携带blaNDM-1基因革兰阴性杆菌的分子流行病学研究

李 军， 邹明祥， 王海晨， 胡咏梅， 豆清娅， 晏 群， 刘文恩

·论著·

携带blaNDM-1基因革兰阴性杆菌的分子流行病学研究

李 军， 邹明祥， 王海晨， 胡咏梅， 豆清娅*， 晏 群， 刘文恩

目的 了解临床分离碳青霉烯类不敏感革兰阴性杆菌中blaNDM-1基因的分布，探讨NDM-1阳性菌株的分子流行病学特征。方法 收集长沙地区2011年1月—2012年8月临床分离非重复碳青霉烯类不敏感革兰阴性杆菌，聚合酶链反应（PCR）技术筛查blaNDM-1基因，扩增产物测序和BLAST软件分析。对blaNDM-1基因阳性菌株，采用E试验法检测其药物敏感性、PCR法检测β内酰胺酶基因（包括blaDHA、blaVIM、blaIMP、blaGIM、blaCTX-M、blaKPC、blaTEM和blaSHV等）和16S rRNA甲基化酶基因、脉冲场凝胶电泳（PFGE）及多位点序列分型（MLST）技术进行分子生物学分型。结果 共收集到687株碳青霉烯类不敏感的革兰阴性杆菌，其中3株被证实为blaNDM-1基因阳性菌株，包括2株肺炎克雷伯菌（菌株编号CS11495和CS610）和1株阴沟肠杆菌（菌株编号CS30754）。该3株菌均来源于湘雅医院。在测试的12种抗菌药物中，除对阿米卡星和多黏菌素B敏感外，对其余抗菌药物几乎全耐药。菌株CS11495同时检出blaSHV-12、blaTEM-1、blaCTX-M-15和blaIMP-4，菌株CS610携带blaDHA、blaSHV-12和blaTEM-1，菌株CS30754中blaSHV-12和blaTEM-1基因阳性。其余基因均为阴性。2株肺炎克雷伯菌PFGE分型可分为A、B两型。MLST显示，菌株CS11495、CS610和CS30754分别属于ST629、ST490及ST214，其中ST490为国内首次报道。结论 blaNDM-1阳性菌株具有广泛的耐药谱，与其同时携带多种耐药基因有关。尽管本地区不存在克隆传播，但分布于同一医院的不同科室，应预防其播散。

革兰阴性杆菌； blaNDM-1基因； β内酰胺酶基因； 16S rRNA甲基化酶基因； 脉冲场凝胶电泳； 多位点序列分型

2009年，YONG等［1］在临床分离的1株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌中首次检出blaNDM-1基因。该基因属于β内酰胺酶基因Ambler分子分类中的B类，即金属酶基因。由于携带该金属酶基因的菌株对目前临床常用抗菌药物几乎全耐药而被称作“超级细菌”。近期研究发现，该基因大多存在于接合性的质粒上，可通过接合的方式在同种菌甚至不同种菌中传播，严重威胁着人类的健康［2-3］。

本课题组前期在本院已检出1株blaNDM-1基因阳性的肺炎克雷伯菌。为进一步明确长沙地区携带blaNDM-1基因革兰阴性杆菌的分子流行病学特征，此次拟采用PCR法对收集的菌株进行blaNDM-1基因筛查，并对阳性菌株检测其他耐药基因并作药敏试验，同时采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）和多位点序列分型（MLST）对其进行分子生物学分型。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 687株非重复革兰阴性杆菌来源于2011年1月—2012年8月长沙地区6所综合性医院（湘雅医院、湘雅三医院、长沙市第一人民医院、长沙市第三人民医院、湖南省第二人民医院和长沙市第四人民医院）的临床分离菌株，

