一氧化碳释放分子- 2对小鼠广泛耐药鲍曼不动杆菌肺炎的疗效观察

秦 帅， 王晓丽， 潘婷婷， 谭若铭， 李梅玲， 李 磊， 瞿洪平， 黄 洁

·论著·

一氧化碳释放分子- 2对小鼠广泛耐药鲍曼不动杆菌肺炎的疗效观察

秦 帅， 王晓丽， 潘婷婷， 谭若铭， 李梅玲， 李 磊， 瞿洪平， 黄 洁

目的 评价一氧化碳释放分子-2（CORM-2）对小鼠广泛耐药鲍曼不动杆菌（XDRAB）肺炎的疗效。方法 通过体外抑菌试验检测CORM-2对XDRAB生长的抑制作用。再通过建立XDRAB肺炎小鼠模型，观察CORM-2对肺炎小鼠的抗菌、抗炎效果。结果 CORM-2显著下调XDRAB肺炎小鼠肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）和抗炎因子IL-10的水平，抑制肺组织髓过氧化物酶（MPO）与一氧化氮（NO）的表达，减轻肺组织病理损伤，同时显著降低了肺组织内细菌负荷量。结论 CORM-2在体外和体内对XDRAB均具有显著的抑菌作用，同时在体内发挥重要的抗炎、抗氧化作用。

一氧化碳释放分子； 鲍曼不动杆菌； 肺炎； 小鼠

鲍曼不动杆菌是一种常见的不发酵糖、氧化酶阴性的需氧革兰阴性杆菌。近年来随着其耐药性的不断增加，多重耐药（MDR）、广泛耐药（XDR）甚至全耐药（PDR）鲍曼不动杆菌在全球广泛播散，成为医院感染的主要病原菌之一［1-2］。2013年CHINET显示鲍曼不动杆菌已成为国内第三大医院感染病原菌［3］。而XDR鲍曼不动杆菌（XDRAB）是国内目前最主要的流行株，尤其在重症监护病房（ICU）暴发流行［4］。针对XDRAB的抗菌药物选择与疗效均非常有限，临床上迫切需求新的有效的抗菌药物研发。近年研究发现，外源性一氧化碳（CO）释放分子（carbon monoxide-releasing molecule，CORM）对众多常见病原菌都有良好的抗菌作用，甚至好于目前临床常用的抗生素［5］。这对于细菌耐药性不断增加的现状来说可能具有重要的意义。本研究旨在通过CORM-2治疗XDRAB小鼠肺炎的结果验证CO的抗炎与抗菌效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 小鼠肺炎造模用菌株采用本院外科

ICU（SICU）流行菌XDRAB，由临床微生物检验科提供，经血平皿划线铺板孵育后挑单克隆菌株，鉴定后分管，-80℃冰箱保存。通过前期实验，证实5×107CFU/20 μL的XDRAB可成功造模小鼠肺炎，且24 h存活率100 %，72 h后半数以上死亡，因此本实验造模浓度确定为2.5×109CFU/mL。实验前将菌株接种入LB培养液，37℃孵育18 h后计数并调整最终浓度至2.5×109CFU/mL。

1.1.2 主要试剂与仪器 CORM-2，分子式为

Ru （CO）4Cl2，购自Sigma-Aldrich （St Louis，MO，美国）公司，溶解在DMSO中获得

10 mmol / L溶液。等浓度CORM-2溶液置于37℃

培养箱静置18 h，释放CO，最后通入一氧化氮（NO）去除残余CO，配置成失活的抑制CORM-2

（iCORM-2），即释放尽CO后残留的金属羟化物载体。血平皿、MH琼脂购自法国生物梅里埃公司。细菌鉴定采用VITEK-AMS自动化微生物分析仪，GNI+鉴定卡和药敏卡片均由法国生物梅里埃公司提供。酶联免疫吸附法（ELISA）测定肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6、IL-10、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、髓过氧化物酶（MPO）和NO试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。

