刺葡萄DFR基因克隆及生物信息学分析

赖呈纯，黄贤贵，甘煌灿，潘　红，范丽华

(福建省农业科学院农业工程技术研究所，福建　福州　350003)



刺葡萄DFR基因克隆及生物信息学分析

赖呈纯，黄贤贵，甘煌灿，潘红，范丽华*

(福建省农业科学院农业工程技术研究所，福建福州350003)

根据葡萄DFR基因CDS序列设计刺葡萄开放阅读框(ORF)特异引物，利用RT-PCR技术克隆获得其DFR基因序列，并通过生物信息学方法分析其生物学特性。结果表明，刺葡萄DFR基因ORF序列全长1 014 bp，编码337个氨基酸，命名为Vitisdavidiidihydroflavonol 4-reductase gene(VdDFR)，GenBank登录号为KF915803。刺葡萄DFR蛋白预测分子量为37 593.2 Da，理论等电点pI为5.81，是一个跨膜亲水蛋白，无典型信号肽，不属于分泌蛋白，并且亚细胞定位主要位于细胞质中(70%)；二级结构以无规则卷曲为主(52.82%)，是一种mixed类蛋白；该蛋白有潜在的7个糖基化位点和16个磷酸化位点，具有NAD(P)结合位点，有NAD依赖型的表异构酶/脱氢酶的N端结构域，属于NADB_Rossmann超家族成员。核苷酸序列分析表明，刺葡萄DFR基因与美丽葡萄、山葡萄和酿酒葡萄的同源性为99%，与圆叶葡萄同源性为98%，与显齿蛇葡萄同源性为94%，进化上比较保守，利用DFR基因编码区碱基序列所建立的系统关系树与真实的植物进化基本一致。

刺葡萄；二氢黄酮醇4-还原酶；DFR基因；克隆；生物信息学

刺葡萄VitisdavidiiFoёx.属葡萄科葡萄属东亚种群的一个种[1]，是我国主要的野生葡萄品种之一[2]。刺葡萄色艳汁多，具有独特的风味，是酿酒和加工的优良品种。刺葡萄果皮色泽及其内含物对其葡萄酒和加工产品的品质有重要决定作用，在其栽培过程中，温度和光照对葡萄果皮色泽的形成有重要的影响[3-4]。然而，近年来，南方在刺葡萄果实生长季中常出现阴雨天气而影响其果皮转色的程度，并最终影响其加工特性，因此，在生产上亟待开展刺葡萄果皮色泽调控方面的研究。有研究表明，植物的颜色主要是由其体内类黄酮色素代谢决定的[5-6]，而在葡萄果皮中，色泽的形成是类黄酮色素中最丰富的一类花色苷合成代谢的结果[7]，因此，刺葡萄果皮色泽的形成与其花色苷合成代谢息息相关。目前，研究人员已对葡萄的花色苷合成代谢进行了较深入的研究[7]，其合成过程涉及多个反应步骤，是一系列结构基因和调控因子共同作用的结果[8-10]。在花色苷合成的诸多结构基因中，二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)催化二氢黄酮醇在C4 位发生立体特异的还原反应，使二氢黄酮醇类生成无色原花色素，是花色苷合成过程中最关键的酶之一[11]，DFR具有底物特异性[12]，在葡萄中DFR基因是一个单拷贝基因[8]，且能感受光的调控[3]，因此，对刺葡萄DFR基因的研究，有助于人们了解其调控花色苷合成的机制。目前，鲜见开展刺葡萄花色苷合成代谢调控方面的研究，也未见从刺葡萄中克隆DFR基因的报道。为了更好地了解DFR基因在刺葡萄花色苷合成中的作用，本研究克隆了刺葡萄DFR基因，并对其生物信息学进行分析，为进一步研究DFR基因在刺葡萄中的表达调控提供支持。

1　材料与方法

1.1试验材料

以本实验室诱导并长期保持的紫红色刺葡萄DLR细胞系为试验材料[13]。将DLR细胞系继代培养25 d，收集培养物并液氮速冻后，-80℃保存备用。

1.2试验方法

1.2.1细胞培养物总RNA提取与cDNA第一链合成 取刺葡萄DLR细胞培养物0.2 g于液氮预冷的研钵中，加入液氮并充分研磨后，按照Omega公司植物RNA提取试剂盒(E.Z.N.A. Plant RNA Kit)操作，进行总RNA的提取。提取的总RNA用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测完整性，并用Thermo Scientific公司的NanoDrop 2000c超微量紫外可见分光光度计检测RNA纯度和测定浓度。将RNA按照invitrogen公司逆转录试剂盒(Super Script Ⅲ First-Strand Synthesis System for RT-PCR)说明书操作步骤反转录为cDNA，-80℃保存备用。

