贴梗海棠花粉生活力的测定

朱金儒，孙晓光，张晓曼

（1.保定市交通运输局，河北保定　071000；2.河北农业大学，河北保定　071000）

贴梗海棠花粉生活力的测定

朱金儒1，孙晓光1，张晓曼2

（1.保定市交通运输局，河北保定071000；2.河北农业大学，河北保定071000）

以贴梗海棠初开花朵为试验材料，研究了TTC、碘原碘化钾2种染色剂测定花粉生活力的效果，离体培养时葡萄糖对花粉萌发的影响和3种不同温度（15、20、25益）条件下的花粉萌发的变化规律，3种贮藏条件（常温、4益、-23益）对花粉贮藏的影响。结果表明：不同染色剂测定的花粉生活力差异显著，TTC染色法（76.26%）显著优于碘原碘化钾染色法（42.46%）。在一定范围内，培养基葡萄糖浓度和萌发温度提高能促进花粉的萌发，超出范围后抑制萌发。试验证明：最佳的葡萄糖浓度为10%，最佳的萌发温度为20益。贮藏温度对花粉生活力的影响显著，其中最佳的贮藏条件是冷冻干燥，但综合考虑成本、便捷性等因素，实际应用中一般选择4益。

贴梗海棠；花粉萌发；生活力测定；贮藏条件

贴梗海棠（Chaenomeles speciosa）又名贴角海棠、贴梗木瓜、皱皮木瓜，蔷薇科木瓜属，落叶灌木，高达20m[1]。贴梗海棠早春叶前开花，鲜艳美丽，簇生枝间，且有重瓣及半重瓣品种，秋天又有黄色、芳香的硕果，是一种很好的观花、观果灌木。宜于庭院、草坪、花坛内孤植或丛植，又可以作为绿篱及基础种植材料，同时也具有极高的药用价值。以往对贴梗海棠的研究多数集中在组织培养、中药化学成分、植株繁殖栽培、品种分类等方面，对于花粉相关研究有郑林等[2]对花粉形态的描述，董美芳等[3]对花粉超低温保存1周后萌发率与不同的解冻方式的关系研究，但其试验中的应用条件是水培条件，并且花粉来自盛开的花朵，而花粉生活力受开花程度的影响显著。为此，本研究通过染色法、培养基萌发法，对不同贮藏条件下贴梗海棠花粉生活力的影响进行了测定，以期为贴梗海棠的生产、科研提供数据参考。

1　材料与方法

1.1材料

本试验采用的贴梗海棠，种植于河北农业大学西校区，试验当天上午10：00采收花蕾数朵，将其快速地带回实验室，并取出其花药，混合均匀后分别装入3个干燥的花粉瓶中，用塞子塞住瓶口，放入20益的光照培养箱中暂时储存以备使用，用时随机取出1份。

1.2方法

1.2.1形态观察法

直接在光学显微镜下观察花粉形状、对称性、极面观和赤道面观特点、萌发器官类型、外壁纹饰特点等。在观察的过程中，随机选择花粉20粒，测量赤道轴长、极轴长、条纹宽度、穿孔大小、穿孔密度、萌发沟长等。

1.2.2TTC染色法

取少量花粉于载玻片上，加1滴蒸馏水，再加入1滴0.4%TTC溶液（取0.04gTTC溶解在10mL磷酸盐溶液中，置入4益冰箱中），在25益的光照培养箱中培养15min后置于显微镜下观察。凡被染成红色的花粉均为有生活力的贴梗海棠花粉。

1.2.3碘原碘化钾染色法

根据淀粉遇碘变蓝的原理，从蓝色的深浅程度来判断贴梗海棠花粉粒中淀粉的含量，进而确定贴梗海棠花粉粒活性的高低。称取1.3g碘化钾溶解于10mL的蒸馏水中，再加入0.3g的碘，等到全部溶解后加蒸馏水定容到100mL容量瓶中，配制成碘-碘化钾溶液。用头发丝刮取少许贴梗海棠花粉散落到载玻片上，加入1滴蒸馏水使花粉全部散开，再滴入1滴碘-碘化钾溶液立刻置显微镜下观察。被染成蓝色的均为有生活力的花粉，呈黄褐色的则是不具有生活力的花粉[4]。

