丹参总酚酸对刀豆蛋白A所致小鼠急性肝损伤的保护作用及机制

何佳丽,刘焱,温韬

(1首都医科大学附属北京佑安医院，北京 100069；2首都医科大学附属北京朝阳医院医学研究中心)



丹参总酚酸对刀豆蛋白A所致小鼠急性肝损伤的保护作用及机制

何佳丽1,刘焱1,温韬2

(1首都医科大学附属北京佑安医院，北京 100069；2首都医科大学附属北京朝阳医院医学研究中心)

目的研究丹参总酚酸对刀豆蛋白A(ConA)所致急性肝损伤小鼠的保护作用及机制。方法 将野生型C57BL/6 (B6)雄性小鼠随机分为正常对照组、丹参总酚酸组、ConA组和丹参总酚酸+ConA组。ConA组小鼠通过尾静脉注射ConA(40 mg/kg)诱导肝损伤；丹参总酚酸+ConA组小鼠先经腹腔注射丹参总酚酸溶液(50 mg/kg)，30 min后再给予相同剂量的ConA；正常对照组仅尾静脉注射生理盐水，丹参总酚酸组仅腹腔注射丹参总酚酸溶液，剂量同上。干预16 h后，采用全自动生化分析仪测肝功能，应用HE染色观察肝脏病理学变化，应用ELISA和Luminex方法检测细胞外组蛋白及相关炎症分子(IL-1、IL-6、IL-18、TNF-α)的水平。结果小鼠尾静脉注射ConA后发生了明显的肝损伤，表现为血浆ALT、AST水平显著升高，大量肝细胞凋亡坏死和炎症细胞浸润；给予丹参总酚酸干预能显著减轻小鼠肝损伤，降低ALT、AST水平。与正常对照组或丹参总酚酸组相比，ConA组的细胞外组蛋白、IL-1、IL-6、IL-18和TNF-α水平均升高(P均<0.01)；与ConA组比较，丹参总酚酸+ConA组小鼠各指标均降低(P均<0.01)，但仍高于正常对照组或丹参总酚酸组(P均<0.01)。结论 丹参总酚酸对ConA所致的小鼠急性肝损伤有显著保护作用，其机制可能与降低细胞外组蛋白和相关的细胞因子水平有关。

肝损伤；丹参总酚酸；刀豆蛋白A；炎症因子

丹参为唇型科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge的干燥根及根茎，具有祛瘀止痛、安神滋补和通经活血功效，在临床上应用广泛，可用于治疗心脑血管疾病、消化系统疾病和各种肿瘤等[1,2]。丹参总酚酸是丹参的水提物成分，具有多个酚羟基结构，是丹参发挥作用的主要活性成分。近年研究发现,丹参总酚酸具有抑制血小板聚集、抗凝、抗脂质过氧化、抗炎作用，其药理作用明显优于丹参[3～5]。2015年3～8月，本研究拟通过制备刀豆蛋白A(ConA)诱导的小鼠急性肝损伤模型，探讨丹参总酚酸是否对炎症性肝损伤具备保护作用及相关机制。

1　材料与方法

1.1材料动物：10周龄C57BL/6(B6)雄性小鼠，体质量20～28 g，购自首都医科大学实验医学动物部并由其负责饲养，自由饮水，室温18～22 ℃，湿度为50.0%±2.0%，每隔12 h开灯照明，饲养1周后使用，实验前12 h和实验期间禁食。主要试剂及仪器：丹参总酚酸由北京大学药学院姜涛教授惠赠，纯度>98%。ConA购自美国Sigma公司；细胞外组蛋白ELISA试剂盒购自武汉华美生物有限公司(USCN Life Science)；Luminex检测系列细胞因子试剂盒为美国Affymetrixe Bioscience公司产品。

1.2动物分组和模型制备首先将实验动物随机分成正常对照组(n=6)、丹参总酚酸组(n=6)、ConA组(n=14)和丹参总酚酸+ConA组(n=10)。参考文献[6]及预实验结果进行造模：染毒组小鼠经尾静脉注射ConA(40 mg/kg)建立急性肝损伤模型，丹参总酚酸+ConA组小鼠先按50 mg/kg剂量腹腔注射丹参总酚酸溶液，30 min后再对小鼠尾静脉注射相同剂量的ConA；对照组小鼠尾静脉只注射生理盐水，丹参总酚酸组小鼠腹腔只注射丹参总酚酸，干预剂量同上。

1.3小鼠一般情况及肝组织病理学观察各组小鼠一般情况，包括活动、毛色、精神变化以及死亡等情况。各组于干预后16 h处死，取小鼠肝组织于10%甲醛溶液固定24 h以上，用石蜡包埋，制备5 μm切片，行HE染色，光学显微镜下观察组织损伤情况。

1.4小鼠肝功能测定干预16 h后取小鼠眼眶内眦静脉血，加EDTA抗凝后于3 000 g 离心10 min后分离血浆，于-80 ℃冻存待测。采用全自动生化分析仪(日立7180)测定不同时间点小鼠血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平。

