利用GWAS筛选影响野猪被毛表型变异的候选功能基因

吴永龙，郭 娟

（贵州师范大学生命科学学院，贵州 贵阳 550025）

利用GWAS筛选影响野猪被毛表型变异的候选功能基因

吴永龙，郭 娟

（贵州师范大学生命科学学院，贵州 贵阳 550025）

识别野生动物群体内潜在影响动物表型变异的相关基因是进化遗传学研究的主要目的，而动物毛色是研究动物被毛表型形成遗传机制的最佳模型之一。应用Illumina公司提供的猪60 k SNP基因芯片对选取的62只不同被毛表型的野猪个体进行基因分型，利用SNP分析结果，通过对照全基因组关联分析（GWAS）识别影响野猪被毛表型差异的相关变异。结果表明，识别了6个与野猪被毛表型相关的基因组变异区域， 分别位于 SSC1 （ALGA0001794，ASGA0006416）、SSC2（ASGA0011559）、SSC6（H3GA0018683）、SSC7（ASGA0035535）和 SSC14（ASGA0060641）；最显著相关的 SNP（ALGA0001794）位于猪1号染色体上（SSC1）的27 899 596～27 899 696 bp区间（P=2.96×10-5）。该研究初步鉴定了6个与野猪毛色性状相关的易感位点，为进一步研究野猪不同毛色性状的形成机制提供了基础。

野猪；被毛表型；全基因组关联分析；基因组变异；单核苷酸多态性

了解动物的基因型与表型之间的联系，可以阐明动物群体内表型变异形成的遗传进化机制［1］。建立基因型与表型之间的联系，可以揭示野生动物和家养动物的起源以及维持动物表型变异的机制，也有助于了解动物驯化的历史［2］。动物毛色是研究动物被毛表型形成遗传机制的最佳模型之一［1］。野猪是一种重要的野生动物种质资源，其是家猪的祖先。野猪的毛色通常从深灰色到黑色或褐色变化，并且不同地区分布的野猪存在毛色差异。在大多数野猪群体内，所有个体享有相同的被毛表型是重要的品种特征。因此，野猪群体内毛色表型的多样性以及维持表型多样性的遗传基础是值得深入研究的科学问题。

大部分动物的毛色多样性主要由2种基本黑色素的相对量决定，即真黑素（黑/棕）和棕黑素（黄/红）［3］。在野生型扩展等位基因存在的情况下，通常需要条纹等位基因的表达。有研究表明，MC1R和ASIP基因的突变与猪的不同毛色表型有关［4-5］。Ren等［6］研究发现，TYRP1基因突变能够影响猪的棕褐色被毛表型。Johansson等［7］研究表明，猪至少存在7个KIT基因的等位基因位点，这些位点共同影响猪的不同被毛表型效应。

将 MC1R、TYRP1、ASIP和KIT等基因作为候选基因，可以用来揭示野猪群体内相关基因的突变对其不同被毛表型变异的效应。同时，深入研究这些基因的突变特征，对于探讨野猪种群体中不同毛色表型个体的出现机制及其复杂表型的模式具有重要意义。这些毛色基因的突变已经在一些驯化猪种中引起了毛色表型的变异，但不会影响其野生近缘种的形态多样性。虽然大多数与毛色表型相关的突变基因很可能出现在具有祖先特征的野生种群中，但是人工选择导致了它们的固定和频率的增加，因此，人工选择是家养动物大量表型变异形成的主要因素。研究表明，一些相似的毛色表型可以由不同的基因突变所引起。基于相关的文献报道可以推测，家猪和野猪的类似毛色表型可能存在不同的遗传变异基础。

图1 野猪毛色表型

除了上述报道的突变频率较高的基因外，其他的毛色表型相关基因也逐渐被发现和研究，特别是在野生动物群体中。研究表明，某些被新发现的毛色表型相关基因在不同的脊椎动物群体内具有很高的保守性，并经常影响动物适应性毛色表型的形成［8］。 全基因组关联方法（GWAS）已被成功地应用于多个相关性状的功能基因定位和因果基因的鉴别，例如，Karlsson等［9］应用该技术发现了影响犬毛色变异的单基因性状，包括白色和斑点毛色分布表型。该研究旨在通过利用GWAS技术筛选与野猪不同毛色表型形成相关的候选基因，为揭示野猪的被毛颜色表型的遗传变异机制，阐明候选功能基因的相互作用分子机制提供理论基础，同时也为野猪种质资源的保护和利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和表型记录 共选取来自不同群体的62只野猪，其中黑色毛色5只、棕黄色毛色5只、褐红色毛色3只、黑棕色毛色18只，深黑棕色毛色14只、银棕色或银色毛色10只、灰褐色毛色7只（见图1）。野猪的个体被毛表型通过直接肉眼观察鉴定和户外拍摄照片确定。同时采集野猪的耳组织样品，于-20℃储存，用于基因组DNA的提取。