1.1.3 实验动物 清洁级C57BL/6小鼠40只，雄性，6周龄，平均体质量（20±2）g，购自中国科学院动物研究所，由上海交通大学医学院动物实验室饲养。

1.2 方法

1.2.1 体外抑菌试验 将培养好的XDRAB培养液通过分光光度计D600检测稀释至0.2，分入无菌离心管，每管5 mL细菌液，分为A、B、C三大组，A组包括对照组、CORM-2（10 μg/mL）组和iCORM-2（10 μg/mL）组各15管，B组包括对照组、CORM-2（30 μg/mL）组和iCORM-2（30 μg/ mL）组各15管，C组包括对照组、CORM-2（50 μg/ mL）组和iCORM-2（50 μg/mL）组各15管。配置后放入37℃震荡箱孵育，分别在2 h、6 h和12 h每组取出5管测D值，最后通过平均D值制作生长曲线。

1.2.2 小鼠肺炎模型 实验小鼠随机分成4组：对照组（A组，n=10），XDRAB肺炎组（B组，n=10），XDRAB肺炎+CORM-2（10 μg/g）组（C组，n=10）以及XDRAB肺炎+iCORM-2（10 μg/ g）组（D组，n=10）。所有小鼠麻醉前称重，水合氯醛腹腔麻醉后，取头高脚低位，采用滴鼻法造模。用微量注射器给B、C、D组小鼠经鼻腔慢速滴注菌液20 μL，A组小鼠滴注生理盐水20 μL，滴注后保持小鼠直立位10 min，同时给予缓慢左右转动。20 min后A组、B组采用滴鼻法分别给予20 μL生理盐水滴鼻，C组、D组小鼠分别给予CORM-2和iCORM-2 20 μL（10 μg/g）滴鼻。造模后小鼠在无菌实验室正常饲养24 h。

1.2.3 标本采集与检测 在造模24 h后，腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠。每组随机抽取5只小鼠，解剖后直接左心室采血，4 ℃ 3 000 g高速离心15 min，取上层血清-80℃保存，待测。之后快速解剖小鼠肺脏，取右肺洗净后，4%甲醛固定，石蜡包埋，病理切片，苏木精-伊红（HE）染色，用显微镜观察肺组织的炎性反应和病理改变。每组剩余5只小鼠，无菌操作解剖肺脏，右肺放入无菌研磨管，加入研磨珠和无菌磷酸缓冲液（PBS）2 mL进行研磨，4 ℃ 10 000 g高速离心5 min，取上清液500 μL-80℃保存，以备检测。左肺放入无菌研磨管，加入研磨珠和无菌PBS 2 mL进行研磨，各取500 μL混悬液，PBS稀释至4 mL，各取50 μL接种血平皿，37 ℃培养18 h，计数平皿菌落数。

2 结果

2.1 CORM-2的体外抑菌效果

图1是通过D600测值获得的体外细菌生长曲线，实验显示CORM-2对XDRAB生长具有明显的抑制作用，10 μg/mL（图1A）、30 μg/mL（图1B）和50 μg/mL（图1C）均能达到显著效果（P ＜0.05），而同样浓度的iCORM-2失去了抗菌活性，对XDRAB生长无任何影响。因此选择CORM-2 10 μg/mL（即10 μg/g）作为后续体内实验的治疗浓度。

图1 体外抑菌试验Figure 1 Bacteriostatic test of carbon monoxide-releasing molecule in vitro

2.2 CORM-2对肺炎小鼠的作用

2.2.1 肺组织形态学改变 正常对照组（A组）小鼠肺组织肺泡结构清晰，肺泡间质无炎性细胞浸润，无水肿充血（图2A）；XDRAB肺炎组（B组）小鼠的肺组织充血明显，肺泡间质有大量炎性细胞浸润，肺泡壁增宽，结构有破坏，肺泡腔内可见出血和渗出（图2B）；XDRAB肺炎经CORM-2干预后（C组）肺组织充血程度、肺泡间质炎性浸润及肺泡腔内的出血和渗出明显减轻，肺泡壁水肿程度减轻（图2C）；另外，XDRAB肺炎加iCORM-2组（D组）小鼠肺部肺组织结构有破坏，肺泡间质炎性细胞和红细胞浸润与XDRAB肺炎组近似（图2D）。

图2 小鼠肺部病理图片（HE染色 ×100）Figure 2 Pathological images of mouse lung tissues （HE stain ×100）

