罗汉松实多糖含量测定方法研究＊

庞逸敏，林彩琴，潘娇红，蒋伟哲，黄增琼

（广西医科大学药学院，广西南宁530021）

罗汉松实多糖含量测定方法研究＊

庞逸敏，林彩琴，潘娇红，蒋伟哲，黄增琼

（广西医科大学药学院，广西南宁530021）

目的建立测定罗汉松实多糖含量的紫外分光光度法。方法采用超声辅助提取法提取多糖，以葡萄糖为对照品，采用硫酸-苯酚比色法测定罗汉松实中多糖的含量，紫外检测波长为490 nm。结果葡萄糖质量浓度在20～100 μg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系，回归方程为Y=0.008 0 X-0.015 8，r=0.998 0(n=5），平均回收率为101.64%，RSD为4.77%(n=6)。罗汉松实多糖平均含量为4.74 mg/g(以葡萄糖计)。结论该方法操作简单，重现性好，结果准确、可靠，可用于罗汉松实多糖含量的测定。

罗汉松;多糖;含量测定;超声辅助提取

罗汉松实为罗汉松科植物罗汉松Podocarpus macrophyllus（Thunb.）D.Don的果实，又名土杉，产自我国长江以南地区，目前在我国有4个变种，多为庭园观赏树，在广西北海已有较大规模种植，每年可产出大量的罗汉松果实。罗汉松果实由种子和花托组成，其花托部分可当作水果直接食用，具有补肾益肺、治血虚面色萎黄和心胃痛的功效［1］。种子有补中益气、祛风除湿的功效，根皮能活血、止痛、杀虫［2］;叶子能止血，可用于咳血、吐血［1］。Park等［3-5］从罗汉松叶中分离得到了罗汉松内酯和罗汉松二萜等十几种成分。目前，对罗汉松叶的化学成分研究报道较多，但罗汉松果实的研究国内外均未见报道。多糖作为一类重要的生物大分子物质，具有抗癌、抗氧化、抗病毒、调节免疫等生物活性［6-7］。笔者采用超声辅助提取法［8］对罗汉松实中的多糖进行了提取，并采用Dubois等［9］提出的硫酸-苯酚比色法测定了罗汉松实多糖的含量，为罗汉松果实的药效学研究及开发利用提供依据。现报道如下。

1　仪器与试药

1.1仪器

1.2试药

罗汉松实鲜品采自广西北海，经广西医科大学药学院生药学教研室朱丹博士鉴定，为罗汉松科植物罗汉松Podocarpus macrophyllus（Thunb.）D.Don的果实。葡萄糖对照品(中国食品药品检定研究院，批号为110833-201205);无水乙醇、95%乙醇、苯酚、浓硫酸及其他试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1溶液制备

2.1.15%苯酚试剂

准确称取苯酚5.0 g，加水溶解，置100 mL棕色容量瓶中定容，得5%苯酚试剂，于4℃冰箱保存备用。

2.1.2葡萄糖标准溶液

精确称取干燥至恒重的葡萄糖对照品0.100 0 g，加水溶解，置100 mL容量瓶定容，配制成质量浓度为1 g/L的葡萄糖溶液，精密量取10 mL，定容至100 mL，得质量浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液［10］。

2.1.3供试品溶液

面对自贸园区可能给自由贸易协定带来的贸易偏移等消极影响，大部分自由贸易协定采取了将自贸园区法律制度纳入其规则体系的应对措施。具体而言，自由贸易协定应对自贸园区挑战的根本方法是不再承认自贸园区货物可同时叠加享有自由贸易协定的减免税收待遇，从而将自贸园区货物与区域贸易货物拉回到相近的竞争“起跑线”。通常，自由贸易协定会限制或禁止自贸园区货物以免税的方式流通进自由贸易协定成员国，自贸园区货物需要在出口市场缴纳相应的进口税，或不承认自贸园区给予非区域进口零件或装备所享受的国内税收优惠。但各个自由贸易协定采取的方式及审查标准并不相同。