1.2.2引物的设计与合成根据GenBank中提供的葡萄DFR基因cDNA序列设计刺葡萄DFR基因开放阅读框(open reading frame，ORF)引物，上游引物DFR_U：ATG GGT TCA CAA AGT GAA ACC GTG TG，下游引物DFR_D：CTA GGT CTT GCC ATC TAC AGG TTT C。扩增引物由铂尚生物技术(上海)有限公司合成。

1.2.3PCR扩增与目的片段回收以第一链cDNA为模板扩增目的基因片段。PCR反应的总体积为25 μL。PCR扩增程序：94℃ 5 min；94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环；72℃延伸10 min；10℃ 保存。扩增反应结束后，取5 μL反应产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。按照Omega公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒(E.Z.N.A. Gel Extraction Kit)操作，回收PCR产物目的片段。

1.2.4目的片段TA克隆与测序按试剂盒操作，取回收的目的片段与pACK4a-Bs克隆载体(盘古基因科技(苏州)有限公司)连接，连接产物热激转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化后加LB培养液摇匀复苏1 h，将菌液涂布于含100 μg·mL-1Amp、0.5% IPTG、40 μg·mL-1X-gal的LB平板培养皿表面，37℃避光培养过夜进行蓝白斑筛选；挑取白色阳性单克隆菌落，转入含用100 μg·mL-1Amp的3 mL LB液体培养基中，于37℃下、190 r·min-1振荡培养，之后进行菌液PCR鉴定，反应体系和条件同上；PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，选取鉴定正确含有目的片段的大肠杆菌菌株，送铂尚生物技术(上海)有限公司测序。

1.2.6刺葡萄DFR基因生物信息学分析使用DNAMAN8.0推测出DFR基因的氨基酸序列，利用在线软件ProtParam、PredictProtein、NetPhos2.0、TMPRED等分析工具，对DFR基因推导的蛋白质序列的理化性质、结构、功能等进行预测，具体的在线分析工具见表1。同时使用NCBI 网站的BLAST搜索同源性序列，并利用MEGA6.0软件[14]构建系统发育树。

表1　所用的在线分析工具

2　结果与分析

2.1刺葡萄DFR基因序列的克隆与序列分析

以培养25 d的刺葡萄细胞培养物总RNA逆转录成第一链的cDNA为模板，DFR_U和DFR_D分别为上下游引物，PCR扩增后得到约1 000 bp左右的条带(箭头所指条带，图1)，其他3个条带鉴定为引物二聚体或杂带。回收的PCR产物经TA克隆测序后，获得了目的片段的全长序列，为1 014 bp，利用DNAMAN 8.0软件预测氨基酸序列，其编码337个氨基酸。

利用NCBI的Blastn工具，将获得的全长核苷酸序列与GenBank中登入的序列进行同源性比较，发现其核苷酸序列与美丽葡萄(JQ308621)、山葡萄(FJ645768)和酿酒葡萄(NM001281215)的DFR基因核苷酸序列同源性为99%，与圆叶葡萄(KC460268)同源性为98%，与显齿蛇葡萄(KC753780)同源性为94%，与枫香(JX944785)和芍药(JQ070804)的同源性分别为83%和80%。序列的同源比较结果说明，刺葡萄DFR基因的ORF全长序列已经成功克隆，这也是刺葡萄首次报道的DFR基因，命名为Vitisdavidiidihydroflavonol4-reductasegene(VdDFR)，GenBank登录号为KF915803。

2.2刺葡萄DFR基因编码蛋白的结构与功能分析

2.2.1蛋白理化性质分析 利用ExPASy服务系统中的ProtParam工具对刺葡萄DFR蛋白序列的基本理化性质进行综合预测分析。结果表明，刺葡萄DFR蛋白分子量为37 593.2 Da，理论等电点pI为5.81；由20种氨基酸组成，不含吡咯赖氨酸(Pyl)和硒半胱氨酸(Sec)，其中以亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、丝氨酸(Ser)等氨基酸含量较为丰富，占比分别为8.6%、7.7%、7.4%，最少的为色氨酸(Trp)，仅占1.5%；总原子数为5270，组成是C1682H2634N434O499S21，带负电荷氨基酸为43(Asp + Glu)，带正电荷氨基酸为37(Arg + Lys)；280 nm下的消光系数为43025；理论推导的半衰期为，30 h(哺乳动物网织红细胞中，离体)，20 h(酵母细胞中，体内)，10 h(大肠杆菌中，体内)；不稳定指数为37.28，是一个稳定的蛋白；脂肪系数82.76，总平均疏水性指数为-0.145，说明是一个亲水蛋白。