2.2.2 肺炎小鼠血清细胞因子水平 通过ELISA检测发现，造模24 h后，XDRAB肺炎组（B组）小鼠的血清TNF-α、IL-6和HMGB1水平较对照组显著升高（P ＜0.05），而IL-10也明显升高（P ＜0.05）。CORM-2干预后，肺炎小鼠的TNF-α、IL-6、HMGB1和IL-10水平显著降低，提示CORM-2可下调炎性反应。另外，iCORM-2干预对肺炎小鼠血清细胞因子水平无明显影响（P＞0.05），各组测值显著高于CORM-2干预组（P＜0.05）。提示iCORM-2对炎性反应物无抑制作用，如图3 （A～D）所示。

2.2.3 肺炎小鼠肺组织MPO与NO水平 通过ELISA检测发现，肺组织MPO与NO水平在肺炎组小鼠显著高于对照组（P ＜0.05）；CORM-2干预后，肺炎小鼠肺组织MPO与NO水平显著下降（P＜0.05）；iCORM-2干预对肺炎小鼠肺组织MPO与NO水平无明显影响（P＞0.05），对比CORM-2干预组差异有统计学意义（P＜0.05），如图3 （E～F）所示。

2.2.4 肺组织匀浆菌落计数 各组小鼠肺组织匀浆经稀释320倍后铺于血平皿培养18 h（图4）。结果发现对照组无菌落生长，XDRAB肺炎+CORM-2组菌落生长数明显少于XDRAB肺炎组和XDRAB肺炎+iCORM-2组（P＜0.05），XDRAB肺炎组与XDRAB肺炎+iCORM-2组的菌落生长数差异无统计学意义（P＞0.05）。各平皿菌落随机挑选5个克隆检测后证实为造模用菌株。

3 讨论

CO曾被认为是一种对人体有害的气体，会与氧气竞争性结合血红蛋白，使氧的转运发生障碍，引起组织缺氧。事实上，哺乳动物几乎所有的器官组织细胞都能产生和释放内源性CO［6］。CORM是利用特殊的载体结合CO后使其能在固体状态下长期保存，遇溶剂则分解释放CO气体。目前用于科研的主要有CO缓慢释放型CORM-A1、过渡金属载体化合物CORM-2和改进的过渡金属载体化合物CORM-3。随着研究的深入，学者们发现CO是继NO之后又一个重要的气体信号分子，具有抗氧化、抗炎与抗凋亡等细胞保护作用［7］。CORM-2在脓毒症休克小鼠，可通过抑制细胞黏附分子-1（ICAM-1）与一氧化氮合酶（INOS）减轻小肠炎性反应和氧化应激［8］；CORM-3通过减少中性粒细胞表面弹性蛋白酶，抑制粒细胞在血管内皮表面的滚动与黏附，减少脓毒症小鼠肺内粒细胞的聚集［9］；在小鼠移植气管，CORM-2可降低血清干扰素（IFN）-γ、IL-2和IL-17A表达，减少移植气管内CD3+淋巴细胞与巨噬细胞量，从而发挥抗气管移植排斥的作用［10］；CORM-3抑制脂多糖（LPS）、INF-γ刺激小胶质细胞引起的炎性反应，其机制可能是通过抑制PI3K与细胞外调节蛋白激酶（ERK）［11］；CORM-2显著抑制烧伤小鼠小肠炎性因子释放［ IL-1β、TNF-α、丙二醛（MDA）和NO ］，减少烧伤引起的活性氧簇（ROS）生成，减少氧化应激［12］。本研究同样发现，CORM-2可以显著抑制XDRAB肺炎小鼠促炎因子的释放，同时下调肺内MPO与NO水平，从而减轻了肺组织水肿、炎细胞浸润和结构损伤。而失活的iCORM的无法达到以上效果，证明CO在抑制炎性反应和抗氧化反应中起着重要作用。

图3 小鼠血清细胞因子和肺组织MPO、NO水平Figure 3 Levels of TNF-α， IL-6， HMGB1， IL-10 in serum， and myeloperoxidase， nitrogen monoxide levels in lung tissue