1.1.2 试剂和仪器 水解酪蛋白琼脂、药敏纸片和E试验纸条均购自英国OXOID公司；低熔点琼脂糖购于Sangon公司；限制性内切酶XbaI、蛋白酶K、SDS-TE缓冲液、TE缓冲液、TBE液均购自Promega公司；PFGE所用质控菌株（沙门菌H9812）为中国CDC传染病所呼吸道实验室所赠。VITEK-2全自动微生物分析系统（法国生物梅里埃公司）；凝胶成像仪为VL（ViberLourmat）系统；脉冲场凝胶电泳仪为Bio Rad CHEF Mapper XA系统。

1.2 实验方法

1.2.1 药敏试验 用纸片扩散法检测收集到的革兰阴性杆菌对亚胺培南和美罗培南的敏感性。PCR法筛查亚胺培南和（或）美罗培南中介和（或）耐药菌株中的blaNDM-1基因阳性的菌株，相关的操作参照文献［4］。NDM-1阳性菌株药敏试验除庆大霉素采用VITEK-2法检测外，其余抗菌药物包括氨曲南、亚胺培南、美罗培南、厄他培南、头孢他啶、头孢吡肟、哌拉西林、阿米卡星、环丙沙星、哌拉西林-他唑巴坦及多黏菌素B均采用E 试验法进行检测。大肠埃希菌ATCC 25922和铜绿假单胞菌ATCC 27853作同步质控。药敏结果的判断参照CLSI 2014 M100-S24标准［5］。多黏菌素B的结果判断参照EUCAST 标准（http：//www.eucast. org/），即MIC≤2 mg/L 为敏感，MIC＞2 mg/L为耐药。

1.2.2 耐药基因检测 对blaNDM-1基因阳性菌株采用PCR法检测其他β内酰胺酶基因（包括blaDHA、blaVIM、blaIMP、blaGIM、blaCTX-M、blaKPC、blaTEM和blaSHV等）和16S rRNA甲基化酶基因（armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和npmA），引物参照文献［6-7］，见表1。25 μL PCR反应体系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL、上下游引物各1.0 μL、DNA模板1.0 μL、无菌双蒸水9.5 μL。PCR反应条件：预变性94 ℃，5 min；94 ℃变性30 s→退火（退火温度见表1） 30 s→72 ℃延伸30 s，共30个循环；最后72 ℃再延伸7 min。扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳100 V、40 min后，用凝胶成像系统观察结果并拍照分析。PCR阳性产物送上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果采用BLAST（www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST）比对分析。

1.2.3 PFGE 以沙门菌H9812作质控菌株，主要通过菌落收集、凝胶包埋、溶菌酶与蛋白酶K消化、限制性内切酶XbaI酶切、电泳、成像等步骤处理。电泳条件：0.5×TBE缓冲液、温度12 ℃、电场夹角120°，电压5.5 V/cm、脉冲时间0.5～12 s 16 h，20～30 s 7 h，30～70 s 2 h。电泳后，EB染色30 min，以GelDoc2000凝胶成像系统成像。PFGE结果解释参照相关文献［8］。

1.2.4 MLST PCR扩增肺炎克雷伯菌的7个管家基因（rpoB、 gapA、 mdh、 pgi、 phoE、infB、 tonB）， 引物序列及退火温度均参照http：//bigsdb.web.pasteur. fr/klebsiella/primers_used.html；产物测序，将序列与数据库中储存的序列比对，确定其等位基因谱型及菌株序列型（ST型）。PCR扩增阴沟肠杆菌的7个管家基因（dnaA、 fusA、 gyrB、 leuS、 pyrG、 rplB和rpoB），引物信息参照http：//pubmlst.org/ecloacae/ info/E_cloacae_primers.pdf；产物测序，将序列与数据库中储存的序列比对，确定其等位基因谱型及菌株序列型（ST型）。

