血液分离高黏液表型肺炎克雷伯菌的毒力基因检测及生物膜形成测定

魏丹丹， 李喜红， 王莲慧， 刘 洋， 万腊根， 邓 琼， 徐群飞， 王贵明

·论著·

血液分离高黏液表型肺炎克雷伯菌的毒力基因检测及生物膜形成测定

魏丹丹， 李喜红， 王莲慧， 刘 洋， 万腊根， 邓 琼， 徐群飞， 王贵明

目的 检测血液分离肺炎克雷伯菌的高黏液（HM）表型、荚膜血清型及主要毒力基因，并测定其生物膜形成情况。方法 收集血源性肺炎克雷伯菌82株，黏液丝试验检测HM表型。PCR筛查6种常见高毒力荚膜血清型（K1、K2、K5、K20、K54、K57）和7种常见毒力基因（rmpA、rmpA2、aerobactin、mrkD、iroN、magA、wcaG），利用微孔板法检测生物膜的形成。毒力分数（毒力基因个数）组间比较采用秩和检验，率的组间比较采用卡方检验。结果 82株血源性肺炎克雷伯菌中，黏液丝试验阳性占31.7 %（26/82），高毒力荚膜血清型菌株的阳性率为40.2 %（33/82），二者均阳性24株，阳性率为29.3 %（24/82）， 毒力分数的第50百分位数P50为2。HM表型与非HM表型菌株中高毒力荚膜血清型的检出率分别为92.3 %（24/26）和16.1 %（9/56），毒力分数P50分别为5和1，差异均有统计学意义 （P＜0.05）。高毒力荚膜血清型菌株的毒力分数P50为5.5，高毒力荚膜血清型菌株中，K1/K2/K57型的毒力分数与K5/K20/K54型比较差异有统计学意义（P＜0.01）。HM表型菌株和非HM菌株形成生物膜的阳性率分别为50.0 %（13/26）和73.2 %（41/56）， 二者差异有统计学意义（P＜0.05），高毒力荚膜血清型菌株形成生物膜的阳性率为60.6 % （20/33），不同高毒力荚膜血清型肺炎克雷伯菌中，K54菌株形成生物膜的能力最强，阳性率为6/8。结论 致血流感染肺炎克雷伯菌存在多种强毒力和（或）生物膜阳性菌株，必须高度重视，避免广泛流行。

肺炎克雷伯菌； 高黏液表型； 荚膜血清型； 毒力； 生物膜

肺炎克雷伯菌是临床常见的条件致病菌之一，能引起呼吸系统感染、尿路感染、软组织感染等多种感染性疾病，近年来已成为医院感染的重要病原菌。目前，肺炎克雷伯菌引起的血流感染已较为常见，是肠杆菌科中仅次于大肠埃希菌的血流感染病原菌［1］。同时，肺炎克雷伯菌也是一种容易形成生物膜的病原菌［2］，生物膜的形成使治疗变得非常困难，尤其是留置导管的患者容易发生导管相关性血流感染。与其他病原菌一样，肺炎克雷伯菌有多种致病物质，荚膜能够使细菌抵抗血清的杀菌作用和中性粒细胞的吞噬作用，黏附素允许菌体通过吸附进入宿主细胞，铁摄取系统能使其在宿主的铁限制环境中增殖，毒素或其他细胞外成分产生黏膜损伤，协助其侵入血液。本研究对我院2014年1－12月血液标本中分离的82株肺炎克雷伯菌进行实验室检测，以明确表型和基因特征。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株及来源

收集我院2014年1—12月血流感染患者送检的血标本，采用VITEK-2 Compact微生物分析仪（法国生物梅里埃公司）对分离到的菌株进行鉴定，重复患者只取1次分离的肺炎克雷伯菌作为本次研究的对象，共分离到82株肺炎克雷伯菌。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853和肺炎克雷伯菌ATCC 700603，均购于卫生部临床检验中心。