粗多糖的提取:准确称取罗汉松实100 g，加120 mL无水乙醇回流1 h，趁热滤除溶剂，重复2次。滤渣用95%乙醇润洗3次，每次20 mL，加水400 mL，超声(功率60%，300 W)提取30 min，80℃水浴再提取60 min，趁热过滤。重复提取2次，合并滤液并浓缩至10 mL。浓缩液加4倍量无水乙醇，置4℃冰箱中过夜后3 000 r/min离心20 min，沉淀物用无水乙醇、丙酮洗涤至无色，得粗多糖［11］。

Sevage法脱蛋白［12］:粗多糖加40 mL蒸馏水溶解，加入Sevage试剂正丁醇∶氯仿（1∶5，V/V），震荡30 min，5 000 r/min离心15 min，收集多糖溶液并定容至100 mL容量瓶中，得供试品溶液。

2.2测定波长选择

精密吸取供试品溶液1.0 mL，置具塞试管，加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，快速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，静置5 min，30℃水浴中保温20 min，静置10 min，以蒸馏水同法操作为空白，于460～510 nm波长处测定吸光度，确定最大吸收波长为490 nm。

2.3方法学考察

标准曲线绘制［13］:分别精密量取质量浓度为0.1 g/L的葡萄糖标准溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置具塞试管，分别加水至1 mL，各加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀。快速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，静置5 min，30℃水浴中保温20 min，静置10 min，以1.0 mL蒸馏水加入1 mL苯酚和5 mL浓硫酸为空白，于490 nm波长处测定各管吸光度。以葡萄糖质量浓度(X)为横坐标、吸光度(Y)为纵坐标制绘制标准曲线，得回归方程Y= 0.008 0X-0.015 8，r=0.998 0（n=5)。结果表明，葡萄糖质量浓度在20～100 μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。标准曲线见图1。

图1　标准曲线图

精密度试验:精密量取葡萄糖标准溶液0.5 mL，按2.1.3项下方法操作，于490 nm波长处测定吸光度，平行测定6次。结果的RSD为0.21%(n=6)，表明仪器精密度良好。

显色稳定性试验:精密量取供试品溶液2 mL，按2.1.3项下方法操作，490 nm波长处测定吸光度，分别于0，30，60，90，120，150，180 min时测定吸光度。结果的RSD为1.25%(n=7)，表明供试品溶液在3 h内稳定。

重复性试验:精密量取供试品溶液6份，每份1 mL，按2.1.3项下方法操作。结果吸光度的RSD为3.31% (n=6)，表明方法重现性良好。

加样回收试验:精密量取已知质量浓度的罗汉松实多糖溶液0.5 mL，分别加入质量浓度为0.1 g/L的葡萄糖标准溶液0.25 mL及蒸馏水0.25 mL，按2.1.3项下方法操作，平行测定6次，测定吸光度并计算回收率。结果见表1。

表1　加样回收试验结果（n=6）

2.4样品含量测定

取罗汉松实2份，按2.1.3项下方法操作，精密量取供试品溶液1 mL，依法测定吸光度，每份测定3次，代入标准曲线计算葡萄糖的质量浓度。含量计算公式为:多糖含量(mg/g)=CDV/W，其中C为样品中葡萄糖质量浓度(g/L)，D为样品溶液的稀释倍数，V为多糖溶液的体积(mL)，W为样品质量(g)。结果罗汉松实多糖平均含量为4.74 mg/g(以葡萄糖计)，RSD为2.73%。结果见表2。

表2　样品多糖含量测定结果

3　讨论

多糖含量的测定方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、地衣酚-硫酸法、Somogyi-Nelon法等多种方法。本试验是利用多糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成羟甲基糠醛，羟甲基糠醛与苯酚缩合成有色化合物，该化合物颜色深浅与糖的浓度成正比。方法简便，且供试液在3 h内显色稳定，重现性较好，但要注意除去单糖、醇溶性蛋白等干扰性成分。

本试验中，在进行多糖样品提取时，先用无水乙醇回流除去脂溶性成分和色素，再用Sevage法除去蛋白，可排除样品中杂质的干扰。采用蒸馏水对花托中的色素进行提取并进行光谱扫描，发现色素于490 nm波长处无吸收，可排除色素对测定结果的干扰。

采用本法测定罗汉松实鲜品多糖含量时，要将花托充分捣烂，否则所测得含量结果偏差较大。

本试验以葡萄糖标准品为对照，用紫外分光光度法测定罗汉松实中多糖含量，得出罗汉松实多糖的含量为4.74 mg/g(以葡萄糖计)。该方法操作简单，重现性好，结果准确可靠，具有实际应用价值，可测定罗汉松实多糖的含量，为罗汉松实的质量控制和资源开发提供科学依据。

［1］江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海：上海科学技术出版社，1977：1 360-1 361.