表1 PCR反应所用引物Table1 Primers used in PCR amplification of relevant genes

2 结果

2.1 菌种分布及碳青霉烯类耐药模式

687株碳青霉烯类不敏感革兰阴性杆菌主要为鲍曼不动杆菌（551株，80.2 %），铜绿假单胞菌（111株，16.2 %），其余依次为大肠埃希菌（7株，1.0 %）、肺炎克雷伯菌（7株，1.0 %）、阴沟肠杆菌（5株，0.6 %）、恶臭假单胞菌（3株，0.4 %）、臭鼻克雷伯菌（1株，0.2 %）、弗劳地枸橼酸杆菌（1株，0.2 %）和奇异变形杆菌（1株，0.2 %）。

根据革兰阴性杆菌对亚胺培南和美罗培南的敏感（S）、中介（I）或耐药（R）进行统计，687株碳青霉烯类不敏感革兰阴性杆菌分为3种耐药模式：亚胺培南耐药、美罗培南耐药为IRMR（682株，99.3 %），亚胺培南耐药、美罗培南中介IRMI（4 株，0.6 %），亚胺培南耐药、美罗培南敏感IRMS（1 株，0.2 %）。比例由高到低依次为IRMR、IRMI、IRMS。

2.2 blaNDM-1基因筛查

通过PCR筛查、扩增产物测序以及与GenBank上已报道的基因序列比对，最终证实为blaNDM-1基因阳性的菌株共有3株，包括2株肺炎克雷伯菌（菌株编号CS11495和CS610）和1株阴沟肠杆菌（菌株编号CS30754）。本研究并未在其他类型菌株中检出blaNDM-1基因，包括铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌以及大肠埃希菌等。该3株菌均分离自湘雅医院，菌株CS610分离自脊柱外科，菌株CS11495为新生儿科，菌株CS30754来源于烧伤科。该3株菌的标本来源为痰液和伤口分泌物，见表2。携带菌株CS11495的患者和菌株CS30754的患者均治疗痊愈，携带菌株CS610的患者主动放弃了治疗。

表2 blaNDM-1阳性菌株的临床流行病学和基因型特征Table2 Clinical epidemiological and genotypic characteristics of blaNDM-1positive isolates

2.3 blaNDM-1阳性菌株的药敏结果

药敏结果显示，3株blaNDM-1阳性的菌株对12种被检测的抗菌药物几乎全耐药。菌株CS11495和CS30754仅对阿米卡星和多黏菌素B敏感，对其余抗菌药物均耐药。菌株CS610除对阿米卡星和多黏菌素B敏感外，还对庆大霉素和环丙沙星敏感。见表3。

2.4 其他耐药基因检测

blaNDM-1基因阳性的菌株同时携带多种其他耐药基因。菌株CS11495同时携带blaSHV-12，blaTEM-1，blaCTX-M-15和blaIMP-4，而菌株CS610携带blaDHA，blaSHV-12和blaTEM-1，菌株CS30754同时检测出blaSHV-12和blaTEM-1基因。3株blaNDM-1基因阳性的菌株中，blaKPC基因和6种16S rRNA甲基化酶基因均为阴性，见表2。

2.5 PFGE

PFGE结果显示，肺炎克雷伯菌CS11495及CS610为两种不同的型别，A型和B型，见图1和表2。

2.6 MLST

MLST显示，2株肺炎克雷伯菌为2种ST型，菌株CS11495为ST629，菌株CS610为ST490。菌株CS30754型别为ST214，见表2。

表3 3株携带blaNDM-1基因菌株对抗菌药物的敏感性Table3 Susceptibility of three blaNDM-1positive strains to antimicrobial agents

图1 2株肺炎克雷伯菌PFGE凝胶电泳图Figure 1 Pulsed-field gel electrophoresis patterns of the two blaNDM-1-positive K. pneumoniae strains