1.2 方法

1.2.1 荚膜血清分型及毒力基因检测 热裂解法提取菌株DNA。采用PCR方法筛选所有肺炎克雷伯菌的高毒力荚膜血清型基因（K1、 K2、 K5、 K20、K54、 K57）［3］，PCR方法检测肺炎克雷伯菌的7种常见毒力基因（magA、 rmpA、 rmpA2、 aerobactin、 wcaG、mrkD、iroN），PCR扩增引物、体系和扩增条件参照相关文献［3-4］。将阳性扩增产物送上海生工生物有限公司测序并比对分析。菌株携带毒力基因的个数用毒力分数表示［5］。

1.2.2 生物膜体外形成试验 生物膜体外形成试验参照文献［6-7］。 将菌株置于LB培养基中，37 ℃震荡过夜，配成0.5麦氏浊度的菌液，并用LB肉汤1∶ 100稀释，稀释后的肉汤加入96孔聚苯乙烯灭菌微孔板中，200 μL/孔，每株菌接种3孔，以200 μL无菌LB肉汤作为阴性对照。 将微孔板37 ℃培养24 h，吸出菌液，用pH 7.0的磷酸盐缓冲液洗板3次，晾干后用1 %结晶紫染色。15 min后将染液吸出，用蒸馏水洗板至无色。 晾干后，用200 μL的无水乙醇充分溶解结晶紫，转移至新的微孔板中，在570 nm波长下读取光密度（D）值。测量阴性对照的D值25次，以（x±3s）为阴性对照区间，大于该值则判定为生物膜形成阳性。

1.2.3 高黏液（hypermucoviscosity， HM）表型检测 应用黏液丝试验检测，用接种环轻触血琼脂平皿上过夜培养的新鲜菌落向外牵拉，重复牵拉2次，若2次均有黏液丝形成并且长度大于5 mm即判为HM表型阳性，即该菌株为HM菌株［8］。

1.2.4 统计学方法 采用EXCEL2007进行数据整理，统计分析采用SPSS 17.0软件，毒力分数呈偏态分布，组间比较采用秩和检验，率的组间比较采用χ2检验或Fisher检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HM表型检测及血清荚膜分型、毒力基因分 布

82株血源性肺炎克雷伯菌中，黏液丝试验阳性菌株共26株，阳性率为31.7 %（26/82），高毒力荚膜血清型33株，阳性率为40.2 %（33/82），且主要为K1型（11株，33.3 %）、K2型（7株， 21.2 %）和K54（8株，24.2 %），其余为K5型（1 株，3.0 %）、K20（2株， 6.1 %）和K57（4 株， 12.1 %），其中HM表型与高毒力血清型共阳性24株，阳性率为29.3 %（24/82）。此外，7种毒力基因中检出率最高为mrkD （93.9 %），其次为aerobactin（40.2 %），其毒力分数为0～7，第25百分位数（P25）、第50百分位数（P50）、第75百分位数（P75）分别为1、2和5，见表1。

表1 HM表型、K分型及毒力基因携带Table1 Detection of hypermucoviscous phenotype， capsular serotypes and virulence genes

2.2 HM表型、高毒力荚膜血清型与毒力基因关系

高毒力荚膜血清型菌株在HM表型与非HM表型菌株中的阳性率分别为92.3 %（24/26）和16.1 %（9/56），两者比较差异有统计学意义 （χ2= 39.801， P＜0.05），K1、K54和K57型是HM表型肺炎克雷伯菌的主要荚膜型，占73.1 %（19/26）。HM表型与非HM表型菌株的毒力分数P50分别为5和1，U值为96.500，P=0.000，且7种毒力基因的检出率HM表型菌株均大于非HM表型菌株，其中6种（rmpA、rmpA2、aerobactin、iroN、magA、wcaG）差异有统计学意义（P均小于0.01）。高毒力荚膜血清型与非高毒力荚膜血清型菌株的毒力分数P50分别为5.5和1，U值为50.500，P=0.016。 其中高毒力荚膜血清型菌株中，K1/K2/ K57菌株和K5/K20/K54菌株的毒力分数P50分别为6.5和2，U值为48.500，P=0.002，

