉素），37℃、220 r/min过夜培养。将培养的菌液按1∶100比例分别接种于4 mL LB培养基中，添加30 μg/mL卡那霉素，37℃、220 r/min培养。当OD值达到0.6左右时，添加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，220 r/min、20℃诱导过夜；37℃继续诱导4 h，以未加IPTG诱导剂的菌液作为阴性对照。4 000 r/min离心10 min，收集菌体，弃上清液，菌体用500 μL PBS（pH值7.4）缓冲液悬浮，超声破碎6 min，超0.5 s停1.5 s，分别离心收集上清液和沉淀。沉淀用500 μL包涵体溶解液 （8 mol/L Urea，50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH值8.0）溶解，取40 μL样品和10 μL 5× protein loading buffer混匀，沸水浴10 min。

表1 CK-BB全基因合成和扩增编码DNA引物序列

1.2.6 SDS-PAGE检测：准备12%的SDS-PAGE和Tris-Gly电泳缓冲液（Tris 30 g，甘氨酸144.0 g，SDS 10 g，定容至1 L），上样量10 μL，浓缩胶80 V、20 min，分离胶120 V、60 min，凝胶电泳结束后考染20 min，脱色。

2 结果与分析

2.1 CK-BB基因片段的获得 牛肌酸激酶同功酶CK-BB的全基因人工合成过程见图2。

2.2 小核苷酸片段的组装 利用组装 PCR合成200～300 bp的基因片段。得到6个大小分别为286、220、253、265、230、287 bp的片段 CK-BB1、CK-BB2、CK-BB3、CK-BB4、CK-BB5、CK-BB6。

2.3 牛肌酸激酶全基因的合成 获得的全长基因产物经胶回收试剂盒回收纯化后进行末端A处理，克隆入pET28b载体并转化E.coli BL21（DE3），筛选并获得了阳性克隆子。

2.4 质粒双酶切反应 结果见图3。

图3 质粒pET28b-CK-BB经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切

图4 人工合成改造后的牛肌酸激酶同功酶CK-BB全基因序列

2.5 牛肌酸激酶同功酶CK-BB全基因序列 获得的CK-BB全基因序列测序结果见图4。

2.6 SDS-PAGE分析 结果见图5。由图5可以看出，在37℃沉淀中目的蛋白有明显表达。

3 讨论

在利用原核表达系统表达真核生物的基因时，由于真核生物基因中的一些密码子对于原核生物来说是稀有密码子，可能导致表达效率和表达水平很低［8］。影响目的基因在异源宿主中的表达效率的主要因素是不同宿主对密码子使用频率存在差异，因此，通过重新设计和合成宿主偏爱的密码子可消除利用率低或稀有的密码子，从而优化目的基因的表达。该研究对牛肌酸激酶基因进行了重新设计和合成，从而优化了该基因的表达。具体包括：①选择使用大肠杆菌偏爱的密码子，使合成的基因在E.coli BL21中高效表达；②将相邻片段的连接粘端设计成互补碱基，使退火后的基因片段之间能很好连接；③在基因两端设计了必要的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，便于克隆表达。在该基础上合成了1 180 bp大小的牛肌酸激酶全基因，经测序表明人工合成的基因序列正确。结果表明，运用优化基因的合成策略，可以设计合成优化的目的基因序列。

大肠杆菌表达系统是20世纪70年代发展起来的在基因工程中应用最为广泛的表达系统，以其成本低、生产率高、操作简单等优点备受青睐，常作为表达重组蛋白的首选表达系统［8］。经典的E.coli BL21（DE3）菌株是lon和omp T蛋白酶缺陷型，而且为T7表达系统设计，添加了T7聚合酶基因。pET系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白最有效的系统，可生产大量目的蛋白［8］。

图5 SDS-PAGE分析

在寡核苷酸片段的拆分之前对基因进行密码子优化，应主要考虑密码子的使用频率、G+C含量、限制性酶切位点和RNA二级结构自由能等。有时目的基因内某些重复元件还会影响基因在大肠杆菌内的稳定性，这些都需要在序列设计时进行检查，应尽量避免。

该研究利用Vienna RNA二级结构在线软件（http://rna.tbi.univie.ac.at/），采用RNAfold server对CK-BB基因mRNA折叠自由能进行预测。缺省参数设置如下：温度37℃，Na+离子浓度为1 mol/L，次优性数p%=5%，计算折叠结构数最大值=50，内环/膨胀环数最大值=30。在DNA 2.0软件的辅助下，以E.coli BL21密码子使用频率为基准，同时兼顾mRNA二级结构稳定性和G+C含量，在不改变氨基酸顺序的前提下，手动对各简并密码子进行了优化。