1.2.4不同葡萄糖浓度对花粉萌发的影响

在硼酸溶液浓度均为20mg/L的基础上，称取1g琼脂，加入少量的硼酸溶液，加蒸馏水至100mL，装入烧杯，加热搅拌使琼脂充分溶解呈透明状即溶液沸腾（注意补充水分，以保持培养基的浓度），加入葡萄糖，配制葡萄糖浓度分别为0（清水对照）、5%、10%、15%、20%、25%共6个不同浓度的培养基。取6个干净的载玻片，用滴管吸取少量的培养基，趁热分别滴在载玻片的凹槽内，放置片刻，使培养基凝固。用棉签蘸取少量的贴梗海棠花粉轻轻均匀地撒播在培养基表面，注意切不可过多，否则难以观察，将制备好的载玻片放在垫有湿润滤纸的培养皿内，于25益的光照培养箱中培养；待贴梗海棠花粉萌发后于显微镜下观察并统计发芽率。观察时每片随机取3个视野，统计贴梗海棠花粉总数及发芽数，计算平均萌发率（花粉观察总数不少于100粒）。萌发率=（萌发花粉粒数/花粉粒总数）伊100%。在培养基上进行贴梗海棠花粉的人工萌发，鉴定贴梗海棠花粉萌发率的高低[4]。

1.2.5不同温度对花粉生活力的影响

将贴梗海棠花粉接种于仅有琼脂的空白培养基上，分别在15、20、25益下培养4h后统计花粉萌发率，确定最佳培养温度。

1.2.6不同贮藏条件对贴梗海棠花粉生活力的影响

为了找到贴梗海棠花粉最佳的贮藏条件，采用了TTC染色法研究了不同的贮藏温度和贮藏时间对贴梗海棠花粉生活力的影响。将刚采集的贴梗海棠花粉装入干燥洁净的青霉素小瓶中，并加入硅胶粒干燥剂，采用常温干燥贮藏、常温贮藏、4益冷藏干燥贮藏、4益冷藏贮藏、-23益冷冻干燥贮藏、-23益冷冻贮藏6种方法，采用TTC染色法测定花粉生活力，起初每24h测定1次，1周后每5d测定1次，直到花粉完全失去生活力，方法及操作如1.2.2[4]。

2　结果与分析

2.1形态观察法

形态观察法是根据不同植物典型性，如花粉粒的大小、形态、色泽等来判断贴梗海棠花粉的生活力。结果显示：贴梗海棠花粉为长球形，赤道面观椭圆形，花粉大小（46.06～46.47）滋m伊（22.83～23.34）滋m，花粉为单粒、等极、辐射对称，极面观三裂圆形，外壁为皱波状纹饰，纹饰不清晰，穿孔少[5]。虽然这种方法简单易行，但不同的采集时间和保存时间对花粉的大小、色泽、形态、生活力等都会产生很大的影响。因此，此方法较适合于贴梗海棠新鲜花粉生活力的检测。

2.2TTC染色法与碘-碘化钾染色法测定贴梗海棠花粉生活力的研究

观察发现，贴梗海棠花粉均为长球型。用TTC染色法测定贴梗海棠花粉的生活力，花粉细胞出现红色（76.26%）、淡红色（19.15%）无色（4.59%）3种颜色反应，并且随着时间的延长，细胞的染色率逐渐下降（表1）。

而用碘-碘化钾染色后，染成深蓝色（即有生活力）的花粉有42.46%，黄褐色（即没有生活力）的花粉为57.54%，花粉生活力低于50%（表2）。结果表明：碘一碘化钾染色法不能准确地测定贴梗海棠海棠花粉生活力。这是因为多数植物正常的成熟花粉粒积累有较多的淀粉，碘原碘化钾溶液可将其染成蓝色，而贴梗海棠可能是由于积累较少淀粉的缘故，所以碘原碘化钾溶液不能准确地测定贴梗海棠花粉生活力。分析认为，具有活性的花粉细胞产生的NAD2H2可将无色的TTC还原成红色的TTF而使本身被染成红色，次活力的被染成淡红的，而无生活力的贴梗海棠花粉因为没有呼吸作用或呼吸作用很弱，变化不明显[6]。两种测定方法比较，TTC染色法更适合用于贴梗海棠花粉生活力的测定。