2.3 HM表型、高毒力荚膜血清型与生物膜形成的关系

阴性对照的D值区间为0.073±0.018， D值＞0.091的菌株判定为生物膜形成阳性。82株肺炎克雷伯菌株有54株形成生物膜，阳性率达65.8 %，HM表型菌株和非HM表型菌株形成生物膜的阳性率分别为50.0 %（13/26）、73.2 %（41/56）， 两者比较差异有统计学意义（χ2= 4.26，P＜0.05），高毒力荚膜血清型与非高毒力荚膜血清型菌株形成生物膜的阳性率分别为60.6 % （20/33）、69.4 %（34/49），差异无统计学意义，而不同高毒力荚膜血清型肺炎克雷伯菌中，K54菌株形成生物膜的能力最强，阳性率为6/8，其次为K2菌株，阳性率为4/7。

3 讨论

荚膜多糖使肺炎克雷伯菌具有黏液性状表型，临床资料表明，具有HM表型的菌株更易引起一些特殊的侵袭性感染，如肝脓肿、脑膜炎、脓胸、眼内炎等［9］，若为血流感染，则更易随血流播散至其他部位，形成多发性脓肿和严重多脏器功能衰竭，严重危及患者的生命。本试验参照文献［8］通过拉丝实验半定量测定血流感染肺炎克雷伯菌的HM性状，该方法操作简单快速，结果易于判断，适合临床微生物实验室用来描述菌株的特性，结果在82株肺炎克雷伯菌中，共检测到HM表型菌株26株，占31.7 %。

荚膜多糖是肺炎克雷伯菌最主要的毒力因子之一，可以使菌体对抗中性粒细胞吞噬作用，介导菌体逃避宿主的免疫杀伤，同时具有抗血清杀菌作用。目前，已确定有78个荚膜血清型别，其中，Kl、K2、K5、K20、K54和K57型菌株与人类及动物的各种侵袭性感染密切相关，为高毒力血清荚膜分型肺炎克雷伯菌［10］。本研究中，我们对高毒力血清荚膜基因进行扩增，82株血源性肺炎克雷伯菌中，高毒力荚膜血清型菌株的检出率为40.2 %，HM表型菌株中，高毒力荚膜血清型的检出率高达92.3 %，而在非HM表型菌株中，高毒力荚膜血清型的检出率，仅为16.1 %，差异有统计学意义。同时我们还扩增了7种与荚膜合成、黏附损伤及生长相关的毒力基因，rmpA和rmpA2基因是一种同源的荚膜多糖合成调节基因，二者共同参与菌株黏液性状的调控［11-12］，此外，magA基因位于K1荚膜多糖体生物合成区内，是调控血清型Kl的主要基因［13］，研究表明，敲除rmpA和magA基因，细菌的HM表型、血清抵抗和细胞吞噬抗性均降低，致病力也降低［14］。wcaG因子则编码荚膜多糖中岩藻糖的生物合成，可增强菌体抗巨噬细胞吞噬作用，与K1和K54血清型密切相关，其他毒力因子如aerobactin、iroN基因可使细菌竞争组织中的铁以增强生存能力［10］；而与菌毛编码蛋白有关的mrkD则可促进细菌黏附而增强致病力［15］。本研究发现，所有毒力基因的检出率，HM菌株均大于非HM菌株，其中rmpA、rmpA2、aerobactin、iroN、magA、wcaG差异具有统计学意义。以上说明HM表型可作为鉴定临床分离菌株是否为高毒力菌株的指标之一，建议实验室不仅要开展对肺炎克雷伯菌耐药性的检测，还应特别注意检测肺炎克雷伯菌的黏液性状、荚膜型及毒力基因携带，并及时将检测结果与临床沟通。

