万载黑兔微卫星标记的遗传多样性分析

黄江南，刘林秀，季华员，谢金防，周泉勇，熊立根，韦启鹏

(江西省农业科学院 畜牧兽医研究所，江西 南昌 330200)



万载黑兔微卫星标记的遗传多样性分析

黄江南，刘林秀，季华员，谢金防，周泉勇，熊立根，韦启鹏*

(江西省农业科学院 畜牧兽医研究所，江西 南昌 330200)

对万载黑兔、皖系长毛兔和比利时兔进行遗传多样性检测。利用13个微卫星位点，进行哈代-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)检验，统计3个种群的基因频率、观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、F值和遗传距离。研究结果表明：万载黑兔、比利时兔、皖系长毛兔各存在3个不平衡位点，说明群体遗传多样性较丰富。3个群体多态信息含量(PIC)平均值分别为0.35，0.48，0.31。3个群体的He平均值分别为0.40，0.54，0.37；Ho平均值分别为0.39，0.51，0.35。群体间遗传分化系数(Fst)平均为0.120 1，万载黑兔与比利时兔的遗传距离最近，为0.145 2；皖系长毛兔与万载黑兔的遗传距离最远，为0.200 0。

万载黑兔；皖系长毛兔；比利时兔；微卫星标记；遗传多样性

万载兔是江西省优良地方兔遗传资源，具有抗逆性强，耐粗饲，产仔率高，肉质好等优点[1]。作为最早列入国家畜禽遗传资源名录中的四大地方家兔品种之一，与我国其他地方兔品种相比，万载兔最具特色的是其兔毛粗短而紧密，绒毛少，非常适应南方高温高湿的气候，是少有的能适应南方气候的肉兔品种。按体型划分，万载兔可分为两种：体型小的为“火兔”，毛色以黑为主(又称万载黑兔)；体型大的为“木兔”，毛色为麻色(又名万载麻兔)。多年来，万载兔因其优良生产性能一直是江西省肉兔养殖的主要品种之一。

微卫星DNA，亦称简单序列重复，其广泛分布于各种真核生物基因组中，具有种特异性和家系特异性，是目前使用最为广泛的第二代分子标记技术之一，在度量品种遗传多样性、估测品种间遗传距离及构建系统发生树等研究中显示出了巨大的优势[2-3]。相对于国外，我国家兔分子生物学标记的研究起步较晚，但近年来发展较快。樊兆斌等[4]利用微卫星标记开展了新西兰兔、加利福尼亚兔、德国大白兔、比利时兔、日本大耳白兔等5个引进品种的多态性研究，朱玉峰等[5]对獭兔等几个品种的系统发生关系进行了分析。地方家兔资源研究方面，谢喜平等[6-7]先后利用微卫星标记对福建黄兔、闽西南黑兔开展了遗传多样性分析，刘春等[8]开展了新西兰白兔和福建黄兔的微卫星多态性比较。但有关万载兔群体遗传多样性的微卫星标记的相关研究，现尚少见报道。

本研究选取多态性较好的13个微卫星标记，检测比较包括万载黑兔在内的3个兔品种的微卫星多态性，从分子水平探讨万载兔的遗传多样性，旨在为万载兔的保种选育、培育新品种(系)和经济杂交利用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1组织样品采集及DNA提取

3个兔品种的名称、数量及采样地点见表1，基本上公母各半。采取兔耳组织样品，于体积分数为75%的乙醇中储存带回实验室，-20 ℃备用，基因组DNA的提取采用常规酚/氯仿法提取。用NanoDrop ND-2000浓度测定仪测定其浓度和纯度后于4 ℃保存备用。

表1三个兔品种的名称、数量和采样地点

Table 1Name， sample size and collecting locations of three rabbit breeds

编号家兔名称数量/只采样地点WB万载黑兔37江西省万载兔原种场B比利时兔19安徽省农业科学院畜牧兽医研究所种兔场WL皖系长毛兔32安徽省农业科学院畜牧兽医研究所种兔场

1.2仪器及试剂

东胜龙黑金刚EDC-810 PCR仪购自北京东胜创新生物科技有限公司，3730XL基因测序仪购自ABI分司，Allegra 25R台式高速冷冻离心机购自Beckman(贝克曼)公司；Taq酶和dNTP购自Fermentas公司，ROX-500 Size Standard购自Fermentas公司，荧光引物由铂尚生物技术(上海)有限公司合成。