表1　温度对密度和全干干缩率的影响

表2　碘原碘化钾染色法中花粉细胞染色变化情况

2.3培养基中不同葡萄糖浓度对花粉生活力的影响

由图1可知，不同浓度的葡萄糖对贴梗海棠花粉的萌发率和萌发速度均有影响。在不添加葡萄糖的培养基中，贴梗海棠花粉仍然有萌发现象，但是萌发率很低，花粉萌发率仅为3.54%耀8.75%，培养基中加入葡萄糖时花粉萌发率显著提高，随着葡萄糖浓度的增加，花粉萌发率呈现先上升后下降的趋势，当葡萄糖浓度为10%时，花粉萌发率达到最高，接种培养2、4、6、8h后，花粉萌发率分别为10.30%、14.02%、12.37%、8.45%，见图1。当葡萄糖浓度超过10%时，花粉萌发率随着葡萄糖浓度的增大而下降，试验结果表明：贴梗海棠花粉萌发最适宜的葡萄糖浓度为10%。

图1　培养基中葡萄糖浓度对花粉生活力的影响

花粉在培养基上培养，随着观察时间的推移，花粉的萌发率呈现先升高后下降的趋势，过早观察，花粉还未开始生长；过晚观察，花粉的生活力下降。试验结果表明：观察花粉萌发的最佳时间是4h后。8h后观察，花粉的生活力明显下降到最低。说明随着时间的延长，花粉生活力逐渐下降。

2.4不同温度对花粉生活力的影响

试验结果显示：在15益时花粉的萌发率为8.62%，20益时升高至9.15%，25益时又下降至8.75%。可知在15耀25益培养条件下，随着温度的升高，花粉萌发率呈现先升高后降低的趋势，贴梗海棠花粉萌发的最佳培养温度为20益。

2.5不同贮藏条件对贴梗海棠花粉生活力的影响

花粉生活力的强弱受遗传因素和外界环境的因素影响，贮藏时间是影响花粉生活力的一个主要因素，但是由于贮藏温度不同，贴梗海棠花粉生活力下降速度也相对不同。从图2可以看出：贴梗海棠花粉生活力受到贮藏温度、贮藏时间的影响较大，干燥处理对花粉生活力的影响较小。常温保存的贴梗海棠花粉7d后萌发率迅速下降到0，说明花粉在温室条件下，生活力下降速度极快，可能是因温度过高，从而增加了花粉内部的呼吸强度，从而导致花粉内部营养枯竭。在低温条件下贮藏的花粉呼吸作用受到抑制，花粉生活力下降速度相对较慢。在4益干燥条件下，贴梗海棠花粉生活力逐渐下降，贮藏到第30天，花粉的萌发率降到0%。而在-23益冷冻干燥条件下，贴梗海棠花粉生活力下降缓慢，在贮藏30d时，花粉萌发率降到38.57%，贮藏到50d时，花粉萌发率为18.74%。与室温贮藏相比，4益和-23益冷冻处理花粉的萌发率下降速度较慢，能够明显延长贮藏时间，但以-23益处理较好。然而，对于杂交育种来说，远程杂交的花粉，保存时无需在冷冻条件下进行，一般采用冷藏处理即可保存花粉，并且对设备的需求低，尽可能在采集花粉3d内完成。

图2　不同贮藏条件下贴梗海棠花粉生活力随时间的变化趋势

3　结论与讨论

（1）利用染色法对花粉生活力测定具有快速简便的优点，但是受到花粉自身性质（例如花粉细胞壁的厚薄、花粉外壁的组成物质、花粉内各种酶活性的强弱等）的影响较大，因此不同的染色法只适合某些植物花粉生活力的测定。试验证明：碘原碘化钾溶液不能准确地测定贴梗海棠花粉的生活力，可能是由于贴梗海棠花粉体内积累较少淀粉的缘故。而TTC染色法可以很快测定花粉的活力，并且具有时间短、操作简便等的优点。

