红腹锦鸡胚胎期羽毛芽发育的研究

张容宇，郝 玉，尹 俊

（内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

红腹锦鸡胚胎期羽毛芽发育的研究

张容宇，郝 玉，尹 俊

（内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

旨在了解红腹锦鸡胚胎期羽毛毛囊的组织结构及毛囊形态发生的变化过程，为研究红腹锦鸡羽毛毛囊发育的分子调控机理奠定组织学基础。分别对5、7、8、9、10、11、13、16、18日胚龄的红腹锦鸡胚胎发育情况进行实体观察；采集上述胚龄的红腹锦鸡背部皮肤，制作石蜡切片并进行HE染色，在显微镜下观察毛囊形态结构并拍照记录。红腹锦鸡胚胎于9日胚龄时羽毛芽开始发育，可以观察到色素在毛囊内的沉积，16日胚龄时毛囊发育基本完成，体表覆盖羽毛。该研究为进一步阐明红腹锦鸡羽毛发育的分子机制奠定了组织学基础。

红腹锦鸡；胚胎；羽毛芽；发育

红腹锦鸡（Chrysolophus pictus）又名金鸡，属鸟纲、鸡形目、雉科、锦鸡属。在我国红腹锦鸡主要分布于青海东南部、宁夏南部、湖南、西藏东部、河南、云南、广西、陕西南部、湖北西部、甘肃东部和南部、四川等地，是我国二级保护动物。国外常分布于缅甸东北部。红腹锦鸡羽毛色彩鲜艳，光彩夺目，且不同颜色的羽毛在身体上生长的位置也不相同，是闻名中外的观赏鸟种［1-4］。

躯体被附羽毛是禽类的典型特征，虽然羽毛的形态功能各异，但它们都是由单个的毛囊发育而来。毛囊是一种皮肤附属器官，它的发育控制着羽毛的生长发育和再生，其形态发生过程比较复杂，包括一系列精细的调控过程，如表皮角质化过程中特异性分化的表皮细胞和形成毛乳头的间充质细胞之间复杂的相互作用等［5-6］。

迄今为止，有关红腹锦鸡羽毛毛囊形态学规律尚缺乏研究。目前，有国内学者报道了鸡的羽毛发育过程［7］，同时也对胚胎期鹅和鸭的羽毛毛囊发育、毛囊形态结构等方面进行了研究［8-10］。相关研究阐明了β-catenin基因调控羽毛毛囊发育的分子机制［11］，而Widelitz等［5］已证实鸡的羽毛原基起源于扁平表皮。该研究通过对红腹锦鸡胚胎期皮肤组织的显微结构进行观察，了解其羽毛毛囊的组织结构及毛囊形态发生的变化过程，以期为研究红腹锦鸡羽毛毛囊发育及羽毛颜色的形成机制奠定组织学基础。

1 材料与方法

1.1 组织材料 5～18日胚龄的红腹锦鸡胚胎。

1.2 主要试剂和仪器 4%多聚甲醛（America，Sigma，pH值=7.4），100%乙醇；培养皿，组织防脱载玻片，盖玻片，剪刀，手术刀片，镊子；解剖镜，照相机，石蜡切片机（Leica 2035，德国），显微镜（Nikon80i），等等。

1.3 试验方法

1.3.1 胚胎期皮肤的采集：用剪刀、镊子等硬物，在超净工作台上轻轻敲打种蛋外壳的钝端，并去掉气室部位的蛋壳，然后把蛋壳内的物体倒入洁净的培养皿内，用处理好的镊子分别剥离出5、7、8、9、10、11、13、16、18日胚龄的红腹锦鸡胚胎，并用手术刀片固定，取背部皮肤约2 cm2，随后将红腹锦鸡胚胎浸泡到4%多聚甲醛中，4℃过夜保存，固定24 h左右。

1.3.2 石蜡包埋及组织切片的制作：选择8、9、11、16日胚龄红腹锦鸡胚胎背部皮肤制作石蜡切片，步骤如下。

①固定：将红腹锦鸡胚胎浸泡到4%多聚甲醛中，4℃过夜保存，固定24 h左右。

②脱水：70%乙醇漂洗2 h；80%乙醇漂洗2 h；95%乙醇漂洗2 h；100%乙醇漂洗过夜，第2天再换1次100%乙醇；在-20℃可长期保存。梯度酒精均用DEPC水配制。

③石蜡包埋：二甲苯透明2次，每次30 min，50%二甲苯和50%石蜡混合1 h，抽气过夜，换全蜡。

④组织切片：修整石蜡块，并将石蜡块粘在大小合适的固定物上，根据组织的方向随时调整切片刀口与石蜡块的方向，并用解剖镜随时观察调整切片角度，切片厚度为6 μm；捞片。