1.3SSR引物筛选及QF-PCR 扩增

根据GenBank和文献[6，9-10]上提供的兔SSR序列及引物进行位点筛选。选择核心重复序列较多，且在多个兔品种中多态性丰富的位点。引物(表2)由上海铂尚生物有限公司合成。

表2十三个微卫星位点引物的信息

Table 2Basic information of 13 microsatellite primers

基因座引物序列(5’-3’)片段长度/bp退火温度/℃5L1E8CCAGCTGGTAATAGTAGAGAAAGGCATTTGTGGAGTGAA208～238567L1B10TTGGCAGGAAGAAAAG-GAAGATTTTTGTCATAAGCATTTGG-GAAGTG183～1925912L4A1GCTAATTACCCAAAGGAA-CATACACAGTGCAAATTTGGAAGGTCT158～1755912L5A6GGTGTGAACCACTAGATAGAACAAAATTAGGTCCCTTGTAGT247～2565612L1E11AGTGGTAGCGCTTTGGTCTGGCTCCTTGGGGCATTTG222～2305619L1G5AGTTGCTCCCACCCGATTTTATGCTGTTGGGAGTAGATT-GACC133～1435612L1C2AGGGGCCTCCATCCTCTACAATTATGTGTCAGGCAGGCT-GTGTC173～18458D6L2H3CAAATGAAATGAGGAGG-GAGATACATTGAGGACATTTGAG-TAGTGAG132～15556SAT5GCTTCTGGCTTCAACCTGACCTTAGGGTGCAGAATTATA-AGAG209～23258SAT13CAGTTTTGAAGGACACCTGCGCCTCTACCTTTGTGGGG112～12656SOL30CCCGAGCCCCAGATATTGT-TACCATGCAGCACTTCATAGTCT-CAGGTC145～16456SOL33GAAGGCTCTGAGATCTAGATGGGCCAATAGGTACTGATC-CATGT208～21556SOL44GGCCCTAGTCTGACTCTGAT-TGGGTGGGGCGGCGGGTCT-GAAAC204～21958

PCR反应体系为20 μL，分别为：10×Buffer 2.0 μL，50 ng·μL-1DNA 1.0 μL，3 mmol·L-1Mg2+0.6 μL，2 mmol·L-1dNTP 2.0 μL，1×16.67 mkat·L-1Taq酶0.2 μL，0.5 pmol·μL-1上下游引物(含FAM)各1.0 μL，ddH2O 12.2 μL。扩增反应程序如下：95 ℃ 预变性2 min，94 ℃变性30 s，根据基因引物Tm值设定退火温度(50～60 ℃)，退火50 s，72 ℃延伸1 min共40个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR产物检测，含荧光标记的PCR产物用ABI-3730XL DNA Analyzer全自动测序仪检测。上样总体积为11.5 μL，其中上样液Hi-Di Formamide 10.0 μL与ROX-500 Size Standard (标准内参)0.5 μL，PCR产物1.0 μL。

1.4数据统计分析

采用GeneMapper 4.0导出图谱文件，根据图谱中最大波峰位置判断目标条带的大小，单波峰为纯合子，双峰为杂合子，并生成Excel数据表格。利用microsatellite-toolkit软件计算等位基因杂合度(heterozygosity，H)、多态信息含量(polymorplism information content，PIC)。用Popgene32软件进行-哈代温伯格平衡检验、3个群体Nei氏标准遗传距离及相似性分析。运用SPSS 17对3个品种间的遗传多样性指标进行差异显著性分析。

2　结果与分析

2.1微卫星扩增结果及多态性

ABI-3730XLDNA Analyzer全自动测序仪对所检位点进行扫描。图1-A为位点7L1B10在万载黑兔4号样的基因型为183/183。图1-B为位点12L1E11在万载黑兔3号样的基因型为228/228。

A： 位点7L1B10在万载黑兔4号样品中的分型；B： 位点12L1E11在万载黑兔3号样品中的分型。图1　位点7L1B10和12L1E11的某个分型Fig.1　One of genotyping of microsatallite 7L1B10 and 12L1E11 locus in Wanzai black rabbits