1.2 SNP分型和质量控制 利用标准的苯酚/氯仿提取法或使用DNA提取试剂盒 （天根生化科技有限公司）从耳组织样品中提取DNA。样品DNA质量用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。所提取的DNA样品均稀释至100 ng/μL。样品DNA的浓度和质量达到Illumina公司的猪60k SNP基因芯片分析要求后，根据产品说明书进行野猪全基因组SNP基因型的判定。在进行统计分析之前，严格控制样本的SNP检出质量，以确保试验结果的可靠性。根据试验要求，所有SNP质量检测成功率＜98%的基因分型个体在分析时被排除。此外，检测的SNP次等位基因频率 （MAF）＜3%、哈迪温伯格平衡 P值＜0.00001或试验个体有超过10%的基因型丢失，该类样本个体也在分析时被排除。

1.3 种群分层评估 利用STRUCTURE 2.0软件推测种群结构和群体混杂度。使用多座位基因型来评估个体和群体，推算一个特定群体内的所有个体的亲本群体数（K）。对用于模拟数据得到的K的代表值，进行9次独立的程序运行（2≤K≤10）。所估计的个体成员系数使用DISTRUCT软件显示，其代表了祖先亚群中的小部分基因组 （Q矩阵）。通过SPAGeDi软件，应用SNP基因型构建一个标准的相关性矩阵（K矩阵），用以说明群体层化和样本结构（http∶//ebe.ulb.ac.be/ebe/SPAGeDi.html）。

1.4 统计学分析 充分考虑所构建的群体结构（Q矩阵）和亲属矩阵（K矩阵）所出现的假阳性现象。使用基因组控制方法（GC）调整群体层化现象。随后，对关联性分析所得的显著性P值使用GC参数进行校正。用于纠正群体层化的GC方法一般在单个群内使用。该试验研究的野猪是单个群体，但是出现了显著的亚群结构，因此，再次实施EIGENSTRAT分析方法，校正2个主要遗传变异的组成。

GWAS是在所有的SNP次等位基因频率＞0.05和检测率＜95%的基础上进行。应用一般线性模型或线性混合模型进行GWAS分析。全基因组显著性经过了10万次的表型和基因型间的运算。最显著性关联分析结果使用似然比检验进行评价，显著性P值的阈值＜10-6，使用Bonferroni校正多重检验［（0.05/42174）=1.19×10-6］。 获得的预期全基因组 P值的分布用分位数图（QQ图）表示。用R软件中自主编写的QQ图对群体分层效应进行评估。若观测曲线趋于预期置信度，说明群体分层效应得到了很好的控制；若观测曲线线尾显著高于预期曲线度，则表明该SNP位点可能是影响野猪被毛表型变异相关的易感位点。

2 结果与分析

2.1 SNP数据 该研究使用的猪60k SNP基因芯片含有62 163个SNP，利用该基因芯片对62头野猪的DNA进行基因分型。按照SNP质控标准，共获得了42 174个有效的SNP用于后续分析。所有SNP基于当前猪基因组10.2版本注释的基因组位置（http∶//www.sanger.ac.uk/Projects/S_scrofa/）。

2.2 群体层化分析 在最初分析没有进行任何参数校正的情况下，存在系统偏差的事实。通过QQ校正后（见图2），对42 174个SNP进行全基因组关联。结果表明，在QQ图尾部有6个位点显著偏离零假设分布，提示存在影响野猪被毛表型相关的易感基因位点。经GC法调整后也获得了类似的结果。

图2 QQ图

2.3 全基因组关联研究（GWAS） 野猪的被毛表型显示极端差异变化，从暗灰色至黑色或褐色。为了识别与野猪毛色表型性状相关的基因位点，利用Illumina公司的猪60k SNP基因芯片分型结果，进行了GWAS分析。结果表明，通过Bonferroni校正后，没有发现基因组水平显著相关的位点，但存在一些潜在相关的位点，例如位于SSC1（ALGA0001794，ASGA0006416）、SSC2（ASGA0011559）、SSC6（H3GA0018683）、SSC7（ASGA0035535）和SSC14（ASGA0060641）的相关突变，最显著相关的SNP（ALGA0001794）位于 1 号染色体（SSC1）的27 899 596～27 899 696 bp 区间（P=2.96×10-5）（见表1、图3）。