3 讨论

碳青霉烯类抗生素是治疗革兰阴性杆菌严重感染的最有效药物之一。然而，近年来随着该类抗生素在临床上的广泛使用，革兰阴性杆菌对其敏感性逐渐下降。研究显示产生金属酶是导致其耐药的重要机制。金属酶基因包括blaVIM、blaIMP、blaSPM和blaNDM-1等，其中blaNDM-1基因为新近发现的金属酶基因。自首株blaNDM-1基因阳性菌株在印度被报道以来［1］，世界上已有多个国家或地区有其检出的报道［9-12］。国内，2010年3月从宁夏一所医院出生的2名新生儿的粪便中分离到2株携带blaNDM-1基因的屎肠球菌，为国内首次报道blaNDM-1基因阳性的菌株［13］。随后，在云南、河北等多个地区亦有检出的报道［14-16］。

本课题组前期在本地区某医院从1名新生儿患者的痰标本中分离到1株blaNDM-1基因阳性的肺炎克雷伯菌［17］，并且该基因已注册GenBank，登录号为JQ757003，该株菌为中国分离的首株blaNDM-1阳性的肺炎克雷伯菌，说明本地区已存在blaNDM-1阳性的菌株。为明确本地区blaNDM-1基因阳性革兰阴性杆菌的分子流行病学情况，本课题组对本地区6所医院2011年1月—2012年8月临床分离碳青霉烯类不敏感革兰阴性杆菌中携带blaNDM-1基因菌株进行了相关的研究。共检出2株blaNDM-1阳性的肺炎克雷伯菌（菌株编号CS11495和CS610）和1株blaNDM-1阳性的阴沟肠杆菌（菌株编号CS30754）。其中菌株CS610分离自一颈椎外伤患者，该患者行颈椎后路椎管扩大减压枕颈融合术后第5天，出现间歇发热，取伤口分泌物作培养，结果为肺炎克雷伯菌，根据药敏结果采用左氧氟沙星治疗，经治疗后患者症状有所缓解，因家庭原因放弃继续留院治疗，转入当地医院救治。菌株CS30754分离自一全身硝火烧伤患者，经过积极的抗感染治疗患者痊愈出院。有研究显示，去过印度旅游是获得携带blaNDM-1基因菌株的高危因素之一。然而，本研究中的患者均无去过印度的经历，更无与blaNDM-1阳性菌株患者的接触史，推测可能来源于周围环境等。

药敏结果显示该3株菌除了对多黏菌素B和阿米卡星敏感外，对其余抗菌药物几乎全耐药。之前的一些报道称携带blaNDM-1基因的菌株除了对氨曲南以外的β内酰胺类抗生素均耐药，而本研究中的3株阳性菌株不仅对包括氨曲南在内的所有β内酰胺类抗生素耐药，菌株CS30754还对氨基糖苷类抗菌药物（庆大霉素）和氟喹诺酮类抗菌药物（环丙沙星）耐药。推测可能同时存在其他耐药机制。为此，本研究检测其他β内酰胺酶基因（包括blaDHA、 blaVIM、 blaIMP、 blaGIM、 blaCTX-M、blaKPC、blaTEM和blaSHV等），结果发现，blaNDM-1基因阳性的菌株同时携带多种其他β内酰胺酶基因，如blaSHV-12、 blaTEM-1、 blaIMP-4、 blaCTX-M-15和blaDHA等。值得注意的是所有blaNDM-1基因阳性的菌株中blaKPC基因均为阴性，与目前国内的报道一致［18］。然而，国外已经出现了同时携带2种不同类型碳青霉烯酶基因的菌株，如blaNDM-1和blaKPC等［19］。同时，本研究还对16S rRNA甲基化酶基因包括armA、rmtA、rmtB、rmtC和rmtD等进行了检测。结果发现，16S rRNA甲基化酶基因均为阴性，说明16S rRNA甲基化酶并不是导致其对庆大霉素耐药的机制。