2.2三个品种间各位点优势基因比较

优势等位基因是群体中最稳定的基因，某种程度上体现了群体特征[11]，通过分子手段检测优势等位基因在群体中的变化，可以推测群体的遗传结构变化。比较3个群体在各位点的优势等位基因频率(表3)，分别对3个群体的优势等位基因频率进行显著性分析。检验结果为PWB∶B=0.074，PWB∶WL=0.26，PB∶WL=0.708，即万载黑兔、比利时兔和皖系长毛兔在13个微卫星标记位点的优势等位基因频率上的差异不显著。

2.3各个品种间各个基因位点的遗传多样性

各微卫星位点的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、多态信息含量(PIC)、观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)值见表4。其中PIC和He是衡量群体遗传多样性的重要指标。在本研究的3个群体中PIC为0～0.73，其中位点12L5A6和19L1G5为低度多态，其余的呈中高度多态；3个群体PIC平均值分别为0.35，0.48和0.31，经F检验，比利时兔和皖系长毛兔之间差异显著，其他群体间差异均不显著(PWB∶B=0.13，PWB∶WL=0.64，PB∶WL=0.05)。He平均值分别为0.40，0.54和0.37，经F检验，各个群体之间的He值差异不显著(PWB∶B=0.11，PWB∶WL=0.80，PB∶WL=0.07)。

表3三个群体优势等位基因及频率比较

Table 3Comparison of the dominant alleles and their frequencies among three rabbits breeds

基因座优势等位基因大小/bp优势等位基因频率/%WBBWL5L1E820880.5621.0520.007L1B1018556.7650.00100.0012L4A116485.1447.3761.2912L5A625698.6581.5896.7712L1E1122886.4936.8467.7419L1G5143100.0094.7498.3912L1C218016.2234.2164.52D6L2H313452.7031.589.68SAT522881.0876.3229.03SAT1312682.4381.5856.67SOL3014570.2713.1635.48SOL3321556.7668.4298.33SOL4421150.0042.1153.23

注：WB为万载黑兔，B为比利时兔，WL为皖系长毛兔。下同。

2.4三个群体的遗传变异

在F统计量中，Fst<0.05表示品种遗传分化程度较弱，Fis<0表示观察杂合度过剩[8]。由表5可知：13个位点的Fst值19L1G5，12L1C2和SOL44等3个位点小于0.05，平均值为0.120 1，表明群体间遗传变异较大；有6个位点Fis<0，平均值为0.028 9，表明部分位点呈现杂合子过剩。

对3个品种各个位点进行哈代-温伯格检验，万载黑兔(WB)存在3个不平衡位点，比利时兔存在3个不平衡位点，皖系长毛兔存在3个不平衡位点。

表4三个兔群体中的等位基因数，有效等位基因数、基因杂合度、多态信息含量

Table 4Allele numbers， effective alleles， observed heterozygosity， expected heterozygosity and polymorphic information content in three rabbit breeds

基因座WBNaNePICHoHeBNaNePICHoHeWLNaNePICHoHe5L1E83.001.500.310.110.345.003.950.700.320.774.002.980.620.130.687L1B104.002.370.510.510.593.002.640.550.740.641.001.000.000.000.0012L4A12.001.340.220.240.264.002.680.560.530.642.001.900.360.580.4812L5A62.001.030.030.030.033.001.450.270.260.322.001.070.060.060.0612L1E113.001.320.230.270.254.002.880.580.740.673.001.840.380.450.4619L1G51.001.000.000.000.002.001.110.090.000.102.001.030.030.030.0312L1C25.004.310.740.860.785.004.600.730.890.794.003.580.480.580.53D6L2H35.002.960.580.650.646.004.570.700.680.767.001.900.430.480.47SAT52.001.410.260.320.314.001.550.360.320.403.002.130.380.520.46SAT132.001.410.250.350.293.001.450.270.320.322.001.970.370.530.50SOL304.001.880.430.490.473.002.290.490.740.583.002.060.420.450.52SOL333.002.210.460.510.563.001.930.430.420.492.001.030.030.030.03SOL443.002.650.550.700.633.002.190.440.630.565.002.350.490.650.58平均值3.001.950.350.390.403.692.560.480.510.543.081.910.310.350.37