1.5血浆细胞外组蛋白水平测定采血方法同上。采用ELISA法测定小鼠血浆中细胞外组蛋白水平，具体操作方法参见说明书。

1.6血浆细胞因子水平测定采用高效液相芯片系统(Luminex)测定小鼠血浆中细胞因子(IL-1、IL-6、IL-18和TNF-α)水平，具体操作方法参见使用说明书。

2　结果

2.1各组大体表现及肝脏组织病理学表现正常对照组和丹参总酚酸组小鼠精神状态良好，活动正常，反应灵敏，毛色有光泽，实验期间未发生死亡；ConA组小鼠出现饮食、活动量减少、精神萎靡等，染毒后16 h内有6只小鼠先后死亡；丹参总酚酸+ConA组小鼠在染毒16 h内先后死亡2只。正常对照组小鼠肝体积正常，呈鲜红色，表面光滑、边缘整齐；组织切片显示肝细胞、汇管区、胆管上皮细胞等形态结构完整，未见变性、坏死和炎症细胞浸润等；ConA组小鼠16 h时病理学显示有大量肝细胞变性肿胀，肝小叶内有不同程度的细胞凋亡及坏死，汇管区可见大量炎性细胞浸润等；丹参总酚酸+ConA组小鼠的肝损伤得到了明显改善，表现为变性坏死的肝细胞和浸润的炎症细胞均减少，仅见到少数肝细胞出现混浊肿胀，且多为散在分布；汇管区可见少量炎性细胞浸润，但均明显少于ConA染毒组。

2.2各组ALT、AST比较见表1。

表1　各组ALT、AST比较

注：与正常对照组或丹参总酚酸组相比，*P<0.01；与ConA组相比，#P<0.01。

2.3各组细胞外组蛋白和细胞因子水平比较见表2。与正常对照组或丹参总酚酸组相比，ConA组的细胞外组蛋白、IL-1、IL-6、IL-18和TNF-α水平均升高(P均<0.01)；与ConA组比较，丹参总酚酸+ConA组小鼠各指标均降低(P均<0.01)，但仍高于正常对照组或丹参总酚酸组(P均<0.01)。

表2　各组细胞外组蛋白和细胞因子水平比较±s)

注：与正常对照组或丹参总酚酸组相比，*P<0.01 ；与ConA组相比，#P<0.01。

3　讨论

大量研究表明，炎症反应是启动和加重急性肝损伤的一个关键环节，通过早期给予有效手段干预炎症因子生成，可能有助于减轻肝损伤和阻止病程进展[6,7]。既往研究发现，丹参总酚酸具有抑制血小板聚集、抗凝、抗脂质过氧化、清除自由基作用[3,4]；特别是丹参总酚酸能抑制NADPH氧化酶，减慢受刺激细胞的“呼吸爆发”，减少氧自由基产生，对氧化应激介导的细胞损伤有明显保护作用，因此广泛应用于抗氧化性损伤。

丹参总酚酸对神经细胞、内皮细胞的缺氧性损伤有明显保护作用，对化学性急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的防治也具显著效果，其作用机制与显著降低自由基生成有关。研究亦发现，丹参总酚酸有明显的抗炎作用，但目前尚不清楚此种抗炎效应的具体机制。为了深入探讨和开发丹参总酚酸的生物学特性，本次研究中，我们制备了ConA诱导的急性肝损伤小鼠模型，探讨丹参总酚酸是否能减轻肝脏炎性损伤及相关的作用机制。与四氯化碳和对乙酰氨基酚诱导的以氧化性损伤为主的肝损伤模型不同，ConA的作用机制是通过特异性结合肝细胞膜，招募并激活大量T淋巴细胞，促进释放多种细胞因子，造成炎症性肝损伤。ConA诱导的急性肝损伤模型和人类病毒性肝炎、自身免疫性肝炎等的病理特点非常相似，常用于探讨临床药物的疗效和机制分析。

本研究结果显示，给予小鼠尾静脉注射ConA能诱导典型的肝损伤，表现为肝功能指标(ALT、AST)异常升高，并伴有明显的组织病理学改变；而给予丹参总酚酸干预后，染毒小鼠的肝损伤症状得到显著改善，表现为血浆ALT、AST水平降低、肝细胞损伤程度及范围均明显减轻。这一结果表明，丹参总酚酸有很明显的抗炎作用，对ConA诱导的小鼠炎症性肝损伤亦有明确的保护作用，但其机制与丹参总酚酸的抗氧化能力无关。