近年来，blaNDM-1基因阳性菌株已在部分地区存在克隆传播［20］。然而，本研究中2株blaNDM-1基因阳性的肺炎克雷伯菌PFGE分型属于不同的型别，说明本地区暂不存在blaNDM-1基因阳性菌株的克隆传播。MLST结果显示，菌株CS11495属于 ST629，与宁长秀等［21］的报道一致，而菌株CS610属于ST490，为国内首次报道。2株blaNDM-1基因阳性的肺炎克雷伯菌分别属于2个不同的ST型别，进一步说明本地区blaNDM-1阳性菌株为散发形式存在。但值得注意的是，3株阳性菌株均源于同一所医院的不同科室。因此，应该采取相应的措施预防和控制其进一步播散及流行。

综上所述，本研究共检出3株blaNDM-1阳性菌株，说明本地区已存在该基因阳性的菌株。携带blaNDM-1基因的菌株具有广泛的耐药谱，与其同时携带多种耐药基因有关。尽管本次研究中并未发现本地区blaNDM-1基因阳性菌株存在克隆流行，但阳性菌株分布在同一医院的不同科室，应引起临床和医院感控部门的高度重视。

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Molecular characterization and prevalence of blaNDM-1metallo-β-lactamase gene in carbapenem non-susceptible gram-negative bacilli

LI Jun， ZOU Mingxiang， WANG Haichen， HU Yongmei， DOU Qingya， YAN Qun， LIU Wenen.
（Department of Laboratory Medicine， Xiangya Hospital， Central South University， Changsha 410008， China）

Objective To investigate the molecular characterization and prevalence of blaNDM-1positive isolates in carbapenem non-susceptible gram-negative bacilli. Methods Carbapenem non-susceptible gram-negative isolates were collected from January 2011 to August 2012 in Changsha area. The blaNDM-1gene was detected by PCR method. The positive products were sequenced and analyzed with BLAST. Then， antimicrobial susceptibility of blaNDM-1positive isolates were determined by E-test. Other β-lactamase genes and 16S rRNA methylase genes were identified by PCR method， including blaDHA， blaVIM， blaIMP， blaGIM， blaCTX-M， blaKPC， blaTEMand blaSHV. Finally， those blaNDM-1positive isolates were typed by pulsed-field gel electrophoresis （PFGE） and multilocus sequence typing （MLST）. Results A total of 687 carbapenem non-susceptible gram-negative isolates were collected. Three isolates were confirmed as blaNDM-1positive isolates， including two K. pneumoniae isolates and one E. cloacae. All the three strains were derivedfrom Xiangya Hospital. To the 12 antibiotics tested， those blaNDM-1positive isolates were susceptible to only amikacin and polymyxin B. One K. pneumoniae strain CS11495 was found carrying blaSHV-12， blaTEM-1， blaCTX-M-15and blaIMP-4， while the other strains harbored blaDHA， blaSHV-12and blaTEM-1. E. cloacae strain CS30754 was positive for blaSHV-12and blaTEM-1. The two K. pneumoniae isolates were grouped into two types（type A and B） by PFGE. MLST results showed that CS11495，CS610 and CS30754 strains belonged to ST629， ST490 and ST214， respectively. ST490 was reported for the first time in China. Conclusions The pan-drug resistance of blaNDM-1positive strains may be associated with the co-existence of multiple resistance genes. The blaNDM-1positive strain was identified in different departments of this hospital， although no clonal spread was found. Therefore， care should be taken to prevent the outbreak of this pathogen.

gram-negative bacillus； blaNDM-1gene； β-lactamase gene； 16S rRNA methylase gene； pulsed-field gel electrophoresis； multilocus sequence typing

R378

A

1009-7708（2016）04-0631-06

10.16718/j.1009-7708.2016.04.019

2015-10-22

2015-11-30

湖南省发改委（湘发改高技［2012］1493号；湘发改投资［2014］658号）；湖南省自然科学基金（14JJ7003）。

中南大学湘雅医院检验科，长沙 410008； *医院感染控制中心。

李军（1984—），男，硕士，检验师，主要从事细菌耐药机制研究。

邹明祥， E-mail：zoumingxiang@126.com。