生物膜是细菌为适应生存环境而吸附于有生命体或无生命体表面形成的菌落聚集物，由细菌和自身分泌的胞外基质组成。这类细菌群体耐药性强，并可逃避机体免疫系统的吞噬作用，使感染部位难以彻底清除，是临床上难治性感染的重要原因之一［16］。肺炎克雷伯菌也是易形成生物膜的微生物之一。影响其形成生物膜的因素较多，如荚膜、菌毛、数量感知系统等，其中菌毛在生物膜形成中起到重要作用，研究证实3型菌毛与生物膜的形成密切相关，3型菌毛主要由亚单位蛋白TurkA和末端黏附因子mrkD构成，黏附因子mrkD可促进生物膜的形成［15］。本研究中mrkD基因在肺炎克雷伯菌中分离率高达93.9 %，mrkD阳性结果与生物膜的形成情况并不完全吻合，说明生物膜的形成可能与其编码蛋白的表达量相关，或是与其他因素综合调控的结果，具体机制还需进一步研究。本研究生物膜形成试验显示，HM菌株和非HM菌株形成生物膜的比率均大于50 %，且高毒力荚膜血清型菌株形成生物膜的阳性率高达60.6 %，生物膜的形成或给临床高毒力肺炎克雷伯菌的治疗带来新的挑战，提示临床一旦发生肺炎克雷伯菌感染，尤其是HM菌株，还须注意预防生物膜的形成，避免发生导管相关性血流感染。

综上所述，本地区致血流感染肺炎克雷伯菌中存在强毒力和（或）生物膜形成阳性的克隆株，必须高度重视，建议开展更广范围的监测。

［1］魏泽庆，沈萍，陈云波，等. Mohnarin 2010年报告：血流感染细菌构成及耐药性分析［J］.中华医院感染学杂志，2012，22（3）：465-570.

［2］CHEN KM， CHIANG MK， WANG M，et al. The role of pgaC in Klebsiella pneumonia virulence and biofilm formation［J］. Microb Pathog，2014，77： 89-99.

［3］沈定霞，李东冬，郭玲，等.高黏液表型肺炎克雷伯菌的荚膜分型与毒力基因的检测［J］.中华检验医学杂志，2014，37（5）：374-377.

［4］EI FERTAS-AISSANI R，MESSAI Y，ALOUACHE S，et al. Virulence profiles and antibiotic susceptibility patterns of Klebsiella pneumoniae strains isolated from different clinical specimens［J］. Pathol Biol（ Paris），2013，61（5）：209-216.

［5］董敏，郑书发，余斐，等.尿道致病性大肠埃希菌克隆株毒力和耐药性的研究［J］.中华检验医学杂志，2014，37（7）：531-534.

［6］李东冬，沈定霞，郭玲，等.血液分离肠球菌毒力基因检测及生物膜形成测定［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2013，33（11）：865-867.

［7］O'TOOLE GA. Microtiter dish biofilm formation assay［J］. J Vis Exp， 2011，（47），pii：2437.

［8］Nadasy KA，Domiati-Saad R，Tribble MA. Invasive Klebsiella pneumonia syndrome in North America［J］. Clin Infect Dis，2007，45（3）：e25-e28.

［9］SHON AS， BAJWA RP，RUSSO TA. Hypervirulent（hypermucoviscous） Klebsiella pneumoniae： a new anddangerous breed［J］. Virulence，2013，4（2）：107-118.

［10］TURTON JF，PERRY C，ELGOHARI S，et al. PCR characterization and typing of Klebsiella pneumoniae using capsular type-specific， variable number tandem repeat and virulence gene targets［J］. J Med Microbiol，2010，59（ 5）：541-547.

［11］YU WL，LEE MF，TANG HJ，et al. Low prevalence of rmpA and high tendency of rmpA mutation correspond to low virulence of extended spectrum β-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae isolates［J］. Virulence，2015，6（2）：162-172.