4 结论

设计并人工合成了由E.coli BL21（DE3）偏爱密码子组成的CK-BB基因序列，合成了优化的牛肌酸激酶同功酶CK-BB基因，成功构建了大肠杆菌表达载体pET28b-CK-BB，经卡那霉素抗性筛选获得了高拷贝的菌株，为牛肌酸激酶同功酶CKBB的大规模表达纯化奠定了基础。

［1］杨鼎，赵世华，吴江鸿，等.几种肌酸激酶的检测方法［J］.畜牧与饲料科学，2015，36（8）：16-19.

［2］王临光，王海波，付强，等.急性冠脉综合症诊断中检测心肌肌钙蛋白Ⅰ肌红蛋白及肌酸激酶同工酶及超敏C-反应蛋白的意义［J］.河北医学，2006，12（1）：1-3.

［3］何德肆，胡述光，欧阳叙向，等.关节滑膜炎奶牛血液部分生化指标的变化 ［J］.中国草食动物，2007，27（1）：44-46.

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［5］HOOVER D M，LUBKOWSKIJ.DNAWorks：An automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis ［J］.Nucleic Acids Res，2002，30（10）：e43.

［6］萨母克鲁克.分子克隆实验指南（上册）［M］.黄培堂，译.北京：科学出版社，2002：69-71.

［7］郭亮，沈微，王正祥，等.生物转化法生产茶氨酸的重组大肠杆菌的构建 ［J］.食品与生物技术学报，2005，24（2）：41-45.

［8］解庭波.大肠杆菌表达系统的研究进展［J］.长江大学学报自然科学版：医学卷，2008，5（3）：77-82.

（责任编辑：赵俊利）

《畜牧与饲料科学》入选《中国学术期刊影响因子年报》统计源期刊

2015年10月，中国学术期刊（光盘版）电子杂志社有限公司、中国科学技术文献评价研究中心联合发布了《中国学术期刊影响因子年报（自然科学与工程技术·2015版）》。《畜牧与饲料科学》入选统计源期刊，并获颁《中国学术期刊影响因子年报统计刊源证书》。《中国学术期刊影响因子年报》依据科技期刊在同学科、同研究层次的总被引频次、影响因子、下载频次等多项指标，每年按照“优入劣汰”的原则对其收录的科技期刊进行综合筛选、评定。该年报的学术影响力已被众多学术单位和科研院所广泛认可，是我国重要的科技期刊学术水平评价体系之一。

Whole Gene Synthesis and Prokaryotic Expression of Bovine Creatime Kinase Isoenzyme CK-BB

YANG Ding1，WU Jiang-hong1，QI Yun-xia1，ZHAO Shi-hua2
（1.Inner Mongolia Research Center for Prataculture，Chinese Academy of Sciences，Hohhot 010031，China；2.Institute of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Hohhot 010031，China）

The creatine kinase plays an important role in bovine energy metabolism.When inflammation occurs,there will be a locally-specific increase of CK.According,the creatine kinase may serve as a potential marker of bovine diseases.In this study,a total of 54 mutually overlapped primers were designed and synthesized according to the published amino acid sequence of bovine creatime kinase isoenzyme CK-BB and the codon usage preferred by E.coli（BL21）.A total of 6 DNA fragments of CK-BB gene, including CK-BB1,CK-BB2,CK-BB3,CK-BB4,CK-BB5 and CK-BB6,were synthesized by assembled PCR assay.Using the mixture of the 6 fragments as template,the second round PCR was conducted with head primer ck-1 and tail primer ck-54,and the amplifying product was connected with vector pET28b.The positive recombinants were subsequently identified,cloned and sequenced.A correct synthetic CK-BB gene was obtained by proofreading PCR assay,which lays a foundation for large-scale preparation of bovine isoenzyme CK-BB.

bovine creatime kinase isoenzyme；codon optimization；whole gene synthesis

S852.23

A文章顺序编号：1672-5190（2016）02-0029-05

2016－01－15

项目来源：内蒙古农牧业科学院青年创新基金（2013QN JJM11）。

杨鼎（1981—），男，助理研究员，硕士，主要研究方向为兽医微生物与免疫学。

赵世华（1962—），男，研究员，主要从事草食家畜传染病防控技术研究与推广工作。