3 讨论

野猪的驯化以及随后的人工选择是造成野猪和家猪的表型性状之间存在极端差异的主要原因，尤其是二者被毛表型性状之间的差异。遗传学研究表明，动物的毛色性状变异伴随着整个动物驯化的历程。从动物的驯化到当前的育种规划，人类不仅塑造了动物表型的多样性，更重要的是改变了动物基因组的变异。动物的某种特殊表型性状的出现，是由于某些特定的基因变异已经在该种动物群体内固定了下来。

表1 GWAS筛选的影响野猪被毛表型相关的易感基因位点

图3 GWAS扫描野猪的被毛颜色模式

为了解野猪群体内潜在影响被毛表型变异的基因组突变区域，该研究利用Illumina公司提供的猪60k SNP基因芯片分型结果，进行了GWAS分析。利用该种方法共发现了6个显著的相关位点，分 别 位 于 SSC1 （ALGA0001794，ASGA0006416）、SSC2（ASGA0011559）、SSC6（H3GA0018683）、SSC7（ASGA0035535）和 SSC14（ASGA0060641），最显著相关的SNP（ALGA0001794）位于1号染色体（SSC1） 的 27 899 596～27 899 696 bp 区间 （P=2.96×10-5）。该研究结果为进一步阐明猪毛色基因的功能及揭示猪毛色的遗传机理提供了科学依据，也为研究其他种属动物的毛色调控机理提供了理论基础。

［1］HUBBARD J K，UY J A，HAUBER M E，et al.Vertebrate pigmentation：from underlying genes to adaptive function［J］.Trends Genet，2010，26（5）：231-239.

［2］FANG M Y，LARSON G，RIBEIRO H SOARES，et al.Contrasting mode of evolution at a coat color locus in wild and domestic pigs［J］.PLoS Genet，2009，5（1）：e1000341.

［3］SEARLE A G.Comparative Genetics of Coat Colour in Mammals［M］.Logos Press：London，1968.

［4］KIJAS J M，WALES R，TÖRNSTEN A.et al.Melanocortin receptor 1 （MC1R）mutations and coat color in pigs［J］.Genetics，1998，150（3）：1177-1185.

［5］KIJAS J M，MOLLER M，PLASTOW G，et al.A frameshift mutation in MC1R and a high frequency of somatic reversions cause black spotting in pigs［J］.Genetics，2001，158（2）：779-785.

［6］REN J，MAO H，ZHANG Z，et al.A 6-bp deletion in the TYRP1 gene cause the brown colouration phenotype in Chinese indigenous pigs［J］.Heredity，2011，106（5）：862-868.

［7］JOHANSSON A，PIELBERG G，ANDERSSON L，et al.Polymorphism at the porcine Dominant white/KIT locus influence coat colour and peripheral blood cell measures［J］.Anim Genet，2005，36（4）：288-296.

［8］CIESLAKM，REISSMANN M，HOFREITER M，etal.Colours of domestication ［J］.Biol Rev Camb Philos Soc，2011，86（4）：885-899.

［9］KARLSSON E K，BARANOWSKA I，WADE C M，et al.Efficient mapping of mendelian traits in dogs through genome-wide association［J］.Nat Genet，2007，39 （11）：1321-1328.

Screen of Functional Candidate Genes Associated with Variation of Coat Traits of Wild Boars by Genome-wide Association Study（GWAS）

WU Yong-long，GUO Juan
（College of Life Sciences，Guizhou Normal University，Guiyang 550025，China）

To identify the genes that potentially influencing the phenotypic characteristics variation of wild animals was the main objective of evolutionary genetics related research.Coat color was one of the optimum models that were commonly used in investigation of genetic mechanism associated with formation of animal coat traits.In this study,genetic typing test of 62 wild boars with varied coat traits was conducted by using Illumina pig 60 k SNP chips.Based on the SNP typing results,the genes associated with the variation of wild boars coat traits were identified by genome-wide association study （GWAS）.We found 6 genome variation areas associated with wild boars coat traits,locating in SSC1 （ALGA0001794，ASGA0006416）,SSC2（ASGA0011559）,SSC6 （H3GA0018683）,SSC7 （ASGA0035535）and SSC14 （ASGA0060641）,respectively.The most significantly correlated SNP was found in SSC1 and located in the region of 27 899 596-27 899 696 bp （P=2.96×10-5）.Six susceptibility gene loci associated with coat color traits of wild boars were preliminarily identified,which provides a basis for the genetic mechanism associated with formation of varied coat color traits of wild boars.

wild boar；coat traits；GWAS；genome variation；SNP

S828.2；S818.9

A文章顺序编号：1672-5190（2016）04-0014-04

2016-03-05

吴永龙（1992—），男，所学专业为园艺。

郭娟（1979—），女，副教授，博士，主要研究方向为种质资源调查与遗传育种。

（责任编辑：赵俊利）