2.2.2蛋白二级和三级结构的预测分析利用GOR4对DFR蛋白的二级结构进行预测(图2)，结果表明，DFR蛋白的氨基酸残基中，含29.97%的α-螺旋(Alpha helix，h)，含17.21%的延伸链(extended strand，e)，无规则卷曲(random coil，c)是其最大的结构元件，占52.82%，散布在整个蛋白中。经过PredictProtein在线软件分析并结合蛋白分类规则，DFR蛋白既不是α类蛋白(%h > 45% 和%E < 5%)，也不是β类蛋白(%H < 5% AND%E > 45%)，也不是α-β类蛋白(%H > 30% AND%E > 20%)，而是一种mixed类蛋白[15]。从Phyre2对DFR蛋白三级结构预测的模型，可以更直观地看出该蛋白的空间结构(图3)。

2.2.3信号肽预测与亚细胞定位利用在线软件PSORT II(Version 6.4)来预测DFR蛋白的亚细胞定位，分析的结果表明，该蛋白主要在细胞质中(70%)起作用，而在内质网、过氧化物酶体和线粒体内分布比例分别为20%、16%和10%。TargetP 1.1 Server程序分析的结果表明，DFR蛋白不存在典型的信号肽，在细胞中没有重新定位，因此定位于细胞质中，这印证了PSORT II的预测。

2.2.4跨膜结构与保守结构域分析在线工具TMpred分析表明，DFR蛋白存在2个从内而外的跨膜区域，一个是从氨基酸残基第8～26位，另一个是从186～207位，同时存在2个由外而内的跨膜区域，一个是从氨基酸残基第7～23位，另一个是从185～201位，软件分析认为该蛋白的跨膜是从末端开始由外而内再由内而外依次排列的次跨膜。

利用在线InterProScan程序检索EBI的InterPro数据库，发现该蛋白有1个NAD(P)结合位点，有NAD依赖型的表异构酶/脱氢酶的N端结构域(NAD-dependent epimerase/dehydratase, N-terminal domain)。进一步通过NCBI的Blast工具检索CDD(Conserved Domain Database)数据库，结果如图4所示，表明DFR蛋白属于NADB_Rossmann超家族成员，拥有NADB_Rossmann保守结构域，含有特异的AR_like_SDR_e组件，有NADP结合位点和底物结合位点，这是还原酶的典型特征。

2.2.5蛋白糖基化位点与磷酸化位点分析NetOGlyc 4.0分析表明，DFR蛋白存在7个糖基化位点，分别位于多肽链上的第3、126、127、128、131、201、328位上。磷酸化作用在细胞信号传导中有极其重要的地位，对DFR蛋白磷酸化位点进行分析，可以进一步了解其在花青素合成过程中的功能。在线磷酸化位点分析工具NetPhos 2.0的结果如图5所示，DFR蛋白多肽链上存在16个氨基酸磷酸化位点(分值>0.5)，散布在整个多肽链上。其中丝氨酸(Ser)可能发生磷酸化的有4个，分别在肽链上第293、294、307和328位，主要集中在C端区域；苏氨酸(Thr)可能发生磷酸化的有8个，分别在肽链上第7、31、35、40、59、86、119和318位，主要集中在N端区域；酪氨酸(Tyr)可能的磷酸化位点有4个，分别在第220、251、274和306位，主要分布在C端区域。这种苏氨酸与丝氨酸、酪氨酸磷酸化位点分布区域的差异，可能与DFR蛋白功能相适应。