染色法对贴梗海棠花粉萌发的影响，一般情况下，染色法测定结果大都高于培养基萌发法测定结果。但染色法和培养基萌发法测定的结果不能相互比较，两者之间存在差异，差异一方面说明花粉在染色法测定条件下可能比在柱头上自然条件下萌发的能力高；另一方面说明发芽法测定结果可能比实际情况偏低。在最适宜的浓度条件下，不同植物花粉的萌发力不同。不同植物的花粉生活力保持时间的长短也不一样，一方面是受环境因素的影响，另一方面也由遗传因素所决定。虽然花粉萌发率不能完全等同于花粉生活力，但在实践中大多数是以花粉萌发率来表示花粉生活力的[7-8]。

（2）培养基中葡萄糖浓度影响贴梗海棠花粉的萌发率，葡萄糖对贴梗海棠花粉的萌发、生长发育有着重要的影响，葡萄糖可以维持花粉与培养基成分之间的渗透压平衡，为花粉的萌发和花粉管的伸长提供营养物质。葡萄糖浓度过高过低都不适合贴梗海棠花粉的萌发。浓度过低，则贴梗海棠花粉壁破裂而内含物散出；浓度过高，则贴梗海棠花粉细胞发生质壁分离，从而抑制花粉萌发伸长。试验结果表明，当葡萄糖浓度为10%时，贴梗海棠花粉萌发率最高。

（3）测定不同贮藏条件对贴梗海棠花粉生活力的影响。结果证明：低温贮藏优于常温贮藏处理；干燥贮藏法优于非干燥贮藏法；在6种花粉的贮藏方法中，以低温干燥贮藏法最好。证明了低温干燥贮藏法比较有利于保持贴梗海棠花粉的生活力，采用此方法贮藏的花粉在贮藏20d后仍然有生活力。

［1］陈有民.园林树木学［M］.北京：中国林业出版社，2011：516-517.

［2］郑琳，陈红，张雷，等.木瓜属植物的花粉形态及品种分类［J］.林业科学，2008，44（5）：53-57.

［3］董美芳，陈明海，贾婉，等.不同培养条件和贮藏方法对皱皮木瓜花粉萌发率的影响［J］.河南大学学报（自然科学版）2012，42（3）：291-294.

［4］赵兴华，张道旭，印东生，等.百合花粉生活力测定和贮藏方法研究［J］.北方园艺，2009（2）：172-175.

［5］郑琳，陈红，张雷，等.木瓜属植物的花粉形态及品种分类［J］.林业科学，2008，44（5）：53-57.

［6］刘会超，贾文庆，杜晓华，等.金银花花粉生活力测定及贮藏研究［J］.安徽农业科学，2010，38（11）：5854-5856.

［7］尤扬，贾文庆，等.西府海棠花粉生活力测定［J］安徽农业科学，2011，39（6）：3423-3425.

［8］于洋.百合远缘杂交不亲和性及其克服方法的研究［D］.哈尔滨：东北农业大学硕士论文，2008.

Studies on Measurement Methods of Pollen Viability

ZHU Jin-ru，SUN Xiao-guang1，ZHANG Xiao-man2
（1.Baoding City Transprotation Bureau，Baoding，Hebei 071000；
2.Agricultural University of Hebei Province，Baoding，Hebei 071000）

The birth of quince flowers as experimental material,studied the TTC，iodine,potassium iodide determination of two kinds of stain pollen viability,the effect of glucose on pollen germination in vitro culture and the influence of three dif原ferent temperature）15益。20益，25益）under the condition of the rule of variation of pollen germination,three kinds of storage conditions（temperature，4益，-23益）affect pollen storage.The results showed that:significant difference was found in determina原tion of different stain of pollen viability,TTC staining（76.26%）were significantly better than iodine-potassium iodide staining（42.46%）.Within a certain range,glucose and temperature can promote the germination of pollen，beyond the scope of in原hibiting germination,the experiment proved that the best glucose concentration was 10%,the best germination temperature is 20益.Storage temperature has significant influence on pollen viability,one of the best storage conditions is 4益.

Chaenomeles speciosa；Pollen Germination；Pollen viability；Storage

Q944.58

A

1002-3356（2016）03-0010-04

2016-05-22

河北省林业厅科学技术研究项目（1402450），河北省教育厅重点项目（ZD2016132）

朱金儒（1966-），男，工程师。E-mail：958890646@qq.com。

张晓曼（1977-），女，副教授。E-mail：173610925@qq.com。