⑤HE染色：将石蜡切片放入55℃烘箱内20 min，取出切片置于室温晾20 min；二甲苯，5 min；二甲苯，5 min；100%乙醇，5 min；100%乙醇，5 min；95%乙醇，2 min；80%乙醇，2 min；70%乙醇，2 min；蒸馏水，3 min；苏木素，1 min；自来水，3 min；盐酸酒精分化，2 s；自来水，3 min；饱和碳酸锂返蓝，30 s；自来水，3 min；伊红，5 min；95%乙醇，5 min；95%乙醇，5 min；100%乙醇，5 min；100%乙醇，5 min；二甲苯，3 min；二甲苯，3 min；用中性树胶封片，在显微镜下观察并拍照。

1.4 胚胎实体及羽毛毛囊结构观察 观察不同胚龄红腹锦鸡的实体胚胎，使用显微镜观察不同胚龄红腹锦鸡的羽毛毛囊结构，首先在4倍镜下找到视野，然后在10倍镜、20倍镜、40倍镜下观察纵切切片。

2 结果与分析

图1 不同胚龄红腹锦鸡的胚胎发育

2.1 红腹锦鸡实体胚胎观察结果 通过解剖镜及微距相机拍照可见，5日胚龄的红腹锦鸡胚胎体长仅1 cm左右，体表光滑，且外部由一层透明黏膜包裹（图1A）；8日胚龄时体长约2.5 cm，眼睛发育明显，体表仍未观察到明显的羽毛芽（图1C）；9日胚龄时胚胎长度约3 cm，头部和眼睛继续发育，头部、背部、大腿及尾部皮肤均有突起的羽毛芽出现，并且随着胚龄的增加突起数量逐渐增多且明显 （图1D）；10日胚龄时体长约4 cm，翅膀表面也出现突起的羽毛芽 （图1E）；11日胚龄时体长约5 cm，沿中轴线两侧的胸部及腹部也出现少量突起的羽毛芽（图1F）；13日胚龄时体长约7 cm，可以观察到有羽毛芽从头部皮肤生长出来，并一直伸长形成头部羽毛，背部的羽毛芽从中轴两侧生长出来，胸部及腹部也有羽毛芽长出，同时翅膀、腿部、尾部均发现有羽毛芽长出，随着发育的不断进行羽毛芽不断伸长，并且数量不断增加直至将翅膀、腿部、尾部完全覆盖（图1G）；16日胚龄时，羽毛已经覆盖全身，背部羽毛长约2～3 cm（图1H）；至18日胚龄时，体长达到10 cm，羽毛覆盖整个头部、背部、颈部以及胸腹部，背部羽毛超过3 cm（图1I）。在红腹锦鸡的胚胎期，背腹轴相比，背部羽毛颜色较腹部更深，呈现黑棕色，腹部羽毛颜色较浅，呈现亮棕色，单根羽毛的前端呈现淡黄色，后半段呈现黑色。

图2 不同胚龄红腹锦鸡的背部皮肤组织结构

红腹锦鸡胚胎发育周期为20～21 d，9日胚龄之前体表未观察到羽毛芽凸起，从9日胚龄开始，头部和背部可观察到羽毛芽。翅膀部位羽毛发育较为迟缓，胸腹部皮肤发育最为缓慢，胚胎发育到第11天时，才能从中轴线两侧观察到少量突起的羽毛芽。与鹅胚胎发育不同的是红腹锦鸡大部分羽毛呈黑棕色，这是由于大量黑色素和少量真黄素在羽毛中沉积而造成的；红腹锦鸡胚胎只有胸腹部羽毛呈黄色，这是由于羽毛中真黄素的量大于真黑素所致。

2.2 显微镜下红腹锦鸡胚胎切片观察结果 从红腹锦鸡胚胎切片的HE染色图可以看出，8日胚龄时背部皮肤呈多层结构，未见羽毛芽发育（图2A，2a）；9日胚龄时，真皮细胞在表皮囊泡的下方聚集，并形成羽毛芽表皮基板 （图2B，2b）；11日胚龄时，羽毛芽不断伸长，羽毛毛囊发育进入长芽阶段，此时可以观察到黑色素已在羽毛的远端形成（图2C，2c）；至16日胚龄时，由于背部羽毛的毛囊腔被羽毛芽填充，使其开始逐渐消失，此时羽毛鞘和毛囊壁已紧贴在一起，并成为一个单层，同时羽毛纤维上有黑色素沉积，使毛囊颜色开始变深 （图2D，2d）。

3 讨论

羽毛的生长发育源于毛囊。毛囊由真皮和表皮组成，毛囊形态发生的信号起源于真皮，两者之间的信号传递过程对毛囊发育起着重要作用。Widelitz等［5］将禽类胚胎期毛囊发育分为4个连续的阶段，即宏观排列、微观排列、毛囊形态发生和芽内形态发生。在鸡羽毛研究方面，已有研究指出鸡羽毛毛囊发育大体可分为早期变化和晚期变化2个方面［12］，这与该试验结果大致相符。在该研究中，红腹锦鸡羽毛毛囊发育也大致分为2个阶段，9～11日胚龄即为早期毛囊形态发生阶段。