2.3刺葡萄DFR基因的系统进化分析

利用NCBI的Blast工具对刺葡萄DFR基因核酸序列进行比对分析，选取比对结果的不同物种的DFR基因核酸序列共32条，包括刺葡萄、美丽葡萄、酿酒葡萄(2个)、山葡萄、圆叶葡萄、显齿蛇葡萄、枫香、芍药、马蹄纹天竺葵、毛果杨、枣、芒果、西洋梨、可可、甜橙、甜樱桃、李、苹果、陆地棉、碧桃、草莓、蔷薇、兔眼蓝莓、猕猴桃、石榴、矮牵牛、拟南芥、玉米、金鱼草、番茄和苜蓿等。用MEGA6.0软件中的Neighbor-Joining(邻位相连法，NJ)法，将Bootstrap检验值设置为500，建立了它们编码区碱基序列之间的系统关系树(图6)。在这些物种中，只有玉米是单子叶植物，从进化关系图可以看出，其处在进化树的最底端，与其他双子叶植物可以很好地区分。在双子叶植物中，石榴处在最上层，其次是拟南芥；其他物种在进化树中大致可以分成4个区组，按从下到上顺序，第一组包含枣、草莓、蔷薇、西洋梨、苹果、甜樱桃、李和碧桃等，该组除了枣为鼠李科植物外，其他均为蔷薇科植物；第二组包括苜蓿、兔眼蓝莓、猕猴桃、金鱼草、矮牵牛和番茄等，该组的组成比较复杂；第三组包含芒果、甜橙、陆地棉、毛果杨和可可；第四组有马蹄纹天竺葵、芍药、枫香、显齿蛇葡萄、圆叶葡萄、酿酒葡萄(2个)、刺葡萄、山葡萄和美丽葡萄等为一组。刺葡萄处在第四组中，该组中的显齿蛇葡萄与其他葡萄可以明显地区分，圆叶葡萄又与剩下的几个葡萄有较大的区别，酿酒葡萄与美丽葡萄、刺葡萄、山葡萄是平行的进化关系，而3个东亚种群的美丽葡萄、刺葡萄和山葡萄也是平行的进化。综上所述，利用DFR基因编码区碱基序列所建立的系统进化树与真实的植物进化基本一致。

3　讨　论

目前，国内外有关刺葡萄DFR基因的研究尚属空白。本研究采用同源克隆结合RT-PCR技术，首次克隆了刺葡萄DFR基因开放阅读框(ORF)序列，片段长度为1 014 bp，编码337个氨基酸，命名为Vitisdavidiidihydroflavonol 4-reductase gene(VdDFR)，GenBank登录号为KF915803。刺葡萄DFR基因与美丽葡萄、山葡萄和酿酒葡萄的核苷酸序列同源性为99%，与圆叶葡萄同源性为98%，与显齿蛇葡萄同源性为94%，进化上比较保守，可能与其功能相适应有关。生物信息学分析显示，刺葡萄DFR基因编码的蛋白具有NAD(P)结合位点，有NAD依赖型的表异构酶/脱氢酶的N端结构域，属于NADB_Rossmann超家族成员。同时，利用DFR基因编码区碱基序列所建立的系统关系树与真实的植物进化基本一致，可用于植物分类研究。

葡萄果皮色泽不但是商品性和价值的体现之一，而且与其加工产品和酿酒的品质关系密切[7]。果皮色泽的形成是其花色苷合成代谢的结果，受多个花色苷合成相关的结构基因编码的酶催化，这些结构基因还受到调控因子的调控[16,17]。在花色苷合成过程中，其中二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)是催化二氢黄酮醇在C4 位发生立体特异的还原反应，使二氢黄酮醇类生成无色原花色素，是花色苷合成过程中最关键的酶之一[18-19]，是植物花色苷生物合成过程中的限速酶[20]。二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)所催化的反应，是从类黄酮生物合成的共同通路转向花青素生物合成的步骤[18]。研究表明，DFR具有底物特异性，上游通路生物合成的中间产物二氢山柰酚(dihydrokaempferol，DHK)、二氢杨梅素(dihydromyricetin，DHM)、二氢槲皮素(dihydroquercetin，DHQ)[21]，由不同的DFR催化反应，最终产生相应的天竺葵素葡萄糖苷(pelargonidin-3-glucoside)、飞燕草素葡萄糖苷(delphinidin-3-glucoside)、矢车菊素葡萄糖苷(cyanidin-3-glucoside)[18]，通过对大花蕙兰花色变化的研究发现，DFR不能催化DHK产生橘黄色色素，是由于其底物结合位点氨基酸突变引起的[22]，进一步的研究发现，矮牵牛的DFR不能催化DHK，而非洲菊能催化DHK，是其DFR氨基酸序列中与底物结合的位点上单个氨基酸突变的结果，通过嵌合重组蛋白技术，可使矮牵牛的DFR具有催化DHK产生橘黄色色素的能力[18]。在多数植物中，DFR基因是单拷贝的基因，而在银杏树中，DFR基因却有3个不同类型的基因GbDFR1、GbDFR2和GbDFR3，它们的表达有时空的特异性[11]。这说明DFR的催化功能不但有时空的差异，而且具有物种的特异性。