细胞外组蛋白是新发现的一种炎症介质，已证实在启动和加重肝脏炎症损伤性反应中起关键作用[7,8]。有研究发现，细胞外组蛋白在严重感染(如脓毒血症)时显著升高；大量的细胞外组蛋白可直接损伤内皮细胞，激活炎症信号通路，进而促进炎性因子释放，加重组织细胞损伤甚至导致死亡；给予特异性抗组蛋白抗体中和循环中的游离组蛋白，能有效降低致死率，减轻炎症反应。Huang等发现细胞外组蛋白在体内主要经Toll样受体信号通路激活天然免疫细胞，诱导免疫应答反应。更多新的研究表明，细胞外组蛋白不仅有直接的细胞毒性作用，还可作为损伤模式相关分子促进下游细胞因子如IL-1、IL-6、IL-18和TNF-α等释放，从而介导炎症反应。这些研究提示，细胞外组蛋白不仅可作为反映疾病严重程度的特异性标志物，还可望成为分子标靶用于临床干预治疗。本研究结果显示，ConA染毒后小鼠细胞外组蛋白水平显著升高，并伴有相关的细胞因子如IL-1、IL-6、IL-18和TNF-α明显升高，给予丹参总酚酸干预有效降低了细胞外组蛋白和细胞因子水平。由此可见，丹参总酚酸对肝损伤的保护作用可能是通过抑制细胞外组蛋白及相关细胞因子水平而实现的。

[1] 张志云,王芳.丹参为主的中药复方治疗脂肪肝研究进展[J].中西医结合肝病杂志,2009,19(2):126-128.

[2] 齐艳艳,史永照.丹参对缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究进展[J]．上海中医药大学学报,2010,24(2):89-91.

[3] 陈雯,郭丽丽,周婷婷,等.丹参总酚酸对离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(9):173-176.

[4] 贺文彬,楚世峰,陈乃宏.丹参总酚酸对大鼠缺血性脑卒中后免疫抑制现象的改善作用[J].中国药理学与毒理学杂志,2015,29(3):391-397.

[5] Wu ZM, Wen T, Tan YF, et al. Effects of Salvianolic acid A on oxidative stress and liver injury induced by carbon tetrachloride in rats[J]. Basic Clin Pharmacol Toxicol, 2007,100(2):115-120.

[6] 曲建慧,韩絮琳,万谟彬.肝素对刀豆蛋白A诱导昆明小鼠急性肝损伤的保护作用[J].解放军医学杂志,2001,26(6):451-453.

[7] Xu J, Zhang X, Monestier M, et al. Extracellular histones are mediators of death through TLR2 and TLR4 in mouse fatal liver injury[J]. J Immunol, 2011,187(5):2626-2631.

[8] Wen Z, Liu Y, Li F, et al. Circulating histones exacerbate inflammation in mice with acute liver failure[J]. J Cell Biochem, 2013,114(10):2384-2391.

Protective effect of salvianolic acids on acute liver injury caused by concanavalin A in mice

HEJiali1,LIUYan,WENTao

(1BeijingYou-AnHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of salvianolic acids on acute liver injury caused by concanavalin A (ConA) in mice and its mechanism. Methods Male C57BL/6 (B6) mice were randomly divided into four groups: the normal control group, which received saline only; salvianolic acids-treated group, which received salvianolic acids only; ConA-treated group, which was administered with ConA (40 mg/kg) via tail vein injection; and the salvianolic acids+ConA-treated group, which received salvianolic acids at a dose of 50 mg/kg 30 min prior to ConA injection. After 16-hour intervention, the liver function was analyzed by fully automatic biochemical analyser, pathologic changes were observed by HE staining, and the relevant inflammatory mediators (extracellular histones, IL-1 , IL-6, IL-18 and TNF-α) were evaluated by ELISA and Luminex. ResultsThe administration of ConA to mice caused severe liver injury, as evidenced by significantly increased ALT and AST levels, necrosis and apoptosis of liver cells and inflammatory cell infiltration. Compared with the ConA-treated mice, salvianolic acids plus ConA-treated mice showed a significantly decreasing trend of ALT, AST, as well as the reduced liver injury. Besides, the concentrations of extracellular histones, IL-1 , IL-6, IL-18 and TNF-α were significantly decreased in the ConA-treated group as compared with those of the normal control group and salvianolic acids-treated group (allP<0.05). Compared with the ConA-treated group, all indexes of the salvianolic acids+ConA-treated group were decreased (allP<0.01), but were higher than those of the normal control group and salvianolic acids-treated group (allP<0.01).ConclusionSalvianolic acids have significant protective effect on ConA-induced liver injury in mice, likely due to its ability of decreasing the levels of extracellular histones and various cytokines.

liver injury; salvianolic acids; concanavalin A; inflammatory factors

国家自然科学基金资助项目(81372094)；北京市卫生系统高技术人才培养项目-学科骨干(2013-3-077)。

何佳丽(1979-)，女，硕士，主治医师，研究方向为肝病的治疗和干预。E-mail: springmaze@sina.com

简介：温韬(1975-)，男，副主任医师，主要研究方向为炎症性疾病的机制和干预。E-mail: wentao5281@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.29.002

R657.3

A

1002-266X(2016)29-0004-03

2016-01-15)