［12］ CHENG HY，CHEN YS，WU CY，et al.RmpA regulation of capsular polysaccharide biosynthesis in Klebsiella pneumoniae CG43［J］. J Bacteriol，2010，192（12）：3144-3158.

［13］YEH KM，LIN JC，YIN FY，et al. Revisiting the importance of virulence determinant magA and its surrounding genes in Klebsiella pneumoniae causing pyogenic liver abscesses： exact role in serotype K1 capsule formation［J］. J Infect Dis，2010，201（8）：1259-1267.

［14］YU WL，KO WC，CHENG KC，et al. Association between rmpA and magA genes and clinical syndromes caused by Klebsiella pneumoniae in Taiwan［J］. Clin Infect Dis，2006， 42（10）：1351-1358.

［15］STAHLHUT SG，CHATTOPADHYAY S，KISIELA DI，et al. Structural and population characterization of MrkD， the adhesive subunit of type 3 fimbriae［J］. J Bacteriol，2013，195（24）：5602-5613.

［16］刘家云，马越云，丁振若，等.细菌生物膜及其临床意义［J］.中华检验医学杂志，2007，30（5）：494-497.

Detection of virulence genes and biofilm formation of Klebsiella pneumoniae strains isolated from blood samples

WEI Dandan， LI Xihong， WANG Lianhui， LIU Yang， WAN Lagen， DENG Qiong， XU Qunfei， WANG Guiming.
（Department of Laboratory Medicine， the First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006， China）

Objective To identify the hypermucoviscous （HM） phenotype， capsular serotypes， virulence genes and biofilm formation of Klebsiella pneumoniae strains isolated from blood samples. Methods Eighty-two K. pneumoniae strains were collected from blood samples. The HM phenotype of K. pneumoniae was determined by string test. All the isolates were assessed for six hypervirulent capsular serotypes and seven virulence genes by PCR. Bioflm formation was investigated by using microtiter dish bioflm formation assay. Virulence scores were compared between groups by rank-sum test， while the rates were compared betweengroups by Chi-square test or Fisher exact test. Results Out of the 82 K. pneumoniae strains， 31.7 % （26/82） were HM phenotype. The prevalence of hypervirulent capsular serotype was 92.3 % （24/26）. Overall， 24 （29.3 %） of the 82 strains were both HM phenotype and hypervirulent capsular serotype. The P50 of virulence scores （number of virulence genes） was 2. The prevalence of hypervirulent capsular serotype in HM and non-HM strains was 92.3 % （24/26） and 16.1 % （9/56）， respectively. The P50 of virulence scores was 5 and 1， respectively （bothP ＜ 0.05）. The P50 of virulence scores was 5.5 in hypervirulent capsular serotype strains. The virulence scores of serotype K1/K2/ K57 were signifcantly different from that of serotype K5/K20/K54 （P＜0.01）. In addition， bioflm formation was found in 50.0 % of HM strains and 73.2 % of non-HM strains （χ2=4.26， P＜0.05）. Bioflm formation was identifed in 60.6 % （20/33） of the hypervirulent capsular serotype strains. Serotype K54 of the hypervirulent capsular serotype strains was most potent in bioflm formation （6/8）. Conclusions Attention should be paid to the high prevalence of hypermucoviscous and hypervirulent K. pneumoniae phenotypes in the strains isolated from blood samples. Measures should be taken to control the spread of such strains.

Klebsiella pneumoniae； hypermucoviscous phenotype； capsular serotype； virulence； bioflm

R378.996

A

1009-7708（2016）04-0622-05

10.16718/j.1009-7708.2016.04.017

2015-10-08

2015-11-18

江西省教育厅青年基金项目（GJJ14178）；江西省卫生厅中医药科研项目（2013A035）；江西省卫生计生委科技计划项目（20155140）；江西省科技厅青年基金项目（20151BAB215028）。

南昌大学第一附属医院检验科，南昌 330006。

魏丹丹（1987—），女，硕士研究生，检验技师，主要从事微生物耐药及致病机制的研究。

刘洋，E-mail：836872018@qq.com。