葡萄中的DFR基因为单拷贝基因[8]，不同有色的葡萄品种中，其果皮颜色的变化，是否是DFR底物结合区氨基酸突变的结果，还是其他调控机制产生的，这有待进一步的研究。与其他植物相比，甚至与不同品种的葡萄相比，刺葡萄的DFR基因在其序列及其所编码的氨基酸序列，以及其所行使的功能有何异同，也亟待进一步的研究。在刺葡萄的生产上，果品的品质是最终关注的目标，外观色泽是品质的最直接体现之一，据研究DFR基因具有感受光调控的特性[3]，怎样通过适当的栽培手段调控其果皮色泽，也是诸多生产者关注的问题。而这些问题的解决，都有赖于对DFR基因表达调控的深入了解，本研究通过对刺葡萄DFR基因的克隆和生物信息学分析，为研究其在刺葡萄果实颜色形成过程中的功能和调控机制奠定了基础。在前期的研究中，以刺葡萄幼胚为材料，诱导获得了两个同质不同型的愈伤组织诱导细胞系，一个为紫红色细胞系，另一个为淡黄色细胞系[13]，这两个细胞系花色苷合成的差异，是否与DFR基因的表达有关或与其起“开关”作用的启动子有关，这也有待进一步的研究。

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(责任编辑：黄爱萍)

Cloning and Bioinformatics ofDFRGene inVitisdavidiiFoёx

LAI Cheng-chun, HUANG Xian-gui, GAN Huang-can, PAN Hong, FAN Li-Hua*

(InstituteofAgriculturalEngineeringandTechnology,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350003,China)

The specific primers of open reading frame (ORF) of dihydroflavonol(DFR) gene in brier grapes (VitisdavidiiFoёx.) were designed according to the CDS template of the gene.DFRgene sequence was cloned using RT-PCR, andsubsequently, the genetic characteristics analyzed by bioinformatics. The 1 014 bp full-length cDNA ofDRF'sORF was thus obtained. It encoded 337 amino acids, and was namedV.davidiiDFR 4-reductase gene (VdDFR) with GenBank accession number of KF915803. The predicted molecular weight of VdDFR protein was 37 593.2 Da，theoretical pI is 5.81. As a transmembrane and a hydrophilic protein, it did not belong to secretory category,had no signal peptide, and was located largely in the cytoplasm (70%). The secondary structure ofthe mixed protein was mostly random coil (52.82%). The amino acids sequence of the gene possibly contained 7 glycosylation sites, 16 phosphorylation sites, one NAD(P) binding site, and one NAD-dependent epimerase/dehydratase(N-terminal) domain, and the gene likely belonged to the NADB_Rossmann superfamily. The nucleotide sequences ofDFRfromV.davidii，V.bellula，V.amurensis, andV.viniferawere 99% homogenous; those ofV.davidiiandV.rotundifolia, 98% homogenous; and, those ofV.davidiiandAmpelopsisgrossedentata, 94% homogenous. These results indicated that theDFRgene coding region was evolutionally conservative. And, the phylogenetic tree constructed based on the sequence salso reflected the same evolutionary trait of these plants.

brier grape (VitisdavidiiFoёx.); dihydroflavonol 4-reductase; DFR gene; cloning; bioinformatics

2016-05-17初稿；2016-06-10修改稿

赖呈纯(1975- )，男，博士，副研究员，主要从事园艺植物生物技术与植物细胞代谢工程研究(E-mail：lccisland@163.com)

范丽华(1957- )，女，副研究员，主要从事园艺植物栽培的研究(E-mail：512264119@qq.com)

福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项(2014R1015-6)；福建省自然科学基金项目(2016J01126)

S 663.1；Q 785

A

1008-0384(2016)07-683-07

赖呈纯，黄贤贵，甘煌灿，等.刺葡萄DFR基因克隆及生物信息学分析[J].福建农业学报，2016，31(7)：683-689.

LAI C-C，HUANG X-G，GAN H-C，et al.Cloning and Bioinformatics ofDFRGene inVitisdavidiiFoёx[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(7)：683-689.