从红腹锦鸡胚胎的HE染色图中可以看出，在8日胚龄时，位于表皮下方的细胞开始增殖并聚集。Noramly等［11］认为该类细胞为间充质细胞，其在羽区下方增殖并形成了一层致密的真皮组织。9日胚龄时，羽芽原基开始形成；随着表皮的不断隆起，羽芽开始形成；在该阶段，羽芽发育的前期是对称的，随后建立起前—后轴，由于前端细胞分裂速度快于后端，从而导致羽芽向一侧倾斜，并与皮肤表面呈一定的角度。Chen等［13］研究表明，前—后轴的建立与Notch/Delta的信号调节有关。该研究中，红腹锦鸡在11日胚龄时，长芽基部周围的表皮开始内陷，并形成了毛囊原型，羽毛发育进入短芽阶段；此时，短芽大部分在羽区内以对称的形式呈现，只有少部分形成了前后不对称的羽芽；随着发育的不断进行，羽芽不断伸长，最后形成了长芽；16日胚龄时，大部分的羽毛毛囊发育完全，可以明显地观察到羽毛中有色素沉积。

［1］陈服官，杨兴中，刘诗峰，等.陕西秦岭西段 3种雉鸡种群密度变化的研究［J］.西北大学学报：自然科学版，1992，22（1）：71-77.

［2］李丽霞，张宏杰.红腹锦鸡研究现状［J］.四川动物，2006，25（4）：906-909.

［3］郑作新.中国动物志（鸟纲第四卷：鸡形目）［M］.北京：科学技术出版社，1978：181-187.

［4］姚建初.太白山自然保护区的红腹锦鸡［J］.四川动物，1991，10（2）：37-38.

［5］WIDELITZ R B，JIANG T X，YU M，et al.Molecular biology of feather morphogenesis：a testable model for Evo-devo research［J］.J Exp Zool，2003（298B）：109-122.

［6］HARDY M H.The secret life of the hair follicle［J］. Trends Genet，1992，8（2）：55-61.

［7］李莹，舒鼎铭.鸡羽毛发生发育特征概况［J］.2013，38（6）：1-6.

［8］杨童奥，孙永峰，吴伟，等.鹅羽毛生长发育规律及其影响因素的研究［J］.吉林畜牧兽医，2012（1）：40-42.

［9］马凤莲，郭芳，娄玉杰.吉林白鹅羽毛（绒）生长发育规律的研究［J］.中国畜牧兽医，2012，39（5）：119-121.

［10］于辉，赵红娟，李华，等.咔叽—康贝尔鸭羽毛发育的研究［J］.中国家禽，2013，35（22）：9-12.

［11］NORAMLY S，FREEMAN A，MORGAN B A.β-catenin signaling can initiate feather bud development［J］. Development，1999，126（16）：3509-3521.

［12］YU M，YUE Z C，WU P，et al.The developmental biology of feather follicles［J］.Int J Dev Biol，2004 （48）：181-191.

［13］CHEN C W，CHUONG C M.Dynamic expression of lunatic fringe during feather morphogenesis：a switch from medial-lateral to anterior-posterior asymmetry［J］. Mech Dev，2000，91（1/2）：351-354.

（责任编辑：赵俊利）

Development Characteristics of Feather Bud of Chrysolophus pictus in Embryonic Period

ZHANG Rong-yu，HAO Yu，YIN Jun
（College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot010018，China）

The aims of the present study were to observe the histological structure of feather follicles of Chrysolophus pictus in embryonic period and its morphological changes,and to provide a histological base for the investigation of molecular regulation mechanism of Chrysolophus pictus feather follicles development.The development characteristics of Chrysolophus pictus embryos with 5,7,8,9,10,11,13,16,18-day embryonic ages were observed,respectively.The back skin of Chrysolophus pictus embryos with above-mentioned embryonic ages were collected respectively and were used to prepare paraffin sections which were subsequently stained using a standard HE staining method.The morphological structure of feather follicles was observed using an optical microscope.The feather buds development of Chrysolophus pictus embryo with 9-day embryonic age was initially observed,and the pigment deposition in feather follicles was found.In 16-day embryonic age,the development of feather follicles was basically completed,and the body surface of Chrysolophus pictus embryo was covered with feather.The results of the study may provide a histological base for clarifying the molecular regulation mechanism of feather development of Chrysolophus pictus.

Chrysolophus pictus；embryo；feather bud；development

S831.891

A文章顺序编号：1672-5190（2016）02-0001-04

2016－01－10

项目来源：内蒙古自治区自然科学基金重大项目（2013ZD06）；国家星火计划项目（2013GA640014）。

张容宇（1989—），女，硕士研究生，主要研究方向为动物分子遗传学。

尹俊（1967—），男，教授，博士，主要研究方向为动物分子遗传学。