表5三个群体在13个基因位点的哈代-温伯格检验

Table 5Hardy-Weinberg equilibrium test of three breeds

基因座FisFitFstWBP值HWBP值HWWLP值HW5L1E80.67850.73940.18930.0000**0.0004**0.0000**7L1B10-0.04130.12480.15950.3861NS0.3959NS——12L4A10.00360.08240.07910.7501NS0.2899NS0.2404NS12L5A60.10870.17460.07401.0000NS0.7504NS0.8551NS12L1E11-0.08000.11070.17660.7026NS0.7664NS0.6675NS19L1G50.75460.75990.0216——0.0024**1.0000NS12L1C20.06290.10360.04330.0338*0.0473*0.0000**D6L2H30.05170.20430.16090.0004**0.0537NS0.3390NSSAT5-0.4078-0.26520.10130.1083NS0.8737NS0.0000**SAT13-0.1018-0.01700.07690.1083NS0.2155NS0.7047NSSOL30-0.08280.11080.17890.5465NS0.1897NS0.8818NSSOL330.08790.20770.13130.4695NS0.4225NS1.0000NSSOL44-0.1376-0.09820.03460.4635NS0.2554NS0.8818NS平均值0.02890.14560.1201

注：HW为哈代-温伯格平衡；NS为非显著水平(P>0.05)。*为显著水平(P<0.05)；**为极显著水平(P<0.01)。

由表6可知：万载黑兔与皖系长毛兔的相似性最小，为0.818 8；皖系长毛兔与万载黑兔的遗传距离最大，为0.200 0。这符合品种间的变化趋势，国内外品种间的相似性较低，选育品种与本地种质资源地方品种遗传距离较远。

表6三个群体的Nei氏遗传距离及相似性系数

Table 6Nei’s genetic identity and genetic distance in three rabbit breeds

WLBWBWL****0.85780.8188B0.1534****0.8649WB0.20000.1452****

注：对角线以上是Nei氏相似性系数，对角线以下为Nei氏遗传距离。****表示同一群体不作比较。

3　讨论

江西万载兔是江西省地方优良品种，已列入国家级畜禽遗传资源目录。研究分析其遗传资源的多样性是进行本品种保护和开发利用的基础，对地方优良品种的选育提高，培育新品种、新品系具有参考意义。微卫星DNA标记具有很多优点，如信息含量高、分布均匀且广泛、多态性丰富、分析简单等，微卫星DNA标记是一种非常有效的分析生物群体遗传多样性的手段，是当前进行人类和动物品种鉴定、个体识别的重要手段[12]。

多态信息含量(PIC)是等位基因频率和等位基因数的变化函数，是衡量基因片段多态性较好的指标。多态信息含量越大，在1个群体中，该座位上杂合子比例则越大，提供的遗传信息就越高[10]。根据Bostein等[13]提出的衡量多态信息量高低的指标，PIC>0.5时，为高度多态位点；0.5>PIC>0.25时，为中度多态位点，当PIC<0.25时，为低度多态位点。本研究所选取的13个微卫星标记位点，12L1C2位点的平均多态信息含量最高为0.65，最低的是19L1G5位点，为0.04。除SOL44，D6L2H3，5L1E8为高度多态位点，12L5A6和19L1G5微卫星为低度多态位点之外，其余均为中度多态位点。所以本研究所选的13个微卫星位点可以较好地用来做群体间遗传多样性的分析。

同一微卫星座位在不同的品种(系)间以及同一品种在不同微卫星座位上的多态信息含量差异较大。品种间的差异反映了不同兔品种间遗传多样性之间的差异，如5L1E8位点在万载黑兔中的多态信息含量(PIC)为0.31，在皖系长毛兔中的多态信息含量(PIC)为0.62，反映了万载兔与选育品系遗传多样性之间存在较大的差异。而同一品种不同的微卫星座位之间的差异，例如比利时兔在5L1E8位点的多态信息含量为0.70，而在19L1G5位点则为0.09，这种差异可能是该品系在选育过程中，不同微卫星座位所受的选择压的差异造成的。