图4 肺组织匀浆菌落计数Figure 4 Colony count in lung tissue homogenate

CORM的抗菌作用在近年才得到研究。NOBRE等［13］2007年报道了CORM对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌生长的抑制作用，首次发现了CO的杀菌作用；DESMARD等［14］也发现CORM-3可通过干扰呼吸链电子传递抑制铜绿假单胞菌生长，提高铜绿假单胞菌感染小鼠的存活率；MURRAY等［15］发现CORM-2可破坏铜绿假单胞菌生物被膜而起到杀菌效果；BANG等［16］发现CORM-2对产ESBL大肠埃希菌同样具有杀菌效应。为进一步探讨CORM-2对耐药菌的作用，我们首先通过体外实验证实了CORM-2对体外培养的XDRAB具有显著的抑菌作用，而iCORM-2并不具备抗菌活性，间接证明CORM-2的抗菌效应以CO为主。在小鼠体内实验中，我们同样证实了CORM-2对XDRAB的抗菌效应，在减少肺内细菌负荷的同时缓解了肺部炎性反应，而iCORM-2在体内同样不具有抗菌活性。

这些研究都证实了CO的抗菌特性，然而也有学者发现，CORM-A1可发挥抑菌作用而无杀菌效果，对抑制铜绿假单胞菌呼吸氧耗的作用显著弱于CORM-2和CORM-3，同时CO释放的快慢对其抗菌作用并无明显影响［17-18］。同样释放CO，它们的杀菌效果为何存在差异？事实上，CORMA1与CORM-2、CORM-3最根本区别是不含过渡金属载体（Ru）。NORBE等［19］通过基因芯片发现CORM-2作用于大肠埃希菌后引起硫代谢和蛋氨酸代谢相关蛋白上调。MCLEAN等［20］发现CORM-3治疗时进入细胞的Ru浓度约是iCORM-3的2倍，CORM-3可引起细菌显著的基因组学变化，抑制ABC转运蛋白，影响硫代谢和下调细胞内自由硫基，而iCORM-3的作用微弱。这些研究提示，CO和Ru在抑菌、杀菌机制中发挥着重要的协同作用，CORM-2和CORM-3所含的Ru通过结合细胞内含硫氨基酸协助CO快速进入细胞内发挥抗菌作用，同时减少CO与血红蛋白接触机会而不产生毒性。

综上所述，CORM-2对XDRAB具有显著的杀菌作用，并且在XDRAB肺炎小鼠体内同时发挥抗炎和抗菌作用。这些都提示CORM有望成为研发新型抗菌药物的基础物质，甚至为耐药菌的治疗带来希望。

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Effect of carbon monoxide-releasing molecule （CORM-2） in mouse model of pneumonia caused by extremely-drug resistant Acinetobacter baumannii

QIN Shuai， WANG Xiaoli， PAN Tingting， TAN Ruoming， LI Meiling， LI Lei， QU Hongping， HUANG Jie.
（Department of Intensive Care Unit， Ruijin Hospital， School of Medicine， Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200025， China）

Objective To evaluate the effcacy of carbon monoxide-releasing molecule （CORM-2） in mouse model of pneumonia caused by extremely-drug resistant Acinetobacter baumannii （XDRAB）. Methods To investigate the effect of CORM-2 on XDRAB proliferation in the bacteriostatic test in vitro. Then the mouse model of pneumonia was established by XDRAB challenge. The mice in experimental group were treated with CORM-2 by nasal insuffation. The anti-infammatory and bacteriostatic effects of CORM-2 were analyzed by comparing with the non-treatment group. Results Compared to the control group， CORM-2 treatment signifcantly down-regulated the infammatory factors of TNF-α， IL-6， HMGB1 and IL-10 in serum， inhibited the expressions of myeloperoxidase and nitrogen monoxide in lung tissues， alleviated pathological lung damage， and reduced bacterial load in lung tissues. Conclusions CORM-2 has signifcant bacteriostatic effect on XDRAB in vitro and in vivo. It also plays an important role in the anti-infammatory and antioxidant process in vivo.

carbon monoxide-releasing molecule； Acinetobacter baumannii； pneumonia； mouse

R378

A

1009-7708 （ 2016） 05-0583-06

10.16718/j.1009-7708.2016.05.010

2015-11-19

2015-12-29

上海市科委医学引导项目（134119b0200）。

上海交通大学医学院附属瑞金医院重症医学科，上海 200025。

秦帅（1976—），男，硕士，主治医师，主要从事临床危重病治疗。

黄洁，E-mail： seaky_huang@yahoo.com。