［2］肖培根，连文琰.中药植物原色图鉴［M］.北京:中国农业出版社，1999：30.

［3］Park HS，Takahashi Y，Fukaya H，et al.S-R-Podolactone D，a new sulfoxide-containing norditerpene dilactone from Podocarpus macrophyllus var.maki［J］.Journal of Natural Products，2003，66（2）：282-284.

［4］Park HS，Yoda N，Fukaya H，et al.Rakanmakilactones A-F，new cytotoxic sulfur-containing norditerpene dilactones from leaves of Podocarpus macrophyllusvar.maki［J］.Tetrahedron，2004，60（1）：171-177.

［5］Park HS，Kai N，Fukaya H，et al.New cytotoxic norditerpene dilactones from leaves of Podocarpus macrophyllus var.maki［J］. Heterocycles，2004，63（2）：347-357.

［6］方金红.多糖化学修饰方法的研究进展［J］.中国药业，2014，23（19）：4-8.

［7］尹艳，高文宏，于淑娟.多糖提取技术的研究进展［J］.食品工业科技，2007(2)：248-250.

［8］游丽君，邹林武，梁彦豪，等.超声-高温热水提取香菇多糖及其产物特性研究［J］.现代食品科技，2013，29(9)：2 167-2 172.

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［11］李粉玲，蔡汉权，林曼莎.超声波提取草莓多糖的工艺研究［J］.江西化工，2013（3）：66.

［12］刘晓红，肖凯军.金樱子粗多糖的脱蛋白研究［J］.食品科技，2007(1)：102-104.

［13］罗傲雪，范益军，罗傲霜，等.不同提取方法对石斛多糖含量测定的影响［J］.中国药房，2010，21(7)：601-602.

Content Determination of Podocarpus Macrophyllus

Pang Yimin，Lin Caiqin，Pan Jiaohong，Jiang Weizhe，Huang Zengqiong
（College of Pharmacy，Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi，China533021）

ObjectiveTo determine the polysaccharides content of fruit from Podocarpus macrophyllus.MethodsThe ultrasonic-assisted extraction method was used to extract polysaccharides from the fruit ofPodocarpus macrophyllus and the polysaccharides content was determined by sulphuric acid-phenol colorimetric method，with glucose as

ubstance.The UV detection wavelength was 490 nm.ResultsGlucose absorbance showed a good linear relationship with the content in the range of 20-100 μg/mL.The regression equation is Y=0.008 0 X-0.0158，r=0.998 0（n=5），and the average recovery rate was 101.64%，RSD=4.77%（n=6）.The average content of polysaccharides inPodocarpus macrophyllus is 4.74 mg/g（according to glucose）.ConclusionThis determination method is simple to be operated，with good reproducibility，and the results are accurate and reliable，which can be used to determine the polysaccharides content of Podocarpus macrophyllus.

Podocarpus macrophyllus；polysaccharides；content determination；ultrasonic-assisted extraction

R284.1;R282.71

A

1006-4931（2016）13-0022-03

庞逸敏（1991-），女，汉族，广西玉林人，硕士研究生，研究方向为神经药理学，(电子信箱) PYMPYMPYM1219@163.com;黄增琼（1979-），壮族，广西南宁人，博士研究生，副教授，研究方向为中药民族研究与开发，本文通讯作者，（电话）0771-5352512。

2016-01-10;

2016-02-07）

＊广西南校中青年教师基础能力提升项目，项目编号:KY2016YB096;广西南宁市生物制药产业大型科学仪器与设备共享与服务平台建设—广西医科大学共享平台建设，项目编号:20121052-1。