一般认为，杂合度(heterozygosity，H)是度量群体遗传变异的一个最适参数，又称基因多样度，反映群体在多个基因座位上的遗传变异。杂合度越高，表明该群体的遗传变异越多，群体的遗传多样性越高。群体杂合度越低，表明该群体的遗传一致性越高，而群体的遗传变异越少，群体遗传多样性越低[14]。期望杂合度(He)是从一个基因库中随机抽出为非纯合基因的概率，此杂合度值越大，群体内的遗传变异就越大。万载黑兔、比利时兔和皖系长毛兔He平均值分别为0.40，0.54和0.37，说明万载黑兔、比利时兔和皖系长毛兔存在较丰富的遗传变异，其中比利时兔的近交程度较弱，具有丰富的遗传多样性。

另外，观察杂合度值(Ho)与期望杂合度(He)值相差越小，说明该品种受外来选择，近交等因素的影响越小，群体处于遗传平衡状态[15]，本研究中观察杂合度值接近期望杂合度值，万载黑兔、皖系长毛兔、比利时兔各存在3个位点显著偏离HWE，其余位点，P>0.05，均符合HWE，表明了3个种群的遗传结构均具有遗传稳定性和均一性。

遗传分化系数(Fst)是反映群体间遗传分化的重要指标Fst值介于0～0.05之间说明种群间分化很弱，0.05～0.15表示中等分化，0.15～0.25表示分化大[16]。F值统计结果表明：3个兔群体的平均Fst为0.120 1，即12.01%的遗传变异是由品种间差异形成，87.99%来自群体内部的遗传多样性，3个种群间呈现中等程度的遗传分化。

遗传距离是研究物种遗传多样性的基础，它反映了所研究群体的系统进化，用来描述群体的遗传结构和品种间的差异。如万载黑兔与皖系长毛兔的相似性最小，为0.8188，皖系长毛兔与万载黑兔的遗传距离最大，为0.2000，皖系长毛兔是以德系安哥拉兔、新西兰白兔2个品种间杂交以及20余年的继代选育而成，属中型粗毛型长毛兔。长毛兔为毛用兔，与其他群体交流较少，另外，皖系长毛兔为选育品种，也证明了选育品种与本地种质资源地方品种遗传距离较远。

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(责任编辑卢福庄)

Analysis on genetic diversity of Wanzai black rabbit based on microsatellite markers

HUANG Jiang-nan， LIU Lin-xiu， JI Hua-yuan， XIE Jin-fang， ZHOU Quan-yong， XIONG Li-gen， WEI Qi-peng*

(InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryScience，JiangxiAcademyofAgriculturalSciences，Nanchang330200，China)

Genetic diversities of Wanzai black rabbit， Wanxi Angora rabbit and Belgian rabbit were studied using 13 microsatellite markers. The genetic diversity was disclosed by calculating the allele frequency， heterozygosity (Ho)， expected heterozygosity (He)， F value and genetic distance. It was shown that there were 3 imbalance locus in each of the above mentioned rabbit populations， indicating a rich genetic diversity. The average polymorphism information contents (PIC) of Wanzai black rabbit， Wanxi Angora rabbit and Belgian rabbit were 0.35， 0.48， 0.31， respectively. The average He were 0.40， 0.54， 0.37， respectively， and the average Ho were 0.39， 0.51， 0.35， respectively. The average genetic differentiation coefficient (Fst) value among populations was 0.120 1. The observed closest genetic distance was 0.145 2 between Wanzai black rabbit and Belgian rabbit， and the observed farthest genetic distance was 0.200 0 between Wanzai black rabbit and Wanxi Angora rabbit.

Wanzai black rabbit; Wanxi Angora rabbit; Belgian rabbit; microsatellite markers; genetic diversity

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.04.06

2015-08-18

江西省农业科学院博士启动基金(2011CBS009)

黄江南(1984—)，女，江西南昌人，助理研究员，博士，主要从事畜禽遗传育种与繁殖研究。E-mail: huangjiangnan@webmail.hzau.edu.cn

，韦启鹏，E-mail: weiqp66@sina.com

S829.1

A

1004-1524(2016)04-0574-06

黄江南，刘林秀，季华员，等. 万载黑兔微卫星标记的遗传多样性分析[J]. 浙江农业学报，2016，28(4): 574-579.